产薯蓣皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定
滇重楼内生菌分离及其发酵液抑菌活性
施蕊，王娟，叶敏，等.滇重楼内生菌分离及其发酵液抑菌活性[J].江苏农业科学,2017,45(6) =86 -88.doi： 10.15889/j. issn. 1002 - 1302.2017. 06. 021滇重楼内生菌分离及其发酵液抑菌活性施蕊\王娟\叶敏\赵能\夏箐\李彪M(1.西南林业大学林学院/云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南昆明650224;2. 云南省林业科学院/云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南昆明650201;3. 云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南昆明650201;4.云南宏绿辣素有限公司，云阳昆明650503)摘要:为研究滇重楼内生真菌的抑菌活性，先从滇重楼块茎中分离得到98株内生真菌，对峙试验结果表明，其中 有8株内生真菌对供试植物病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有一定的抑制作用；内生真菌发酵液初提 物抑菌试验结果表明,3株内生真菌发酵液的提取物对供试植物病原菌有一定的抑制作用,分别为PPC -25、PPC -43、P P C-78,其他菌株的发酵液提取物对供试植物病原菌没有抑菌活性。
关键词:滇重楼内生菌;分离;发酵液提取物;抑菌活性中图分类号：S482.2 +92 文献标志码：A文章编号：1002 - 1302 (2017)06 -0086 -02—86 — 江苏农业科学2017年第45卷第6期H fi ®[Paris polyphylla Smith var.yunnansensis (Fmnch. )Hand]分布于云南省、贵州省和四川省，生长在海拔1 400 ~ 3 100 m的常绿阔叶林、云南松林、竹林、灌丛或草 坡内。
滇重楼根茎人药，有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于疔肿痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等症状[1]。
另外，滇重楼的次生代谢产物留体皂苷有止血、祛痰、抑菌、镇静镇痛、抗早孕杀精子、抗细胞毒素等作用，临床上用于治疗功能性子宫出血、神经性皮炎、外科炎症以及肿瘤等，具有显著的疗效[2_6]。
土壤样品淀粉酶产淀粉酶的筛选与鉴定
土壤样品淀粉酶产淀粉酶的筛选与鉴定
土壤中的淀粉酶主要是由微生物产生的，筛选和鉴定方法如下：
1. 筛选淀粉酶高产微生物。
首先需要从土壤中分离出微生物，然后通过对微生物的单菌培养和筛选，从中选出淀粉酶高产菌株。
2. 鉴定淀粉酶高产微生物。
对于筛选出来的淀粉酶高产菌株，需要通过生理学和生化特征进行鉴定，确定其种属和鉴定相关酶的产生情况。
3. 确定淀粉酶活性。
通过对筛选出来的淀粉酶高产菌株进行淀粉酶活性测试，确定其淀粉酶的活性水平。
4. 优化淀粉酶产酶条件。
针对筛选出来的淀粉酶高产菌株，需要进行酶产条件的优化，包括酸碱度、温度、培养基成分、培养时间等方面。
5. 应用淀粉酶。
将优化后的淀粉酶高产菌株应用于实际生产中，如工业制造、生物学研究等领域。
马铃薯块茎病原真菌拮抗菌株筛选及优良拮抗菌株鉴定
收稿日期：2019-01-09
修订日期：2019-02- 27
通信作者 基金项目：国家马铃薯产业技术体系(CARS10-P18)
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病害进行生物防治已成为目前研究的热点之一%如 杨成德等）!*从醉马草中分离出6株对马铃薯炭疽病 菌和马铃薯坏疽病菌有拮抗作用的内生细菌%且同
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植物根际促生菌的筛选及鉴定
植物根际促生菌的筛选及鉴定植物根际促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，简称PGPR）在农业生物技术领域具有重要意义。
这些微生物在与植物根系的相互作用下，能够促进植物的生长和健康。
为了更好地利用这些有益的细菌，我们需要对它们进行筛选和鉴定。
植物根际促生菌的筛选筛选植物根际促生菌，一般需要以下步骤：采集根际土壤：从健康的植物根系周围采集土壤样品，这是PGPR的丰富来源。
富集培养：将采集的土壤样品进行处理，然后将其接种到特殊培养基上进行富集培养，以增加目标微生物的数量。
初筛：将富集培养后的菌液进行平板划线分离，得到单菌落。
根据菌落的形态、大小、颜色等特征进行初步筛选。
