HPLC_RI法快速准确测定大豆磷脂酰胆碱含量
HPLC-电雾式检测器（CAD）检测法测定脂质体中磷脂含量
HPLC-电雾式检测器（CAD）检测法测定脂质体中磷脂含量HPLC.电雾式检测器(CAD)检测法测定脂质体中磷脂含量姜庆伟,杨瑞,梅兴国(军事医学科学院毒物药物研究所,北京lOO85O)摘要:目的建立HPLC一电雾式检测器(ChargedAerosolDetection,CAD)检测脂质体磷脂含量及降解产物的方法.方法选用几种类脂材料制备成空白脂质体注射剂及冻干粉针剂,利用HPLC.CAD测定脂质体磷脂膜中各种类脂的含量,采用反相c色谱柱,流动相为甲醇一水,梯度洗脱,流速1mL?min～.结果4种类脂材料的平均回收率分别为99.2%,98.7%,99.5%,99.1%;RSD分别为1.1%,1.5%,0.8%,1.3%.结论实验充分证明了HPLC一电雾式检测器联合应用,可以快速,高效,准确地检测脂质体中的磷脂含量及杂质.关键词:脂质体;二棕榈酰磷脂酰胆碱;二硬脂酰磷脂酰甘油;单棕榈酰磷脂酰胆碱;二硬脂酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇;高效液相色谱法中图分类号:R944文献标识码:A文章编号:1001—2494(2007)23—1794—03 DeterminationofPhospholipidandItsDegradationProductsinLiposomesforInjectionbyH PLC-ChargedAerosolDetection(CAD)JIANGQing—wei,YANGRui,MEIXing—guo(InstituteofPharnm~ologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,8e~ng100850,China)ABSTRACT:OBJECTIVETodevelopaHPLC?CADmethodforthedeterminationofDSP E—PEG,phosphatidylcholine(DPPC),DSPG,lysophosphatidylcholine(MPPC)inphospholipidbilayerofblankliposomesforinje ction.METHODSAseparationwasper-formedonaCRcolumnwiththemobilephaseofme山anol—watergradientelutionattheflowrateof1mL?min～.RESULTSTheav. eragerecoveriesofDSPE—PEG,DSPG,MPPCandDPPCwere99.2%,98.7%,99,5%and99.1%andwithRSDsof1.1%, 1.5%,0.8%and1.3%respectively.CONCLUSIONHPLC—CAD,anewmethodforphospholipidsanalysis.provideshighsensitivityand reproducibility.KEYWORDS:liposome;DSPG;MPPC;DPPC;DSPE—PEG;HPLC电雾检测器(CAD)是一种独特的技术,HPLC洗脱液经雾化器中氮气的作用而雾化,其中较大的液滴在碰撞器的作用下经废液管流出,较小的溶质(分析物)液滴在室温下干燥,形成溶质颗粒.同时,用于载气的氮气分流形成的第二股氮气流经过电晕式装置(含高压铂金丝电极)形成带正电荷的氮气颗粒,与溶质颗粒反向相遇时经碰撞使溶质颗粒带上正电.为了消除由带有过多正电荷的氮气所引起的背景电流,在含溶质颗粒的气流流入静电检测计之前,通过一种称之为离子井的装置(带有低负电压)使迁移率较大的颗粒(即粒度较小的氮气颗粒)的电荷中和,而迁移率小的带电颗粒把它们的电荷转移给一个颗粒收集器,最后用一个高灵敏度的静电检测器测出带电溶质的信号电流.由此产生的信号电流与溶质(分析物质)的含量成正比.CAD可实际应用于任何非挥发或半挥发化合物,包括:药物化合物,脂类,碳水化合物,多肽,药物分子支架,类固醇,蛋白质,聚合物等.磷脂和胆固醇是脂质体主要成分,其稳定性直接影响脂质体药物的包封率和渗漏率及脂质体在体内的行为.磷脂酰胆碱可能水解产生有害杂质——溶血磷脂酰胆碱¨J,与动脉粥样硬化及血栓形成关系密切.目前,磷脂分析多采用HPLC—ELSD法,其特点是散射光的对数响应值与组分的质量的对数成线性关系,但此对数关系变异性较大,且其灵敏度较低,最低检测限在50～100ng之间.CAD检测器作为一种通用型检测器,在磷脂的分析检测方面显示出了非凡的能力,文献报道甘油三酯,胆固醇等类脂物质的最低检测限达到了1ng_9J.本实验建立了HPLC.CAD测定空白脂质体注射液及冻干粉针剂中DSPE.PEG,DSPG,MPPC,DPPC的含量,考察了不同放置条件下脂质体中磷脂的稳定性.作者简介:姜庆伟,男,硕士研究生通讯作者:梅兴国,男,教授,博士生导师Tel:(010)66932644E-mail:*****************ChinPharmJ,2007December,V o1.42No.23中国药学杂志2007年l2月第42卷第23期1材料与方法1.1材料与仪器2130型高效液相色谱仪(Hitachi公司),Corona电雾式检测器(美国ESA公司),超纯水机(LABCONCO),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC),二硬脂酰磷酯酰甘油(DSPG),单棕榈酰磷酯酰胆碱(MPPC),二硬脂酰磷脂酰乙醇胺.