人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价
新型肠道病毒71型灭活疫苗免疫策略关键技术研究
新型肠道病毒71型灭活疫苗免疫策略关键技术研究大量研究已表明手足口病(HFMD)患者中的重症及死亡病例主要是由EV71所致。
自1969年美国首次从患儿的粪便中分离出肠道病毒71型(EV71)以来,世界多个国家和地区均有EV71暴发和流行的报道。
近年来,HFMD的流行成为我国大陆、台湾地区以及东南亚国家的重大公共卫生问题之一,造成巨大的经济和社会负担。
目前,临床上尚无治疗HFMD的特效药物。
疫苗成为预防和控制该病的传播与流行的最有效的手段。
研发有效的疫苗,探索科学合理的免疫策略,具有重大的社会意义。
本课题针对北京微谷生物制药有限公司研发的新型EV71灭活疫苗(本文简称EV71疫苗)开展免疫策略关键技术的研究。
【研究目的】1.确定EV71疫苗的最佳免疫剂量、剂型和免疫程序。
2.评价E V 7 1疫苗诱导的免疫反应的持久性,探讨加强免疫的必要性。
3.确定EV71疫苗针对EV71所致HFMD/疾病的保护效力。
4.研究EV71疫苗保护效力的免疫学替代终点。
5.探索EV71疫苗与其他肠道病毒之间可能存在的交叉免疫/保护作用。
6.研究不同批次E V71疫苗的批间一致性。
【研究方法】1.EV71疫苗的最佳免疫剂量剂型及免疫程序研究采用随机双盲、安慰剂对照的研究设计,选择幼儿组(12~60月龄)600人、婴儿组(6~11月龄)600人,研究不同剂型不同剂量的EV71灭活疫苗(含佐剂160U、含佐剂320U、含佐剂640U疫苗以及无佐剂640U疫苗)的免疫原性和安全性。
比较受试者接种一针次和两针次疫苗后血清抗体水平的差异及不良反应发生率,确定EV71疫苗的最佳免疫剂量、剂型及免疫程序。
2.EV71疫苗免疫持久性和加强免疫研究基于最佳免疫剂量剂型及免疫程序研究的队列,随访至第1针免疫后第8月和第14月进行血清检测,观察EV71疫苗诱导的抗EV71中和抗体的持久性。
采用巢式随机双盲对照研究设计,在14个月时对已经完成两针次基础免疫的受试者进行再次招募入组,按2:1随机分配给予相同剂量剂型的ev71疫苗或安慰剂进行1针次加强免疫研究,比较各组受试者加强或不加强后的血清抗体反应水平差异,评价加强免疫的效果。
接种肠道病毒71型灭活疫苗后发生免疫性血小板减少症1例报告
接种肠道病毒71型灭活疫苗后发生免疫性血小板减少症1例报告王倩1陶志阳1赵德峰2*（1武汉市东西湖区疾病预防控制中心，湖北武汉430040）（2武汉市疾病预防控制中心，湖北武汉430022）痫发作，同时患者既往有癫痫病史，但仔细询问患者，发病前有精神行为异常，癫痫发作停止后精神烦躁明显，所以此次起病并非为癫痫再次发作。
病毒性脑炎大多数急性起病，有发热、感冒、腹泻等前驱感染史，化验脑脊液病毒学有助于明确诊断，给予抗病毒治后症状改善；自身免疫性脑炎在血清及脑脊液中可发现特异性抗体阳性，有助于诊断。
大多数桥本脑病对激素敏感，但目前对于激素的应用剂量及应用疗程并没有统一的标准，既往研究多为甲泼尼龙0.5g 或者1g 开始用起，之后3~5d 后逐渐减量，逐渐改为口服，减量时需缓慢，防止复发，对激素的应用剂量及疗程还有待于大量的临床研究。
综上所述，虽然桥本脑病比较少见，但如果能排除由其他疾病引起，结合患者有甲状腺功能异常，临床表现，头颅核磁正常或者有非特异性的异常信号，脑电图有慢波等特点，同时给予大剂量激素冲击治疗后症状迅速缓解，均应考虑为该病的可能。
参考文献[1]BRAIN L ，JELLINEK E K ，BALLK ．Hashimoto ’s disease and encephalopathy[J].Lancet ，1966,2（7642）：512-514.[2]GRAHAM B R ，SHIFF N ，NOUR M ，et al ．Hashimoto Encephalopathy ｐresenting with stroke-like episodes in an adolescent female ：a case report and literature review [J]．Pediatr Neurol ，2016,59：62-70．[3]邓阳燕，丁晓宁，张鹏．桥本脑病的研究现状[J]．临床神经病学杂志，2019，32（5）：386-389．[4]LEE J ，YU H J ．