复筛：对初筛得到的菌株进行进一步鉴定和筛选。
这包括对菌株的生长情况、产抗生素能力、铁载体活性、解磷能力、诱导植物抗性等方面的测定。
分子鉴定：通过基因测序技术，对筛选得到的菌株进行分子水平上的鉴定。
根据16S rRNA基因序列的相似性，确定菌株的分类学地位。
植物根际促生菌的鉴定植物根际促生菌的鉴定一般包括以下步骤：形态观察：观察菌落的形状、大小、颜色、质地等特征，初步判断菌株的种类。
生理生化试验：对筛选到的菌株进行生理生化试验，如氧化酶、过氧化氢酶、糖醇发酵等，以确定菌株的生理生化特性。
抗生素产生试验：通过抗生素产生试验，可以初步判断菌株是否具有抗菌活性。
铁载体活性测定：通过测定菌株的铁载体活性，可以确定菌株在植物根际中的定殖能力。
解磷能力测定：测定菌株的解磷能力，可以评估它们在促进植物吸收土壤磷素方面的作用。
诱导植物抗性试验：通过测定菌株诱导植物抗病性能力，可以评估它们在提高植物抗病性方面的作用。
分子鉴定：采用基因测序技术，对筛选得到的菌株进行分子水平的鉴定。
通过对16S rRNA基因序列进行分析，可以确定菌株的分类学地位。
植物根际促生菌的筛选和鉴定是开发利用这些有益微生物的关键步骤。
通过形态观察、生理生化试验和分子鉴定等方法，我们可以准确地确定这些微生物的种类和特性，为将来的应用提供科学依据。
《内生细菌HBR11019和HBR31044对人工种植重楼的促生作用及其生理机制》
《内生细菌HBR11019和HBR31044对人工种植重楼的促生作用及其生理机制》一、引言重楼是一种具有重要药用价值的植物，近年来在人工种植中得到了广泛的应用。
然而，重楼的生长和产量受到多种因素的影响，其中内生细菌的作用日益受到关注。
内生细菌作为植物生长的潜在促进者，通过与宿主植物建立共生关系，能够提高植物的抗逆性、营养吸收和生长速度。
本文旨在研究内生细菌HBR11019和HBR31044对人工种植重楼的促生作用及其生理机制。
二、材料与方法2.1 实验材料本实验选用的内生细菌为HBR11019和HBR31044，宿主植物为重楼。
实验所用重楼种子购自正规种植基地，经过消毒处理后进行人工种植。
2.2 实验方法（1）菌株培养与纯化：将HBR11019和HBR31044分别进行培养与纯化，以保证实验菌株的纯度和活性。
（2）菌液制备：将纯化后的菌株接种于液体培养基中，培养至对数生长期，制备菌液。
（3）重楼种植与处理：将重楼种子分别进行常规种植与菌液处理种植，设置对照组与实验组，每组种植相同数量的重楼种子。
（4）生长指标测定：定期测量重楼的生长指标，包括株高、叶片数、生物量等。
（5）生理指标测定：测定重楼叶片中的叶绿素含量、酶活性等生理指标。
（6）数据分析：对实验数据进行统计分析，比较不同处理组之间的差异。
三、实验结果3.1 促生作用实验结果表明，内生细菌HBR11019和HBR31044对人工种植重楼的促生作用显著。
经过菌液处理的重楼，其株高、叶片数、生物量等生长指标均高于对照组。
其中，HBR11019的促生效果更为明显。
3.2 生理机制通过测定重楼叶片中的叶绿素含量、酶活性等生理指标，发现内生细菌HBR11019和HBR31044能够提高重楼的叶绿素含量和光合作用酶活性，促进光合作用的进行。
此外，内生细菌还能够提高重楼的抗逆性，减少病害发生，从而促进重楼的生长。
四、讨论内生细菌HBR11019和HBR31044对人工种植重楼的促生作用及其生理机制的研究表明，内生细菌在植物生长过程中发挥着重要作用。
重楼中薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元的HPLC-APCI／MS分析
重楼中薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元的HPLC-APCI／MS分析孙衍国;徐青;肖红斌;梁鑫淼
【期刊名称】《现代中药研究与实践》
【年(卷),期】2004(018)B12
【摘要】目的分析并区分重楼中薯蓣皂苷元类化合物与偏诺皂苷元类化合物。
方法利用高效液相色谱／大气压化学电离质谱联用技术，在正离子模式下，利用多离子监测法对重楼进行特征离子的同时监测。
结果有效地将重楼中的薯蓣皂苷元类化合物与偏诺皂苷元类化合物区分开来。
结论建立了一种简单、快速、准确的用于区分不同苷元类型的皂苷类化合物的联用方法。
【总页数】3页(P89-91)
【作者】孙衍国;徐青;肖红斌;梁鑫淼
【作者单位】中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连116011
【正文语种】中文
【中图分类】R284
【相关文献】
1.重楼中薯蓣皂苷元的分离提取及含量检测 [J], 张佩;李佐;于菲;周长征
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3.三峡库区栽培重楼属药用植物中薯蓣皂苷元含量测定 [J], 张静;丁博;祁俊生;陈秀红;周浓