聚乙二醇(DSPE.PEG)对照品(Lipoid公司,纯度>99%),甲醇为色谱纯,三氯甲烷为分析纯,纯水(实验室自制).1.2色谱条件Corona参数:气体:241.3KPa氮气;Filter:Low;Range:200pA;HPLC参数:流动相A为水;流动相B为甲醇.梯度洗脱时问表:0.0min,10/90(%A/%B,以下同);2.5min,0/100;12.0min,0/100;15.0rain,10/90.流速1.0mL?min～,色谱柱Ve—nusilXBPC8(4.6mm×250mm,5m),柱温25℃,进样量10L.1.3溶液的配制1.3.1标准溶液的配制精密称取DSPE.PEG, DSPG,MPPC,DPPC各10mg,置于10mL量瓶中, 加入甲醇.三氯甲烷(1:2)溶液3mL溶解,并用甲醇稀释至刻度.分别精密量取0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.6mL的贮备液到1～6号10mL量瓶中,加入甲醇一三氯甲烷(8:2)稀释至刻度,混合均匀,依照浓度递增分别标定为1～6号标准溶液.1.3.2脂质体样品溶液配制分别取实验室自制的空白脂质体注射液及冻干复水空白脂质体(磷脂质量浓度约为25g?L)20L,加入到10mL量瓶中,加入3mL三氯甲烷.甲醇(2:1)的溶液溶解,并加入甲醇稀释至刻度,经0.45m的微孔滤膜过滤后,备用.1.3.3系统适应性溶液配制取空白脂质体样品经酸(1mol?LHC1),碱(1tool?LNaOH),氧(向溶液中通氧3h),热(100℃水浴,2h),强光照射(4500Lx,72h)破坏后,按"1.3.2"样品配置方法配制系统适用性溶液,备用.1.4系统适用性取初始流动相进样测定,观察基线状况.空白脂质体注射液中各辅料及酸,碱,氧化,高温,强光破坏试验中产生的杂质是否影响各磷脂成分的检测. 检查酸,氧化,高温,强光破坏试验中MPPC的含量是否增大.1.5精密度取同一批样品,按"1.3.4"方法制备样品溶液,中国药学杂志2007年12月第42卷第23期平行测定6次,计算平均含量和RSD值.1.6回收率分别精密称取处方量辅料和DSPE.PEG,DSPG,MPPC,DPPC对照品适量,按样品溶液制备方法用甲醇一三氯甲烷(8:2)配成体积分数80%,100%,120%的溶液各3份,进样测定,计算回收率及RSD值.1.7标准曲线的绘制取各标准液,每份样品进样3次,进样量10L,按峰面积一浓度绘制各组分标准曲线,并计算回归方程,及r值.1.8样品测定将空白脂质体注射液和冻干粉针剂,分别置25℃(相对湿度75%),4℃的条件下放样.分别于第0,30,60,90天取样,按样品溶液配制方法配制样品溶液,进样测定,以外标法计算含量.2结果2.1系统适用性系统适用性试验结果表明,空白脂质体注射液中各辅料和酸,碱,氧化,高温,强光破坏试验中产生的杂质均不影响DSPE—PEG,DSPG,MPPC,DPPC的检测.检查酸,氧化,高温,强光破坏试验中MPPC的含量增大.见图1.3367l00l331672O0图1系统适用性HPLC色谱图A一空白色谱图;B一经酸破坏后的色谱图;1一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇;2一二硬脂酰磷酯酰甘油;3一单棕榈酰磷酯酰胆碱;4一二棕榈酰磷脂酰胆碱,Fig1TypicalHPLCchromatogramofsystemsuitabilityA—blank;B—destroyedbyacid;1一DSPE—PEG;2一DSPG;3一MPPC;4一DPPC 2.2精密度DSPE.PEG,DSPG,MPPC,DPPC对磷脂的含量分别为3.35,3.31,3.20,12.56g?L～,RSD值分别为1.8%,2.1%,1.1%,1.5%(n=6).2.3回收率DSPE—PEG,DSPG,MPPC,DPPC的平均回收率分另U为99.2%,98.7%,99.5%,99.1%,RSD分别为1.1%,1.5%,0.8%,1.3%(n=3).Chin0J.2007December.V o1.42No.232.4标准曲线DSPE.PEG,DSPG,MPPC,DPPC4种磷脂的质量浓度与峰面积呈直线关系,且线性关系良好,回归方程分别为Y=34874x一1551O,r=0.9988;Y=33469x一26669,r=0.9983;y=40397x+16755,r=0.9991;y=46909x+23795,r=0.9995.2.5样品测定脂质体样品中的其他组分与磷脂能够有效分离,不影响磷脂的测定,其中2.70min的色谱峰为脂质体中加入冻干保护剂,在磷脂分析的过程中可以同时进行定量测定,见图2.样品测定结果见表1.由表1可见,25℃条件下放置的脂质体注射液中的MPPC含量均有不同程度的提高.