病毒中和抗体检测.doc
中和抗体实验原理和步骤
中和抗体实验原理和步骤嘿，咱来唠唠中和抗体实验的原理和步骤。
先讲讲原理吧。
中和抗体实验呢，就像是一场病毒和抗体的小战斗。
病毒想要入侵细胞，就像小怪兽想闯进城堡一样。
但是抗体可不同意，中和抗体就像城堡的卫士，它的作用就是阻止病毒进入细胞。
当有病毒和含有抗体的血清或者其他样本混合的时候，如果抗体是中和抗体，那它就能和病毒结合，让病毒失去感染细胞的能力。
这就好比抗体给病毒戴上了个紧箍咒，让病毒没办法施展它的坏招数。
那这个实验的步骤是啥呢？咱先得准备好东西。
就像做饭得先准备食材一样，实验也得有材料。
你得有病毒样本，这病毒样本就像小怪兽的样本，要知道它是啥样的小怪兽，才能对付它。
还得有细胞，这细胞就是城堡啦，是病毒想要入侵的地方。
当然，最重要的是要有可能含有中和抗体的样本，比如血清，这血清里的抗体可能就是能打败病毒的卫士。
把这些都准备好后，就开始实验啦。
先把病毒和可能含有中和抗体的样本放在一起，就像把小怪兽和卫士放在一个小战场上。
让它们充分混合，就像让它们好好打一架，看看卫士能不能把小怪兽给制住。
这个混合的时间和温度啥的都挺重要的，就像打架也得在合适的环境里，太冷或者太热都不行，时间太短可能还没分出胜负呢。
然后呢，把这个混合后的东西加到细胞里。
这就像把战场上的小怪兽和卫士一起放到城堡周围，看看小怪兽还能不能闯进城堡。
如果细胞没有被病毒感染，那就说明抗体很可能是中和抗体，就像城堡没有被小怪兽攻破，说明卫士很厉害。
咱来举个例子哈。
我有个朋友在实验室里研究一种新的病毒。
他们想看看有没有中和抗体来对付这个病毒。
他们就收集了一些康复患者的血清，当作可能含有中和抗体的样本。
然后按照这些步骤，把病毒和血清混合，再加入到细胞里。
经过一段时间的观察，他们发现有些血清真的能让细胞不被病毒感染。
这就像找到了能打败小怪兽的卫士一样，可把他们高兴坏了。
通过这个实验，他们就能更好地了解这种病毒和抗体的关系，为以后的研究或者治疗啥的提供帮助呢。
病毒中和试验测定法
1 / 2病毒中和试验测定法1. 固定病毒稀释血清法(α法) 本法用于抗血清的中和价。
试验需先滴定病毒毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含200个TCID 50，再将待检血清倍比稀释加等量200个TCID 50/ml 的病毒液，混匀后37℃1h ，每一稀释度接种24孔细胞培养板4孔，每孔0.2ml 。
5%C02培养箱培养一定时间后，记录出现CPE 孔数，以不出现CPE 数和接种数的比为中和比值。
按Karber 法计算中和价。
其公式如下：Log TCID 50=L+d （S-0.5）（TCID 50用对数计算，L 为病毒最低稀释度的对数。
d 为组距，即稀释系数，在10倍系列稀释则为-1，S 为各组CPE 与接种数比值之和）50%中和试验举例50505050L=-1，d=-0.3，S=4/4+4/4+4/4+4/4+2/4=4.5代入Karber 公式：LogND 50= -1－0.3*(4.5-0.5)=2.2该抗血清ND 50(半数中和单位)为10-2.2，即1/160，则其中和价为160 ND 50/ml ，可以简写成160。
2. 固定血清稀释病毒法(β法) 本法用于测定抗血清的中和指数。
将病毒原液10倍系列稀释，分列于2排无菌管，第一排加等量正常血清（对照组）；第二排加待检血清（中和组），混匀后，置37℃1h ，分别接种细胞板孔（或鸡胚、实验动物）进行培养，记录CPE （鸡胚、动物死亡数），计算TCID 50（或LD 50），按下式计算中和指数。
中和组TCID 50（或LD 50） 中和指数= ———————————— 对照组TCID 50（或LD 50）查反对数，即得该待检血清的中和指数。
通常中和指数>50者判为阳性，10-49为可疑，<10者为阴性。