Hashimoto encephalopathy in pediatric patients ：Homogeneity in clinical presentation and heterogeneity in antibody titers[J]．Brain Dev ，2018，40（1）：42-48．[5]MONTAGNA G ，IMPERIALI M ，AGAZZI P ，et al ．Hashimoto ’s enc ephalopathy ：a rare proteiform disorder [J]．Autoimmun Rev ，2016，15（5）：466-476．[6]GRAUS F ，TITULAER M J ，BALU R ，et al.A clinical approach to diagnosis of autoimmune encephalitis [J].Neurology ，The Lancet Neurology ，2016，15（4）：391-404．（收稿日期：2020-11-21）中图分类号：R5文献标识码：B 文章编号：1672-1721（2021）05-0733-02DOI ：10.19435/j.1672-1721.2021.05.0772019年5月14日，武汉市东西湖区卫生健康局接到一份要求进行预防接种异常反应调查诊断的申请报告，申请报告认为一名儿童所患免疫性血小板减少症是由接种肠道病毒71型灭活疫苗（以下简称“EV71灭活疫苗”）引起，要求给予调查诊断。
肠道病毒的PCR检测方法评价与改进
肠道病毒的PCR检测方法评价与改进肠道病毒是一类病毒，可以引起婴儿、儿童和成人的肠胃炎症，也会出现其他症状，例如发烧、头痛和呕吐等。
这种病毒主要通过粪口途径传播，因此其检测方法十分关键。
本文将就当前肠道病毒PCR检测方法进行评价，并对其改进做出探讨。
肠道病毒PCR检测方法评价PCR方法是一种高效、快速、特异性、灵敏度高的检测技术，近年来被广泛应用于肠道病毒的检测。
但是，PCR方法本身也存在一些问题。
1. 受污染样本引起的假阳性PCR方法是一种类似放大镜的技术，可以多次扩增样本中的DNA或RNA。
但是，污染样本中的DNA或RNA也会被不小心扩增，从而导致假阳性结果。
这一问题可以通过采取防止交叉污染的措施来避免，例如在每次PCR操作之前对材料进行清洁和消毒。
2. PCR抑制如果PCR反应体系中存在抑制PCR反应的物质，例如某些胆固醇、脂肪酸、血红素和酶等，将导致PCR反应不稳定，或者根本无法进行。
因此，在进行PCR反应时，需要保证反应体系的纯净，以便避免这种情况的发生。
3. 杂交交叉在PCR反应中，如果引物或探针与某些非目标序列杂交，将产生杂交交叉的问题。
这种问题通常可以通过优化PCR反应条件，例如缩短PCR扩增时间、调整PCR反应体系中的引物和探针浓度、调整PCR反应体系中的MgCl2浓度等方法来解决。
4. 稳定性PCR方法产生的结果通常具有很高的可重复性和再现性。
然而，由于样品的因素，例如样品稀释度、样品质量等，PCR方法在不同的实验条件下也会引起结果的差异。
因此，在进行PCR反应时应该控制好实验条件，确保实验环境的一致性。
PCR检测方法改进通过对当前PCR检测方法进行分析，得知当前PCR检测方法在杂交交叉和PCR抑制的问题上存在一定的局限性。
为了改进当前PCR检测方法的问题，建议采用以下措施。
1. 引物合成设计引物是PCR检测的一个关键步骤。
对于某些极为多样性的病毒，设计引物是一件十分困难的事情。
肠道病毒EV71疫苗的比较研究
肠道病毒EV71疫苗的比较研究摘要】肠道病毒EV71（EV71）是引起手足口病(Hand, foot and mouthdisease,HFMD)主要病原体，可引起严重的神经系统并发症，是手足口病婴幼儿死亡的主要原因。
由于临床上尚无有效的治疗手段，目前疫苗的研发迅速，已有疫苗用于临床实验阶段。
本文主要对全病毒灭活疫苗, 病毒样颗粒疫苗,减毒活疫苗的研发进展和存在的优缺点作一综述。
【关键词】肠道病毒EV71；手足口病；疫苗【中图分类号】R726 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）23-0083-03肠道病毒71（EV71）1963年在荷兰被首次发现，1969年美国第一次对其描述[1]。
EV71引起手足口病，主要通过粪口传播，可引起严重的神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎，脑干脑炎，脊髓灰质炎，脑脊髓炎和死亡。
幸运的是，一些后备的EV71疫苗已经被报道，由于动物模型得到很好的效果，自2010年开始用于临床试验阶段。