实验结果表明,脂质体冻干粉针样品稳定性明显优于注射液.003367j00j33j67200t/min图2脂质体样品的HPLC色谱图1一加入冻干保护剂脂质体;2一药物Fig2HPLCChromatogramofliposomesample 1——liposomespikedwithfreeze-?dryprotectiveagent;2——drug 表1样品磷脂含量测定Tab1Phospholipidcontentsinliposomesample4讨论实验表明,CAD检测器作为一种新型通用检测器,其性能完全适用于磷脂分析.实验得到的磷脂标准曲线中,CAD检测器的响应值与组分的质量成直线关系,不同于ELSD检测器响应值与组分质量ChinPhamJ.2007December,V o1.42No.23的对数关系,更便于计算,且具有更高的灵敏度,更好的重现性.对于CAD检测器,流动相的pH值过高会造成基线飘移和噪音增大,实验中采用的流动相的pH值应小于8.5,可以采用适量的乙二胺和冰醋酸调节流动相的pH值.实验建立的反相HPLC—CAD测定磷脂的方法采用的甲醇.水溶剂系统具有溶剂系统简单,低毒的特点;使用c色谱柱具有适中的极性,满足高效分离,快速检测要求;CAD检测器操作简便,灵敏度高,重现性好.实验中需使用高纯氮气,并保持压力稳定,有利于基线的平稳.由于DSPE—PEG和DSPG两种磷脂的性质非常相近,且对流动相的水分含量敏感,因此在实验中应对甲醇中的水分含量进行严格的控制,保证磷脂的有效分离.色谱图中各浓度的DPPC峰均有不同程度的拖尾,主要是由于甲醇的洗脱能力较弱导致的.本实验建立的HPLC.CAD检测法完全满足磷脂的分析检测要求,为脂质体制剂的磷脂成分分析检测提供了一套完整的方法,成为脂质体制剂中磷脂的含量和降解产物检测的一种有效手段. REFERENCES[1]SAKAIM,MIYAZAKIA,HAKAMA TAH,eta1.Lysophosphati- dylcholineplaysanessentialroleinthemitogeniceffectofoxi- dizedlowdensitylipoproteinonmurineacrophages[J].,Biol Chem,1994,269(50):31430-31435.[2]GENGWF,NIUCQ,ZHANGT,eta1.Determinationofcompo—sitionofphospholipidbilayerindoxombicinhydrochloridelipo—BonesforinjectionbyHPLC?ELSD[J].Chin,om(中国医药工业杂志),2005,36(6):359-361.[3]IOFFEV,KALENDAREVT,RUBINSTEINI.eta1.Reverse phaseHPLCforpolarlipids.SimpleandselectiveHPLCproce? duresforanalysisofphospholipid-basedderivativesofvalpmic acidandV ariousnon?steroidalanti—inflammatorydrugs[J]., PfmmBiomedAnal,2002.30:391_4O3.[4]NORDBACKJ,LUNDBERGE,CHRISTIEW,eta1.Separation oflipidclassesfrommarineparticulatematerialbyHPLCona polyvinylalcohol?bondedstationaryphaseusingdual—channele. vaporativelight?scatteringdetection[J].MarChem,1998,60: 165.175.[5]ZHANGWN,HEHB,FENGYQ,eta1.Separationofphos. phatidylcholineandphosphatidylethanolaminebyusinghigh—per? formancedisplacementchromatography[J].,ChromatogrA, 2004,1036:145—154.[6]YOONTH,KIMIH.Phosphatidylcholineisolationfromeggyolk phospholipidsbyhigh—performanceliquidchromatography[J]., ChromatogrA,2002,949:209-216.[7]GRIZARDG,SIONB,BAUCHARTD,eta1.Separationandquan—tificationofcholesterolandmajorphospholipids,classesinhumanBoneRbyhigh?performanceliquidchromatographyandlight?scatter? ingdetection[J].,ChrormaogrB,2000,740:101.107.[8]OLIVIERM,OLIVIERR,DIDIERE,eta1.Directlipidquantita. tionofcationiclipoBomesbyreversed?phaseHPLCinlipoplexpmp~ationprocess[J].Eur,mBi~harm,2000,50:353—356.[9]MOREAURA.TheanalysisoflipidsviaHPLCwithaCharged AerosolDetector[J].却池,2006,41(7):727.(收稿日期:2006.12.11)中国药学杂志2007年12月第42卷第23期。