例如：对照组滴度的LD 50=10-6.5中和组滴度的LD=10-4.550中和指数=10(6.5-4.5)=102.0=100中和指数的对数Log=Log100=2.0一般来说，以10倍稀释进行滴度测定，Log10=1。
中和实验方法
RSV特异性中和抗体滴度检测一、实验原理：抗体与相应的病毒粒子特异地结合，使后者失去对易感动物或细胞的致病力。
（该试验方法以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液。
）二、实验分类：1. 固定血清--稀释病毒中和试验2. 固定病毒—稀释血清中和试验3. 简单定性中和试验4. 空斑减少法三、实验步骤：1.提前设定56 ℃水浴锅，将分装好的待测血清于56 ℃灭活（降低补体对实验结果的影响）30min 。
2.将加过双抗的培养基DMEM/F-12（用于Hep-2细胞；Vero细胞常用DMEM培养基）和BI血清进行37℃预热30min，与此同时灭好实验台（该准备3599细胞培养板灭过菌枪头以及15ml和50ml摇菌管）为后续实验做准备。
3.实验台灭菌30min，灭好台子后进行实验，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培养基8倍稀释待测血清（每管中加培养基210µl，再加相应的血清30µl），拆开96孔培养板后在盖子进行设计（实验设计参考图1），最后向每孔中加入75µl的培养基，按照实验设计加入相应的稀释血清75µl，用排枪以两倍梯度稀释血清。
（注意：最终到256倍时吸出的多余的75µl血清并弃掉。
）4.实验孔以及阳性对照孔分别每孔加入25 µl（注意：加毒时应从血清低浓度到高浓度）的104 TCID50病毒混匀，4℃孵育2 h。
5.在实验剩余半小时左右进行消化细胞，镜检细胞汇合度为90%左右即可用，弃掉培养液后，用2-3 ml无血清培养吹洗几遍细胞（意图为去除死细胞或活性不好的细胞），加入2 ml 胰酶后开始计时，将细胞培养板置于37℃的CO2无菌培养箱培养消化2-3min，在镜检细胞间有间隙或细胞收缩为单个状态为好，加入等体积的无血清培养基终止，小心吸掉液体，加入有血清的培养基2-3ml轻轻地吹下皿底部的细胞，轻微用枪吹吸几次使其成为均匀的单细胞悬液后转移到新的15ml离心管中等待细胞计数。
中和抗体测定
病毒分离技术（四） ——中和抗体测定
• 对照的设立 • 血清对照（ 1∶4），标准血清和待检血清同时设立 • 细胞对照、稀释液对照 • 100CCID50的抗原对照
❖每 个 对 照 设 两 孔 ， 血 清 、 抗 原 的 量 各 为 0.025ml/孔，补加稀释液0.025ml/孔，细胞对 照孔的稀释液应为0.05ml，然后全部加细胞悬 液0.1ml/孔，密封后放34.5℃培养5～7天。
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病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
• 结果判定 当100CCID50的抗原对照出现完全病变时，判定最终结果 当最高稀释度的血清病毒混合液接种的2孔细胞中有1孔不出现CPE，该稀释度 的倒数即为该血清标本的中和抗体滴度。
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血清对照1∶4 血清稀释1∶4
1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024 血清对照1∶4 血清稀释1∶4 1∶16 1∶64 1∶256 1∶1024
题外话
• 感谢大家多年来对免疫预防工作的支持 • 新的问题不断涌现，促使我们不断的向前 • 未来，任重而道远
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Thank you very much!