但是我国研制的一株EV71灭活疫苗在Ⅲ期临床试验中的结果显示，并不能有效地预防手足口病的发生，与研究者之前普遍认为的EV71疫苗乐观的前景相矛盾，提醒我们应该重新思考EV71疫苗研究中存在的问题。
1.EV71疫苗研究的进展到目前为，没有任何的临床治疗手段和疫苗能有效的阻止EV71感染儿童。
但是疫苗确实最后的的控制和阻止EV71流行的有效手段。
接下来我们总结了各种后备疫苗的研究进展，并进行了比较分析。
2.疫苗的研发进展和存在的优缺点比较2.1全病毒灭活疫苗（inactivated whole-virion vaccine）全病毒灭活疫苗是最安全的生产疫苗的方法，生产工艺成熟，有良好的免疫原性，例如流感病毒，脊髓灰质炎病毒或者狂犬病毒。
灭活的EV71是作为疫苗最主要的备选方案。
福尔马林灭活EV71疫苗在小鼠和恒河猴的体内实验中，表现出令人满意的免疫保护性水平和中和抗体的交叉反应。
肠道病毒71型灭活疫苗2年保护效力、免疫原性和安全性评价
肠道病毒71型灭活疫苗2年保护效力、免疫原性和安全性评价[研究背景]手足口病(HFMD)是由多种肠道病毒引起的一种常见传染病,是我国法定报告的丙类传染病,其中肠道病毒71型(EV71)是导致HFMD重症病例和死亡病例的优势病原。
近年来,EV71所致重症HFMD及EV71所致疾病的流行,严重危害我国婴幼儿及儿童生命健康。
目前,多个国家和地区开展了 EV71疫苗的研发,其中我国3家企业或研究所已完了Ⅲ期临床且均已注册上市。
然而,EV71灭活疫苗临床试验中观察的疫苗保护效力和血清抗体水平仅局限于第一年,该疫苗的长期保护效力、保护性抗体持久性尚有待研究。
[研究目的]1.评价EV71灭活疫苗针对EV71所致HFMD/疾病的2年总体保护效力。
2.评价EV71灭活疫苗诱导保护性抗体的持久性。
3.评价EV71灭活疫苗2年期间的严重不良事件发生率。
[研究方法]2012年,EV71灭活疫苗Ⅲ期临床试验,通过采用多中心、随机、双盲、安慰剂对照设计,招募中国6-35月龄健康婴幼儿受试者按1:1设计随机分配中按照0,28天免疫程序接种EV71疫苗(5120名)或安慰剂(5125名)。
在完成EV71灭活疫苗第1年效力评估后,又进行了延续随访研究直至第2年。
由于前期的临床研究在第1年随访结束时已揭盲,所以在第2年延续随访期间EV71所致HFMD的监测是开放性的;然而,实验室中抗体检测人员和病原鉴定人员对于疫苗或安慰剂分配均保持盲态。
基于前期研究建立的肠道病毒监测系统,对第13个月至第26个月期间参与随访的受试者进行病例监测,确定第2年期间EV71所致HFMD/疾病。
此外,在第26个月进行一次采血并进行EV71中和抗体水平检测。
通过前期研究以及延续性随访研究,可以进行评价EV71疫苗的2年总体以及第2年的保护效力、免疫原性和安全性。
免疫原性亚组受试者于在第0天、第56天、第8个月、第14个月和第26个月采血检测抗EV71中和抗体,计算中和抗体GMT和阳性率,来评估疫苗诱导的抗体水平在免后2年期间的持久性。
肠道病毒71抗原ELISA检测方法构建及其应用
肠道病毒71抗原ELISA检测方法构建及其应用韩金乐;贾继宗;李川;杨亮;何德磊;李娟;由鹏飞;叶祥忠;李益民【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2011(031)011【摘要】Objective To develop an ELISA method for quantitative determination of enterovirus 71 (EV71) antigen.The method can be applied to detect EV71 antigen contents and analyze the correlation between immunogenicity and immunoprotection.It also can be used for tissue culture infective dose( TCID50 ) assay.Methods A double antibody sandwich ELISA method was developed for quantitative determination of EV71 antigen on the basis of the high-affinity neutralizing monoclonal antibodies ( K8G2 and