4.28种AM真菌对滇重楼中薯蓣皂苷元含量的影响 [J], 王骞;张辉菊;杨敏;张华;周
浓;李杨
5.28种AM真菌对滇重楼中薯蓣皂苷元含量的影响 [J], 王骞;张辉菊;杨敏;张华;周浓;李杨;;;;;;;;;
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重楼中甾体皂苷的分离与结构鉴定
重楼中甾体皂苷的分离与结构鉴定康利平;马百平;张洁;熊呈琦;谭大维;从玉文【期刊名称】《中国药物化学杂志》【年(卷),期】2005(015)001【摘要】目的分离、鉴定云南重楼Paris polyphylla Smithvar.yunnanensis(Franch)Hand Mazz根茎中的甾体皂苷类化合物.方法采用乙醇提取、水饱和正丁醇萃取、硅胶柱色谱及高效液相色谱等方法进行分离,得到5个化合物,通过FAB-MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、13C-1H COSY、HMBC、NOESY和TOCSY鉴定其化学结构.结果分离鉴定了5种甾体皂苷:薯蓣皂苷元-3-O-{α-L-鼠李吡喃糖基(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖基(1→4)-[α-L-鼠李吡喃糖基(1→2)]}-β-D-葡萄吡喃糖苷(皂苷Pb,Ⅰ)、纤细薯蓣皂苷(Ⅱ)、皂苷Pa(Ⅲ)、薯蓣次苷A(Ⅳ)、pennogenin diglycoside(Ⅴ).结论化合物Ⅰ～Ⅴ均为已知甾体皂苷,纠正了已有文献中皂苷Pb(Ⅰ)核磁数据中的错误,提供了完整的NMR数据.【总页数】6页(P25-30)【作者】康利平;马百平;张洁;熊呈琦;谭大维;从玉文【作者单位】军事医学科学院,放射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,放射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,放射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,放射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,放射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院,放射医学研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】R284;R914【相关文献】1.黄精中甾体皂苷的分离与结构鉴定 [J], 唐翩翩;徐德平2.盾叶薯蓣中甾体皂苷的分离与结构鉴定 [J], 金明;仙靓;孙丽娜;石硕;张卉;张新新;郭增军3.响应面法优化重楼药材中甾体皂苷的回流提取工艺研究 [J], 王仕宝;苏莹;李会宁;杨培君;吴鹏4.泡沫分离法分离重楼中重楼皂苷的工艺研究 [J], 兰洁;李锐;韩丽;杨明;王瑾5.狭叶重楼的主要甾体皂苷类化学成分的分离及鉴定 [J], 尹鸿翔;薛丹;白楠;陈雏;陈阳;张浩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
中药重楼的资源开发与应用
中药重楼的资源开发与应用姓名：汪岩学号：S2010210 专业：中药学[摘要]：重楼作为一种传统中药，在临床应用已久，文章从其生药鉴定、临床应用、药用资源评价、合理利用等方面来阐述近年重楼的研究成果。
[关键词]：重楼；鉴定；应用。
中药重楼(Rhizoma Paridis)为百合科重楼属植物的干燥根茎，味苦，微寒，有小毒。
归心、肺、肝经。
具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊等功效。
用于痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症[1]。
据调查该属绝大部分植物的根茎均供药用[2]。
重楼以蚤休之名首载于《神农本草经》。
全世界该属植物约有24种和若干变异种，分布于欧亚大陆的热带至温带地区[3,4]，我国正处于该植物的分布中心之一，所以我国重楼种类繁多，居世界之首，拥有19种，其中在我国西南地区种类资源非常丰富[5]。
常见的品种有华重楼、滇重楼和七叶一支花。
药用的有华重楼、云南重楼、七叶一支花、狭叶重楼、长药隔重楼、海南重楼、凌云重楼、南重楼[6]。
其中华重楼和滇重楼已被《中华人民共和国药典（2005年版）》[7] 收录。
由于药用价值突出，植化、药理与组培等领域成为近年来的研究重点[8-10]，随着研究的深入，重楼的药用价值被日益重视。
现将重楼的各方面研究进展做下列综述。
一、生药鉴定1.正品关于重楼，有歌曰：重楼七叶一枝花，根茎结节半圆疤，断面白色粉性足，解毒定惊消咳佳。