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感谢您的观赏！
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血清6
血清7
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血清4 ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○ ○○ ○○ ◎○ ◎○ ◎○ ◎○
血清8
病毒分离技术（四）
——中和抗体测定
待检血清稀释方法示例：
稀释度
1：4 1：16 1：64 1：256
狂犬病病毒中和抗体检测实验流程
狂犬病病毒中和抗体检测实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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中和抗体检测策略
中和抗体检测策略
中和抗体检测策略是指检测并确定血液或其它体液中的中和抗体的方法和技术。
这些抗体主要由B淋巴细胞产生，可特异针对某种特定的病原微生物。
当抗体与病原体结合时，能够抑制或中和病原体的感染力，阻止其与宿主细胞结合，从而抑制或消除感染。
中和抗体的检测通常基于体外实验模型，如病毒中和试验（neutralization test）。
在病毒中和试验中，通过添加逐渐增加浓度的血清或抗体样品到已感染病毒的细胞培养中，观察病毒复制抑制情况。
若能显著降低或消除病毒复制，则表明存在中和抗体。
除了病毒中和试验，还有其它中和抗体检测策略，如基于假病毒颗粒的中和试验、基于重组蛋白的中和试验等。
这些策略各有优缺点，适用于不同的应用场景。
总结来说，中和抗体检测策略是指用于检测血液或其它体液中存在的中和抗体的方法和技术。
这些策略基于不同的原理和实验模型，旨在确定抗体对特定病原微生物的抑制或中和作用。
这些检测对于了解免疫反应、评估疫苗效果、诊断疾病等具有重要意义。
中和抗体实验原理
中和抗体实验原理咱先得知道啥是中和抗体。
中和抗体就像是身体里的小卫士，专门对付那些入侵我们身体的坏家伙，像病毒之类的。
它们可厉害啦，不是那种只会瞎捣乱或者干看着的家伙。
中和抗体能够和病毒结合，然后让病毒失去作恶的能力，就好像给病毒戴上了手铐脚镣，让它没法再去感染我们的细胞啦。
那这个中和抗体实验呢，就是要看看这个中和抗体到底有多厉害。
这个实验就像是一场小小的比武大会。
在这个实验里，有几个重要的“选手”哦。
一个是我们要检测的中和抗体，这可是主角呢。
另一个就是病毒啦，它就是那个反派角色。
还有就是我们身体里的细胞，它们就像是无辜的小老百姓，等着被保护或者被病毒欺负。
实验开始的时候呀，我们会把病毒和中和抗体放在一起。
这就像是把坏人和警察放在一个小房间里一样。
如果这个中和抗体真的很厉害，它就会迅速地扑向病毒，然后紧紧地抱住病毒。
这个拥抱可不是那种友好的拥抱哦，而是让病毒动弹不得的那种。
然后呢，我们再把这个混合了中和抗体和病毒的东西，放到有细胞的地方。
如果这个中和抗体真的起到了作用，那些细胞就会很安全，就像有了一个超级保镖一样。
但是如果这个中和抗体不给力，那病毒就会像小恶魔一样冲向细胞，然后开始搞破坏。
我们怎么知道细胞有没有被破坏呢？这里面就有一些小技巧啦。
比如说，健康的细胞会有一些正常的表现，像会进行正常的新陈代谢呀，会分裂呀之类的。
但是被病毒感染的细胞就不一样啦，它们可能会变得病恹恹的，甚至会死掉。
我们就可以通过观察细胞的这些变化来判断中和抗体有没有起到作用。
在这个实验里，我们还得控制一些条件呢。
就像比赛要有规则一样。
比如说，我们得确定病毒的量是一样的，不能有的地方病毒多，有的地方病毒少，那就不公平啦。
还有中和抗体的浓度也得好好控制，不然的话，我们就搞不清楚到底是因为中和抗体本身厉害，还是因为我们放了太多的中和抗体才让病毒没办法作恶的。
中和抗体实验其实也像是一场解谜游戏。
我们通过这个实验，想要知道这个中和抗体到底有多能打，它能在多大程度上保护我们的身体。
中和抗体的检测方法和原理
中和抗体的检测方法和原理
中和抗体是指可以结合病原体并防止其进入宿主细胞或抑制其复
制的抗体。
中和抗体检测主要通过体外细胞培养或动物实验的方式进行。
1. 细胞培养法检测中和抗体
细胞培养法检测中和抗体主要包括细胞防御性中和试验、对中和
抗体的小胶片半微量滴度试验和复合病原体细胞培养中和试验。
其中，细胞防御性中和试验是最常用的方法。
该方法使用细胞系于体外培养，将病原体与中和抗体一起加入培养基内，观察病原体在细胞内是否被
清除，从而判断中和抗体的效力。
2. 动物实验法检测中和抗体
动物实验法检测中和抗体是通过注射病原体，将中和抗体加入动
物体内，观察病原体在动物体内的复制能力，从而判断中和抗体的效力。
常用的动物实验包括小鼠腹腔注射法、兔子狂犬病中和抗体测定
法等。
以上方法主要依靠病原体的复制和细胞的防御能力进行判断，从
而确定中和抗体的效力。
该方法有很高的可靠性和准确性，可广泛应
用于病毒、细菌和其他病原体等的检测中。
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病毒中和抗体检测1.病毒TCID50检测TCID50 是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。
它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度；2）它是一个单位；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。
理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。
首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为108.2TCID50/ml 。