大豆磷脂油丙酮不溶物含量测定
实验项目
操作内容
注意事项
1
样品制备
选取有代表性的样品充分搅拌均匀,置于密闭容器中，阴凉处保存，备用。
采样时,明显颜色不同的磷脂油不要混匀后取样,应分开取样、测定。
2
平底烧瓶、滤纸烘干恒重
预先在105±2℃烘干150ml平底烧瓶和滤纸1h，放于干燥器中冷却至室温，称重，记录对应编号的平底烧瓶和滤纸重量。
8
计算
丙酮不溶物（%）=
m样瓶—烘干后平底烧瓶及不溶于丙酮的试样重g，
m空瓶—烘干的平底烧瓶重量g，
m样纸—烘干过滤后滤纸及不溶于丙酮的试样重g，
m纸—烘干的快速滤纸重量g
m样—样品的重量g。
重复性：每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，平行误差应在1%以内，否则应重做。
误差来源及分析
误差来源
控制方案
样品
抽样
取样要有代表性、真实性
制备
样品要有一定数量
充分混匀
试剂
试剂规格
按照标准要求选购试剂，控制杂质量。
保存
按照试剂的保存要求存放
注意试剂的保存期限
平底烧瓶、滤纸烘干恒重
烘干时间
无水平底烧瓶和滤纸应在105±2℃烘干1小时，以温度达到105±2℃时开始计时。
称样
称样量
称样量要适宜，一般3～５ｇ。
三、实验用品
1．实验用试剂
试剂名称
规格/浓度
配制方法
备注
乙醚
AR
不需配制直接使用
丙酮
AR
不需配制直接使用
2．实验用设备
仪器设备名称
规格
参考厂家
分析天平
感量0.0001g
电热恒温烘箱
磷脂的定量测定方法
& ’ !
由不同 4 5 K 中间精密度测定 取同一批样 品 =份 $ 实验者在 不 同 仪 器 及 不 同 时 间 $ 按E 含量测定F 项下 测定卵磷脂的含量 $ 结果 1 见表 ! 2 %
B 小结 若加入氧化锌大于 ’ 则& B 5 O 供试液制备中 $ $ ) N灰 化水完全 $ 造成含量偏低 $ 并且灰化后加 & 盐酸 $ "# 残渣无法完全溶解 $ 出现絮状物 % 若氧化锌小于 ’ $ ) 则 不 能 将 样 品 完 全 覆 盖$ 灼 烧 时 易 将 样 品 溅 出% 所 以$ 综合各项因素 $ 确定 ’ )氧化锌为适宜加入量 %
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卵 磷 脂 能 改 进 神 经 功 能 障 碍 及 紊 乱! 恢复脑功 能! 增 强 记 忆 力 及 抗 衰 老! 使 血 红 蛋 白 明 显 提 高! 能 肌 肉 收 缩! 加 速 表 皮 愈 合! 增强胰岛 增 强 纤 毛 运 动! 素’ 骨细胞功能等 " 对于卵磷脂的研 究 ! 目 前 多数 采 磷脂酰乙 用 9= ) >法 分 离 卵 磷 脂 中 的 磷 脂 酰 胆 碱 ’ 醇 胺’ 溶 血 磷 脂 酰 胆 碱’ 磷 脂 酰 肌 醇 和 磷 脂 酸! 并对 其 中 磷脂酰胆碱 进行定量
关键词 @ 分光光度法 > 卵磷脂 > 含量测定 > 卵磷脂注射液
中图分类号 @ / & 4 1 & 文献标识码 @ . 3 3 C B $ 4 C 0 # & 3 3 . % 3 2 B 3 3 $ 0 B 3 $ D G 文章编号 @
大豆磷脂中PC、PE、PI测定方法的研究
大豆磷脂中PC、PE、PI测定方法的研究王瑛瑶【摘要】为准确快速地对大豆磷脂中的主要成分磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)进行定量分析,对分析柱、流动相、检测波长进行了选择与优化,最终建立了以Lichrosorb Si60为分析柱,205 nm波长下,以V(正己烷)∶V(异丙醇)∶V(1%乙酸)=8∶8∶1为流动相的高效液相色谱测定法.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2008(033)002【总页数】3页(P73-75)【关键词】大豆磷脂;磷脂酰胆碱;磷脂酰乙醇胺;磷脂酰肌醇;高效液相色谱【作者】王瑛瑶【作者单位】国家粮食局,科学研究院,北京,100037【正文语种】中文【中图分类】工业技术2008年第 33 卷第 2 期中国油脂CHINA OILSANDF'ATS73检化验大豆磷脂中 PC 、 PE 、 PI 测定方法的研究王瑛瑶（国家粮食局科学研究院，北京 100037 ）摘要：为准确快速地对大豆磷脂中的主要成分磷脂酰胆碱( PC)、磷脂酰乙醇胺 (PE) 、磷脂酰肌醇 ( Pl) 进行定量分析，对分析柱、流动相、检测波长进行了选择与优化，最终建立了以 LichrosorbSi - 60为分析柱，205nm 波长下，以矿（正己烷）：y （异丙醇）：y （ 1% 乙酸） =8 ：8 ：1 为流动相的高效液相色谱测定法．