Y8H2-HRP).This method was compared with microscopic observation for the detection of EV71 TCID50.The correlation was analyzed between the specific activity of EV71 antigen and the EV71 neutralizing antibody titer in immune serum.Results The linear range of this method was 0.125-4.0 U/ml and the R2 value was 0.9911.The reagent did not react with other antigens except EV71 antigen.The recovery ratio of this method was 0.89-1.16.The coefficient of variation was less than 15％.The heat recovery rate was above 85％when the reagent was in 37℃ for 9 days.There was a good correlation in TCID50 of EV71 between this method and microscopic observation,r=0.990.The specific activity of EV71 antigen had positive correlation with the neutralization titer of immuneserum in 21 EV71 strains,r=0.930.Conclusion The quantitative ELISA method for EV71 antigen was developed,which could be used to detect EV71 antigen contents and analyze TCID50.The specific activity of EV71 antigen detected by the method could be used to evaluate the immunoprotection of the vaccine potency test.%目的建立肠道病毒71型(EV71)抗原的ELISA检测方法.用于EV71的抗原定量、TCID50试验及EV71免疫原性与免疫保护性的关系分析.方法以高亲和力的EV71中和单抗K8G2和Y8H2-HRP构建检测EV71抗原的双抗体夹心ELISA方法.比较本方法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50.分析EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的关系.结果本试剂定量检测抗原的线性范围为0.125 ～4.0 U/ml,R2 =0.9911,试剂不与EV71之外的受试物反应,试剂的回收率为0.89 ～ 1.16,变异系数小于15％,37℃9 d的热回收率大于85％.本法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50的相关系数r=0.990.21株EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的相关系数r=0.930.结论构建了EV71抗原ELISA检测试剂,可用于EV71的抗原含量检测、TCID50分析,为特异比活与免疫血清中和性关系研究提供了一些有价值的信息.【总页数】4页(P1031-1034)【作者】韩金乐;贾继宗;李川;杨亮;何德磊;李娟;由鹏飞;叶祥忠;李益民【作者单位】102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心【正文语种】中文【相关文献】1.鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用2.肺炎衣原体ELISA 抗原检测方法的建立和应用3.结核分枝杆菌抗体双抗原夹心ELISA检测方法的建立及初步应用4.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用5.应用禽呼肠孤病毒σ_3融合蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