它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理。
经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10x.x。
这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有10x.x个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是10xx TCID50/ml。
也可以说病毒的TCID50效价是10-x.x。
TCID50=10^5.64/0.1ml。
即：将病毒悬液作10^5.64稀释后，接种细胞0.1ml，可以使50%的细胞产生CPE。
（将病毒悬液作10^5.64稀释后，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100TCID50/0.1ml或者100TCID50/0.05ml）本方法的优缺点:①.优点:出现阳性结果时间较短,且较明显;②.缺点:有时候,在用枪头吸出细胞生长液时,容易出现污染;使用本方法时的注意事项:①.稀释病毒时,每做一个病毒稀释度都需要换枪头,减少浓度误差;②.96孔板,每孔接种的细胞量:一般在此种测定病毒滴度的方法下,要将细胞密度适当调低,至少要比正常传代时低一些,否则细胞生长速度过快,未到7天则细胞出现死亡,对观察CPE不利.一般情况下,小塑料瓶(8-9ml液体为正常用量),培养长慢单层后,消化细胞,加入6ml培养液,吹匀,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用显微镜看一下,细胞数过多则补加培养液,少则补加剩余4ml的细胞悬液;维持液,即病毒培养液,配方为:①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3; ②. MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我个人曾经做过实验,在状态很好的细胞上接种病毒,分别使用两种不同的维持液,最终结果是一样的,没有什么不同,所以可以根据个人需要进行选择.另外,曾经请教过专门做中和实验的老师,他认为适当的FBS对细胞有保护作用,而且他说这是国外文献上的报道.1）细胞准备1.1 检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗1.2 加入4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞1.3 放平培养瓶，37℃5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落1.4 加入5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中1.5 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min）1.6 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数1.7 以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml1.8 在微量培养板的各孔中加入100μl细胞, 相当于?×10^4细胞/孔1.9 在37℃5％CO2培养箱中过夜培养（18－22h），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定2）病毒制备3）病毒稀释3.1 取冻存的病毒，以病毒生长培养液（VGM）稀释10倍，即100微升病毒液+900微升稀释液，共1毫升。
（于1.5ML EP管中进行，将混合液充分吹打振荡，很重要！）3.2 做10倍稀释3.3 在另一新1.5ML EP管中加入100μl第一管稀释病毒液（1/10），按10的比例进行倍比稀释，再加入900μl稀释液，将混合液充分吹打振荡。
以此类推共稀释至10^13倍。
此过程中需要使用加样器和tip头。
使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。
使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）4）病毒接种：4.1 取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液或无血清DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。
4.2 于各孔中加100ul各不同的病毒稀释液，每个稀释度做一列孔，即每个病毒稀释度做8个平行复孔，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。
(病毒稀释度的选择10^3—10^12或者10^4—10^13,因为目的基因不同，重组腺病毒滴度差距很大，应该尽量将稀释度加大，看到有人用的稀释度是10^6—10^13)4.3 第11列和12列为阴性对照，阴性对照孔中加入100ul含5%胎牛血清的DMEM，监测细胞存活情况；切记：设置正常的细胞对照。
每次实验要重复4次，4.4 37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200µl继续于37℃，5% CO2培养5--10天；4.5 逐日观察，5--10天后倒置显微镜下观察，计算每一列中出现CPE（cytopathic effects，CPEs）的孔数。
只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较；4.6 如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本试验即为有效；4.7 计算每一列中出现阳性的孔数；4.8 用Reed-Muench法计算病毒TCID50/ml。