，关键词：大豆磷脂；磷脂酰胆碱；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰肌醇；高效液相色谱中图分类号： TQ646文献标志码：A文章编号：1003-7969(2008)02-0073-03 QuantitativedeterminationofPC,PEandPI insoybean phospholipids WANG YingyaoAc'ademyof'StateAdministrationof'Grain,P.R.C.,Beijing100037,China) Abstract:Thc analysis column.the nu,l)ilc-phaseandtheUVdetector wavelengthwerechosedamlopti- mized inorcler toquicklyancl quancitativelydeterminethemaincompositionsof phosphatidylcholine PC),phosphaticlylethanclamine(PF.) andphosphatidylinositol(P[) in soybeanphospholipids.Asuc- cletisf'ul highperformanceliquj( 】 c-hnwalography(HPLC)methoclwasdevelopedbyu singthefollowing‘ )pPratin gc-onditions: Lichrosorl) Si -60(1(’ JuⅢn,mobile phaseV(hcxane):V (isopropanol):V(1a/oacetic: ac-icls()Iutic,n)=8:8: I,UVclrtec-tior]wavfllength205nm. Keywords:soyl)eanphosphc)li[)icIH;I)hospliacidylcholine ; phosphatidylethandamine; phosphatidylinositc)l; HPl.C.磷脂是生命的基础物质，是人体正常代谢与健康生存不可缺少的物质，已被广泛应用于食品、药品、化妆品、化学工业等领域。
磷脂检验标准操作规程
文件制修订记录1.0目的制定磷脂的检验操作规程，确保生产质量。
2.0适用范围本规程适用于磷脂的质量评价与质量控制。
3.0职责质量管理部负责本规程的实施。
4.0正文4.1 外观取适量试样，置于清洁、透明的玻璃器皿中，在自然光线下，目视观察其色泽和状态，嗅其气味。
4.2含量测定4.2.1试剂4.2.1.1 正己烷：色谱纯。
4.2.1.2 异丙醇：色谱纯。
4.2.1.3 水：色谱纯。
4.2.1.4 冰醋酸：色谱纯。
4.2.1.5 1％冰醋酸溶液：1ml冰醋酸用色谱纯水定容到100ml。
4.2.1.6 磷脂酰胆碱：标准物质，纯度≥99％。
4.2.1.7 流动相：V(正己烷)+V(异丙烷)+V(1％冰醋酸溶液)=8+8+1。
4.2.2仪器与设备4.2.2.1 分析天平：精度为0.0001g。
4.2.2.2 刻度吸管：0.5ml，1ml，5ml。
4.2.2.3 容量瓶：5ml，10ml，100ml。
4.2.2.4量筒：100ml，500ml，1000ml。
4.2.2.5 液相色谱仪。
4.2.2.6 液相色谱柱：Si-60柱子，填料粒度为5um。
长度250mm，内径4.6mm。
4.2.3分析步骤4.2.3.1 标准溶液的配制精确称取约20mg磷脂酰胆碱，用V(正己烷)+V(异丙醇)+V(1％冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶剂溶解并定容到10ml ，配制磷脂酰胆碱标准溶液，使溶液中磷脂酰胆碱为2mg/ml 。
准确吸取此溶液0.25ml 、1.25ml 、2.50ml 、3.75ml 、5.00ml ，并用V(正己烷)+V(异丙烷)+V(1％冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶剂定容到5ml ，使溶液中磷脂酰胆碱的最终浓度为0.1mg/ml~2.0mg/ml 。
低于﹣16℃保存备用，保存时注意容器口的密封。
4.2.3.2 标准工作曲线的制作分别取不同浓度的磷脂酰胆碱标准溶液10uL 注入液相色谱中。
以样品组分浓度为横坐标，组分峰面积为纵坐标，绘制磷脂酰胆碱的标准工作曲线。
饲料级大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的检测研究
饲料级大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的检测研究杨海锋;赵志辉;顾赛红;邢增涛【摘要】本研究探讨了应用高效液相色谱法同时检测饲料添加剂大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的可行性.结果表明:应用液相色谱法检测三种主成分含量方法的相对标准偏差均小于4%.回收率均为96%～103%.该方法应用于测定饲料级大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量可行.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2010(000)006【总页数】3页(P41-43)【关键词】大豆磷脂;磷脂酰胆碱;磷脂酰乙醇胺;磷脂酰肌醇;高效液相色谱法【作者】杨海锋;赵志辉;顾赛红;邢增涛【作者单位】上海市农科院农产品质量标准与检测技术研究所;上海市农科院农产品质量标准与检测技术研究所;上海市农科院农产品质量标准与检测技术研究所;上海市农科院农产品质量标准与检测技术研究所【正文语种】中文【中图分类】S816.17磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇是大豆磷脂中最重要的活性成分，其所占比重的高低，是衡量大豆磷脂品质优劣的一个重要标准（章慧芳和陆娅，2007）。