性状：本品为结节状扁圆柱形，略弯曲，长5～12 cm，直径1～4．5cm，表面黄棕色或灰棕色，外皮脱落后显白色，密具层状凸起的粗环纹，一面结节明显，结节上具椭圆形的凹陷茎痕，顶端具鳞叶及茎的残基，质坚实，断面平坦，白色及浅棕色，粉性或角质，无臭，味微苦、麻。
秋季采挖，除去非药用部分，洗净晒干，以粗壮、质坚实、断面白色、粉性足者为佳[11]。
2.混淆品重楼属植物极多，除了药典收录的两种作为正品使用外，还有不少在各地方习用，它们的性状与正品有微小的差别，如根部有粗有细，花瓣有大有小等。
菌种筛选方法
常用的菌种的筛选方法如下：（1）施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。
而得以快速分离纯化的目的。
如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。
在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。
如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。
（2）随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。
A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。
实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。
B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。
原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。
B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的ß-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。
C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。
首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。
实验室菌种筛选的一般步骤
实验室菌种筛选的一般步骤
实验室菌种筛选的一般步骤如下：
1. 收集样本：从自然环境中收集样品，例如土壤、水体、植物表面等。
2. 分离：将样品进行序列稀释，然后将其分布在富含营养物质的琼脂平板上。
孵育一段时间后，单独的菌落开始形成。
3. 纯化：从菌落中选择纯净的菌种，通过划线法或分装法将它们分离到新的琼脂平板上。
4. 生理特性测定：通过一系列实验，如形态学观察、生长速率测定、营养需求测试等，来评估菌种的生理特性。
5. 生化特性测定：通过一系列生化试验，如氧需求、产气、酸碱反应等，来进一步了解菌种的特性。
6. 代谢产物检测：检测菌种产生的代谢产物，如抗生素、酶等。
7. 抗性测试：测试菌种对不同抗生素、重金属或其他有害物质的抵抗力。
8. 毒性测试：评估菌种对人类和环境的毒性。
9. 鉴定：根据以上的实验结果，使用各种技术和方法，如形态学观察、生化分析、蛋白质或基因序列分析等，来确定菌种的
分类学身份。
10. 保存和文献整理：保存纯净的菌种并记载相关信息，并整理实验数据和文献资料，以备将来参考和使用。
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产薯蓣皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定任 智,张晓喻,祝 凯,冯定胜,王一丁(四川师范大学生命科学学院,四川成都 610068)
摘 要 从华重楼(ParispolyphyllachinensisFranch)的地下块茎中分离出107株内生菌,经TLC筛选检测,菌株RZ03和RZ07可产生薯蓣皂甙。进行了形态和生理生化鉴定并将菌株的16SrDNA序列分别与用BLAST
调出GenBank+EMBL+DDBJ中的相关序列比较,用ClustalW绘制系统发育树,RZ03与DQ019167(Exiguobac2teriumacetylicum)同源性为99%,鉴定为Exiguobacteriumacetylicum,RZ03、RZ07与DQ207730(Bacillussubtilis)序列同源性为99%,初步鉴定为BacillussubtilisRZ07。关键词 华重楼;内生菌;薯蓣皂甙;16SrDNA序列分析中图分类号 R284.2 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2007)02-0006-04