(1)计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）(2)计算阳性和阴性孔的累积数。
阳性孔累积数由下向上累计（3）；阴性孔累积数由上向下累计（4）(3)计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/〔（3）+（4）〕，（6）=（5）×100(4)计算距离比例（PD）=（大于50%的阳性百分比－50）/（大于50%的阳性百分比－小于50%的阳性百分比）TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数 + 距离比例×稀释系数的对数（稀释系数的对数 1:10稀释为1，半对数稀释为0.5，倍比稀释为0.3，1:5稀释为0.7）举例计算：TCID50的测定和计算（Reed-Muench法）它们的累计数分别列于第四和第五列（根据箭头所示方向）,第六列为细胞管总数,第七列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。
可见该病毒株的TCID50在10-3（91.6％）和10-4（40％）之间,其确切稀释倍数可按下列公式计算：91.6（高于50％的百分数）-50 91.6（高于50％的百分数）-40（低于50％的百分数）＝41.6/51.6＝0.8将由上式获得0.8加在高于50%死亡的稀释度的对数（3）上,因此该病毒的TCID50应是0.1ml 10-3.8稀释的病毒液。
查反对数得6310,即该病毒6310倍稀释液0.1ml等于1个TCID50。
2.中和实验1）细胞准备1.1 检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗1.2 加入4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞1.3 放平培养瓶，37℃5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落1.4 加入5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中1.5 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min）1.6 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数1.7 以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml1.8 在微量培养板的各孔中加入100μl细胞, 相当于?×10^4细胞/孔1.9 在37℃5％CO2培养箱中过夜培养（18－22h），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定2）待测血清准备2.1 动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。
为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。
各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃。
加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。
2.2 取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，或者按1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280稀释，每个稀释度做3-4个平行孔。
3) 加入病毒,感作3.1 以VGM将病毒稀释到100 TCID50/50μl (200 TCID50/100μ)3.2 除细胞对照孔外每孔中加入与血清量相等的病毒液，在细胞对照孔中加入与血清量相等的VGM3.3 轻混病毒－血清混和物，37℃ 5％CO2培养箱中孵育2h4）接种细胞4.1准备用于接种的刚达到完全融合的细胞的培养板，吸掉培养液，加入350μl 无血清D-MEM培养液以洗掉剩下的FBS4.2 病毒－血清混和物孵育2h结束后，各取100μl中和液到细胞培养板相应的孔中4.3 37℃ 5％CO2培养箱中孵育2h4.4 吸掉中和液，加250μl D-MEM 洗涤4.5 加200μl D-MEM 在37℃ 5％CO2培养箱中孵育3－4d，检测培养液中血凝活性，以能保护50％细胞培养管不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点。
在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。
置5%CO2 37℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，14D终判。
由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。
5）对照组对照的设定：包括细胞对照（培养液中仅含细胞，不含病毒和血清），阴性对照（培养液中含有l00TCID50病毒、细胞及阴性血清）和空白对照（培养基中含有100TCID50病毒及细胞，不含血清），各设3个平行孔。
为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进行该种病毒的中和试验时，尤为重要。
阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变。
病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照相馆，先将病毒作0.1、1、10、100、1000 TCID50稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。