随着大豆磷脂市场需求的不断扩大，经常发生大豆磷脂产品的贸易纠纷。
广大生产企业和用户都希望对大豆磷脂中的有效成分磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇进行检验和检测。
国内外研究报道的大豆磷脂的检测方法主要是定磷法、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）等（张颖颖等，2006；卜延刚等，2004）。
定磷法需要消化、显色等过程，操作繁琐、耗时。
薄层色谱法干扰因素多，灵敏度不高，显色后定量误差较大而主要用于定性分析。
高效色相色谱法以其高速、高效、高灵敏度、系统封闭避免不饱和键氧化等优点，受到普遍关注（董晓渭等，2000；Mounts和Nash，1990）。
然而由于研究者应用的前处理技术、检测方法都不相同（张德权等，2006；Rombaut等，2005；Singleton 和Stikeleather，1995；Becart等，1990），即使都使用HPLC技术，但分离柱、填料、流动相也存在差异，缺乏一个统一的标准。
饲料级大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的检测研究
饲料级大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的
检测研究
杨海锋;赵志辉;顾赛红;邢增涛
【期刊名称】《中国饲料》
【年(卷),期】2010(000)006
【摘要】本研究探讨了应用高效液相色谱法同时检测饲料添加剂大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的可行性.结果表明:应用液相色谱法检测三种主成分含量方法的相对标准偏差均小于4%.回收率均为96%～103%.该方法应用于测定饲料级大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量可行.【总页数】3页(P41-43)
【作者】杨海锋;赵志辉;顾赛红;邢增涛
【作者单位】上海市农科院农产品质量标准与检测技术研究所;上海市农科院农产品质量标准与检测技术研究所;上海市农科院农产品质量标准与检测技术研究所;上海市农科院农产品质量标准与检测技术研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S816.17
【相关文献】
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2.低碳醇对大豆磷脂中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的选择性研究 [J], 曹栋;裘爱泳;
王兴国;蒋大勇
3.气相色谱法测定大豆磷脂中磷脂酰肌醇 [J], 高树刚;申书昌;王文波;陈志强;安红
4.丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的测定方法验证 [J], 丁丽燕; 郑娟; 朱晓晓
5.丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的含量测定[J], 梁亚龙; 陈艳明; 倪成良; 王东凯
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大豆磷脂中卵磷脂检测方法的研究
大豆磷脂中卵磷脂检测方法研究嘿，朋友们！今天咱来唠唠大豆磷脂中卵磷脂检测方法这个事儿。
这可不像听起来那么枯燥哦，说不定这里面的门道还能让你眼前一亮呢！大豆磷脂啊，那可是个好东西。
在好多领域都有它的身影，而卵磷脂又是大豆磷脂里的重要成分。
那怎么准确地检测出卵磷脂的含量呢？这就需要一些靠谱的方法啦。
先说这薄层色谱法吧。
它就像是一个小小的侦探，能把卵磷脂从大豆磷脂这个“大家庭”里给揪出来。
把样品点在薄板上，然后让溶剂带着各种成分跑起来。
嘿，不同的成分跑的速度可不一样哦，卵磷脂就会在特定的位置留下它的“脚印”。
再通过和标准品对比，就能大概知道卵磷脂的含量啦。
不过呢，这个方法虽然简单直观，但是精度有时候就像个调皮的小孩，不是特别高。
气相色谱法那可就有点高大上啦。
它就像一个超级精密的扫描仪，能把样品里的各种成分分得清清楚楚。
把样品气化后，让它们在柱子里跑，不同的成分在柱子里的停留时间不一样，卵磷脂也会在特定的时间跑出来被检测到。
这个方法的精度那是相当高的，就像给卵磷脂来了个高清“特写”，能把它的含量测个明明白白。
但是呢，它也有个小缺点，就是前期的处理比较麻烦，就好像给它准备一场“华丽登场”，得费不少功夫准备道具似的。
还有那高效液相色谱法，这可是个厉害的角色。
它就像一个高效的分拣员，能快速准确地把卵磷脂和其他成分分开。
样品被注入到流动相里，在柱子里流动，通过和固定相的相互作用，卵磷脂就会在合适的时间被检测出来。
这个方法不仅精度高，而且速度快，就像开了加速挂一样，能很快给出结果。
不过呢，仪器比较贵，维护起来也有点麻烦，就像养个娇贵的宝贝一样，得精心伺候着。