ScreeningandIdentificationofDiosgenin2ProducingEndophyticBacteriafromParispolyphyllachinensis
RENZhi,ZHANGXiao2yu,ZHUKai,FENGDing2sheng,WANGYi2ding(Coll.ofLifeSci.SichuanNormalUniv.Chengdu610068)
Abstract 107endophyteswereisolatedfromundergroundstemtubersofParispolyphyllachinensis.RZ03andRZ07couldproducediosgeninwerescreenedthroughTLCtesting.Theirmorphology,physiology,andbiochemistrywerecharacterizedandtheir16SrDNAsequencewerecomparedwithrelatedsequencesobtainedfromGenBank+EMBL+DDBJ,andphylogenetictreeoftheir16SrDNAsequenceweredrawnwithClustalWrespectively.Thehomologybe2tweenRZ03andDQ019167(Exiguobacteriumacetylicum)was99%,therefore,RZ03wasidentifiedasE.acetylicum
RZ03.AndThehomologybetweenRZ07andDQ207730(Bacillussubtilis)was99%,therefore,RZ07wasidentifiedasB.subtilisRZ07.Keywords Parispolyphyllachinensis;endophyte;diosgenin;16SrDNAsequenceanalysis
1993年,Stierle[1]等首先从短叶红豆杉的韧皮部中分离到1株能产紫杉醇的内生真菌。随后研究者在多种植物中分离到能产生与宿主相同或相似生理活性代谢产物的内生菌,如产长春碱的长春花内生菌等[2]。重楼主要药用成分为甾体皂甙,具有止血、止痛、抗肿瘤、免疫调节和抗生孕等多种生理活性,是云南白药、宫血宁等多种药物的主要原料,其需求量很大[3]。由于重楼的引种驯化和组织培养没有取得突破性进展,重楼原料供不应求,寻找新的、可再生的重楼替代资源成为必然[4]。周立刚[5]等从滇重楼中分离得到发酵培养物含甾体化合物的内生真菌。本文从华重楼(ParispolyphyllachinensisFranch)中分离得到
2
株可发酵产生薯蓣皂甙的细菌,并通过形态、生理生化特征和16SrDNA序列分析对菌株进行了鉴定。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂 新鲜野生华重楼、华重楼粉(由四
收稿日期:2006-09-09
作者简介:任智 男,在读硕士。研究方向为微生物资源及活性产物。 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30670218)
6微生物学杂志 2007年3月第27卷第2期 JOURNALOFMICROBIOLOGYMar.2007Vol.27No.2川光大制药提供)、薯蓣皂甙元(四川省药检所)。细菌基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品;EXTaq酶和PCR相关试剂购自宝生物(大连)公司;其余试剂为国产分析纯。1.1.2 培养基 分离培养基:固体马铃薯培养基;发酵培养基:液体马铃薯培养基。1.2 方法1.2.1 重楼内生菌的分离 将鲜重楼块茎,用自来水洗净泥土,无菌水冲洗2次,无菌滤纸吸干水分。常规无菌操作下,75%乙醇浸泡1min,无菌水冲洗3次,滤纸吸干水分,0.2%的砷汞浸泡5min,无菌水冲洗10次,滤纸吸干水分。用无菌解剖刀将已表面消毒的重楼块茎削去表皮,切成3cm大小的正方体,置于分离培养基平板内,28℃培养4～8d。待平板有菌长出后,平板划线纯化,直至得到单菌落,斜面保存备用。1.2.2 发酵液的初步鉴定 ①重楼总皂甙的制备:重楼粉10g加入乙醚60mL,60℃超声振荡脱脂3h;过滤,滤渣用60mL和40mL甲醇超声振荡提取2次(60℃,各3h),合并滤液,回收甲醇;用5mL蒸馏水溶解,再用60mL和40mL水饱和正丁醇萃取2次,合并、回收正丁醇;用2mL甲醇溶解,即得重楼总皂甙;②菌株发酵液的TLC检测:将分离得到的菌株,分别接入发酵培养基中28℃,150r/min振荡培养。培养至48h和96h分别取培养液1mL,1000r/min离心5min。取上清20μL,用微量移液器点于薄层层析板上,以重楼总皂甙、发酵培养基为对照。