除了这些，还有一些其他的方法呢。
比如说光谱法，它就像是给卵磷脂拍照片，通过分析它对不同波长光的吸收情况来确定含量。
这方法简单快速，就像随手拍个照那么容易。
但有时候也会受到其他成分的干扰，就像拍照的时候旁边突然冒出来个捣乱的家伙，影响了效果。
在实际检测的时候啊，咱得根据具体情况来选择合适的方法。
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按 AOCS Ja7 - 86 进行 [ 2 ]。 硅胶板尺寸为 200 ×200 mm(青岛海洋化工厂) 。 展开剂 A 为氯仿 甲醇 - 氨水 (7 mol ·L - 1) (体积比 65 ∶30 ∶4) , 展开剂 B 为氯仿 - 甲醇 - 冰醋酸 - 水 (体积比 170 ∶ 25 ∶25 ∶6) 。 样品展开后将 PC 对应的斑点刮下 , 用高氯酸和硝酸消化 , 钼酸铵显色 , 乙酸丁酯萃 取 。 采用分光光度计在 310 nm 下测定吸光度 , 得到磷含量 。 以磷酸二氢钾为标样 , 得到吸光度对 磷含量的标准曲线 。 最后根据以大豆 PC 平均相对分子质量为基础得到的磷脂转化因子 , 将磷含量 换算成样品中 PC 的含量 。 重复测定 2 次 , 取平均值 。
Soybean PC standard
sPC - Std - 1 sPC - Std - 2 sPC - Std - 3 sPC - Std - 4 sPC - Std - 5
Table 1
表 1 PC 标准溶液浓度 Concentrations of phosphatidylcholine ( PC) standard solutions
1. 4 HPLC 分析
紫外检测器和示差折光检测器串联 , 自动进样 , 每次进样量 10μL 。 每个样品分析 2 次 , 得到的 峰面积取平均值 。 根据标准溶液 PC 浓度和色谱峰面积可得大豆 PC 标样和蛋黄 PC 标样在 UV 及 RI 检测器下的标准曲线 , 然后由实际样品的 PC 峰面积和各标准曲线可得大豆卵磷脂样品在 UV 检测器 和 RI 检测器及不同标样下的 PC 含量 。
卵磷脂分析方法很多 , 传统的薄层色谱测磷 ( TLC - P) 法是广泛被接受的定量分析方法 。 被美国 油脂化学协会 (AOCS) 收录为标准方法的二维 TLC - P 法是一种更准确的定量分析磷脂的方法 [ 2 ]。 这 种方法是在分离后收集各种磷脂 , 测定磷含量 , 再按照各类磷脂的平均相对分子质量计算出它们的 含量 。 但是这种方法步骤较烦琐 , 对操作技术要求较高 。 另外 , 如果有很多样品 , 定量分析需要很
(浙江大学 二次资源化工国家专业实验室 , 浙江 杭州 310027)
摘 要 : 用 HPLC - RI法和 HPLC - UV 法对大豆卵磷脂样品中的磷脂酰胆碱含量进行分析 , 并与二维 TLC - P 法 (AOCSJa7 - 86) 作比较。 以 Waters Spherisorb S5W(5μm Silica) 4. 6 ×250 mm 硅胶柱为固定相 , 正己烷 - 异丙醇 水 (体积比 1 ∶4 ∶1) 为流动相 。 色谱条件 : 流速 0. 8 mL ·min - 1 , 进样量 10μL , 柱温 35 ℃, RI 检测器温度 35 ℃。 由外标法得出其中磷脂酰胆碱的含量 , 分别采用大豆磷脂酰胆碱标样和蛋黄磷脂酰胆碱标样作为外标物 。 结果表明 HPLC - RI法受标样来源影响小 , 分析结果准确 , 分析过程简便、快速 , 适合作为常规分析方法。 关键词 : 磷脂酰胆碱 ; 高效液相色谱 ; 示差折光检测 ; 紫外检测 中图分类号 : O657. 72 ; O629. 9 文献标识码 : A 文章编号 : 1004 - 4957(2004) 05 - 0118 - 04
1. 2 色谱条件
色谱柱 : Waters Spherisorb S5W(5μm Silica) 4. 6 ×250 mm 硅胶柱 ; 流动相 : 正己烷 - 异丙醇 - 水 (体积比 1 ∶4 ∶1) ; 进样量 : 10μL ; 流速 : 0. 8 mL ·min - 1; 柱温 : 35 ℃; 示差折光检测器温度 : 35 ℃; 紫外检测波长 : 204 nm。
磷脂酰胆碱具有亲水和疏水双重性 , 是一类天然的表面活性剂 , 具有重要的生理功能和乳化性 能 , 在食品 、保健品和医药等行业中有重要的用途 。 准确分析卵磷脂样品中 PC 的含量是一个关键 问题 。 但是 , 由于磷脂酰胆碱实际上是混合物 , 而不是化合物 , 其组成随原料油脂中的脂肪酸组成 而变化 , 给准确分析带来了很大困难 。
Determination of Soybean Phosphatidylcholine by HPLC - RI
YANG Yi- wen , LI Yan , WU Cai- juan , REN Qi- long , WU Ping- dong
(National Laboratory of Secondary Resources Chemical Engineering , Zhejiang University , Hangzhou 310027 , China)
Abstract : The quantitative determination of soybean phosphatidylcholine in soybean lecithin samples was conducted by using the HPLC - UV and HPLC - RI ( Refractive Index) methods. The results were com2 pared with the recommended AOCS Ja7 - 86 method (a two dimensional TLC - P method) . A Waters Spherisorb S5W column( 4. 6 ×250 mm packed with 5μm Silica) and an isocratic mobile phase consist2 ing of n- hexane ∶2-propanol ∶water ( 1 ∶4 ∶1 by volume) were employed. The HPLC conditions were : flowing rate 0. 8 mL/ min , injection aliquot 10μL , column temperature 35 ℃, and the temperature of the RI detector ( differential refractive index detector) 35 ℃. The content of soybean phosphatidylcholine in lecithin samples was determined by the external standard method , using soybean phosphatidylcholine and egg yolk phosphatidylcholine as external standards. The results showed that the proposed HPLC - RI method was scarcely affected by the source of phosphatidylcholine standards , and hence the method is reli2 able. The HPLC - RI method is also simple and quick. Therefore , it can be used as a routine analytical method for the determination of soybean phosphatidylcholine. Key words : Phosphatidylcholine ; HPLC ; RI; UV
卵磷脂从广义上讲是指包含磷脂酰胆碱 (phosphatidylcholine , 简称 PC) 、磷脂酰乙醇胺 (phosphotidylethanolamine , 简 称 PE) 、肌 醇 磷 脂 (phosphatidylinositol , 简 称 PI) 和 溶 血 磷 脂 酰 胆 碱 (lysophosphatidylcholine , 简称 LPC) 等在内的丙酮不溶磷脂 , 而狭义的卵磷脂就是指磷脂酰胆碱 PC , 是 由甘油 、胆碱 、磷酸 、脂肪酸组成的一类含磷脂类物质 [ 1 ]。
Concentration ρ/ ( mg ·mL - 1)
6. 530 5. 224 3. 265 1. 306 0. 653
Egg yolk PC standard
ePC - Std - 1 ePC - Std - 2 ePC - Std - 3 ePC - Std - 4 ePC - Std - 5
1. 3 标准及样品溶液的制备
标准溶液 : 精确称取 0. 338 5 g 大豆 PC 标样和 0. 345 2 g 蛋黄 PC 标样分别溶于 50 mL 流动相中 , 用移液管分别移取 8、5、2、1 mL 上述 PC 标准溶液 , 用流动相稀释至 10 mL , 配成一系列的大豆 PC 标准溶液和蛋黄 PC 标准溶液 , 浓度见表 1。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
Waters 高效液相色谱仪 (包括 510 高压泵 , 717 自动进样器 , 410 示差折光检测器 , 996 二极管阵 列检测器) ; 卡尔 ·费休水分测定仪 。
大豆 PC 标样 (德国 Lipoid 公司产品 , PC 含量为 98. 1 % (以干基计) , 水含量为 1. 68 %) ; 蛋黄 PC 标样 (德国 Lipoid 公司产品 , PC 含量为 98. 0 % (以干基计) , 水含量为 5. 65 %) ; 大豆 PC 样品 (实验室 自制) ; 正己烷 (色谱纯) ; 异丙醇 (色谱纯) ; 超纯水 。
2 结果与讨论
2. 1 紫外光谱
由 996 二极管阵列检测器可以直接得到样品的紫外光谱图 , 为选择检测波长提供依据 。 实验发
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分析测试学报
第 23 卷
现 sPC 标样的最大吸收波长与标样浓度有关 。 随着浓度的降低 , 最大吸收波长由 205. 2 nm(6. 530