层析液为氯仿2甲醇(100∶1),显色液为10%磷钼酸5%硫酸乙醇溶液,105℃烘3～5min,至重楼总皂甙显出清晰蓝色斑点为止。1.2.3 样品制备 将菌株接种于发酵培养基中,培养2～3d,将发酵液抽滤,在滤液中加入20mL2mol/L的盐酸溶液水解2h,放冷后用石油醚萃取3次,每次20mL,合并萃取液水洗至中性。旋转蒸干石油醚。用氯仿溶解于5mL容量瓶中(供TLC鉴定用)。1.2.4 标准液的制备 精称薯蓣皂甙元标准品25mg,用氯仿溶解,定容到50mL。1.2.5 薯蓣皂甙及其甙元的TLC鉴定[6] 以硅胶G20.5%CMC(1∶5)铺板,自然干燥后放入105℃烘箱活化30min;展开剂为氯仿、甲醇、水(调整混合比例),显色液为10%磷钼酸5%硫酸乙醇溶液,将样品和标准品点样TLC鉴定。1.2.6 菌株生理生化特征研究 产甾体皂甙菌株的生理生化实验参照文献[7]进行。1.2.7 菌株16SrDNA序列分析 按试剂盒操作说明书提取细菌基因组DNA为模板,以27F(5′2agagtttgatcatggctcag23′)和1540R(5′2aaggaggtgatccaaccgca23′)为正反向引物,扩增各菌株的16SrDNA。PCR反应体系为EXTaq酶0.5
μL、dNTP3μL、DNA模板0.5μL、正向引物
(17μmol/L)1μL、反向引物(17μmol/L)1μL、10×Buffer2μL、MgCl23μL,双蒸水39.4μL。反应条件为94℃4min;94℃1min,50℃
1min,72℃1min,循环30次;72℃延伸10min。用胶回收试剂盒回收片段,委托上海生物芯片工程公司测序。测序引物为27F、518F
(5′2cagcagccgcggtaatacgg23′)和1540R。
用BLAST探索比较菌株16SrDNA与Gen2Bank+EMBL+DDBJ中已登录的序列,调出与菌株16SrDNA相关的菌株序列,用ClustalW进行多重序列对比,绘制进化树。
2 结 果2.1 重楼内生菌的分离通过划线共纯化出107株菌。经过反复分离、筛选、纯化,结合菌落观察和镜检结果的综合判定,从新鲜重楼地下块茎中分离出46株具典型特征内生菌。经细胞核染色,初步分为10株内生真菌,16株放线菌及20株细菌。2.2 发酵液的初步鉴定TLC检测发现菌株RZ03和RZ07的发酵液与重楼总皂甙有颜色相同、迁移率相当的显色带(斑)。
2.3 薯蓣皂甙元的TLC鉴定结果通过调整氯仿∶甲醇∶水的比例从65∶30∶5到100∶0∶0得到最佳比例为95∶5∶0,TLC的结果见图1。2.4 菌株形态及生理生化特征菌株RZ03、RZ07的形态特征与生理生化试验结果见表2,检索《伯杰细菌鉴定手册》初步确定RZ03为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌,
RZ07为芽胞杆菌属(Bacillussp.)细菌。
72期 任智等:产薯蓣皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定 图1 RZ03和RZ07的发酵液TLC鉴定图Fig.1 RZ03andRZ07fermentationliquidTLCidentifypicture
表1 菌株生理生化特征Table1 Themorphology,physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofthestrains
RZ03RZ07革兰氏染色-+
氧化酶--
过氧化氢酶+-
接触酶-+
产生吲哚+-
酪素水解--
明胶水解-+
硝酸盐还原++
甲基红++
淀粉水解-+
从甘油产生二羟基丙酮--
葡萄糖发酵发酵型产酸发酵型产酸V.P++
2.5 16SrDNA系统发育分析 测定RZ03的部分16SrDNA序列1429bp,
RZ07的部分16SrDNA序列1420bp。BLAST比较发现RZ03与多株肠杆菌科细菌的16SrDNA
相似,RZ07与多株芽胞杆菌的16SrDNA相似。用ClustalW进行多重序列对比,绘制进化树,
RZ03进化树见图2a,RZ07进化树见图2b。图2a显示RZ03与DQ019167(Exiguobacteriumacetyli2cum)同源性为99%,由此判断RZ03与Exig2uobacteriumacetylicum同种,鉴定为Exiguobacteri2
umacetylicumRZ03。由图2b可知RZ07与已知序列DQ207730(Bacillussubtilis)的同源性为99%,再结合形态与生理生化特征初步鉴定为BacillussubtilisRZ07[在进化树上与RZ07在同一分子支上的菌种是AB211031(pseudomonas)但RZ07与bacillussubtilis的同源性仍高达99%所以其结果是结合生理生化鉴定结果的综合结论]。