EV71疫苗质量控制和评价技术要点
E V71疫苗质量控制和评价技术要点-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KIIEV71疫苗质量控制和评价技术要点2016年11月16日发布引言手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD）是婴幼儿人群常见的急性传染病，主要表现为发热和手、足和口等部位的皮疹或疱疹，可并发无菌性脑膜炎、脑炎及急性弛缓性麻痹等中枢神经系统症状，甚至死亡。
多种肠道病毒感染可引起HFMD，肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）为引起世界范围内HFMD爆发的主要病原体（1）。
HFMD中约90%的死亡病例由EV71感染引起（2），EV71引起的HFMD已成为我国的重大公共卫生问题之一。
2015年，我国自主研发的EV71灭活疫苗获批上市（3）。
研究制定EV71疫苗质量控制和评价技术技术要点，对规范并提高我国EV71疫苗的质控标准和生产一致性，保证上市疫苗安全、有效和质量可控具有重要意义。
本技术要点中EV71疫苗是指采用传代细胞生产的全病毒灭活疫苗，或采用重组DNA技术将具有免疫保护性的抗原基因克隆到表达载体上，转化相应的宿主中表达的EV71抗原蛋白，经过纯化等工艺制备的EV71疫苗。
本技术要点中凡涉及生物制品质量控制的通用要求，均应按现行版《中华人民共和国药典》三部有关规定执行（4）；有关生产设施的要求应参照国家食品药品监督管理总局（CFDA）2010版《药品生产质量管理规范》执行（5）。
本技术要点仅为对EV71疫苗进行质控和评价技术要求的指导性文件，需根据技术的发展和实际需要进行适当的更新。
一般考虑EV71属于小RNA病毒科，肠道病毒属，为无包膜病毒。
EV71颗粒为20面体的对称结构，直径约24-30纳米，由60个亚单位组成。
病毒基因组为单股正链RNA，7400核苷酸左右，包含有5’-UTR区和3’-PolyA尾。
EV71的衣壳蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中，VP1、VP2和VP3位于病毒衣壳外部，VP4位于病毒衣壳内部。
肠道病毒71型6例检测报告及文献复习
近 年 来 ，世 界 各 国 以及 我 国 内肠 道病 毒 Ｅ Ｖ ７ １ 型 感 染所 致 病 例 。 其感 染 途径 主要 经 由 胃肠 道 （ 粪 一口 、 水、 食 物 污染 ） 和呼 的 疾病 的爆 发越 来 越多 。 Ⅲ 各 种媒 体 也有 相 继报 导 ， 本院于 ２ ０ １ ２ 吸道（ 飞沫 、 咳嗽 或 打喷 嚏 ） 传染 ， 也可 经 由接触 病 人 皮 肤 水泡 的 年 ７ 月至 ２ ０ １ ３年 ４月检 测 肠道 病 毒 Ｅ Ｖ ７ １ 型 阳性 结 果 ６ 例 。临 液 体 而受 到 感染 ， 病 毒 可通 过 唾 液 、 疱疹液 、 粪 便 等 污 染 的手 、 手 床 诊 断标 准 参 见卫 生部 印 发 的《 手 足 口病 诊 疗 指 南 ￣ ２ Ｏ ｌ Ｏ年 版 ， 绢、 手 巾、 牙杯、 玩具 、 食具 、 奶 具 以及 床上 用 品 、 内衣 等 引 起 间接 现 报告 如 下 。 接 触传 播 。 经 患者 污染 的 水 、 食物 、 空气 （ 飞沫 ） 也 可 能 发生 感 染 ， １ 病例 资 料 Ｅ Ｖ ７ １ 可一 年 四 季 发生 感 染 ，多 在 ４ — ９月 感 染 流行 ， ６ 月 份 为 高 病例 １ ． 冀某某， 女， ３ 岁， 住 院号 ６ ０ １ ２ １ ７ ， 家住 宜 昌市 秭 归 县 发 ， 男 性 多 于女性 １ ５ １ 感染 后 会 有 ２ — １ ０天 的潜 伏 期 ， 在发病后 １ 周 茅 坪 镇 九 里 迎 宾路 某 社 区 ， 于２ ０ １ ２年 ７月 １ ２日出 现手 、 足、 口 内传 染力 最 强 。 腔 多 处 疱疹 ， 伴 发热 ， Ｔ ３ ８ ． ８ ℃， 于２ ０ １ ２ 年 ７月 １ ５日人 住 本 院 儿 ３ 结 语 科治疗 ， ５ 天 后 疱 疹 均结 痂 ， 症状体征消失， 于７ 月２ ０ 日治 愈 出 因为手 足 口病 是一 － Ｊ Ｌ 童常 见 的传 染病 ， 所 以 在儿 童 聚集 的地 院。病 例 ２ ， 梅某某 ， 男， ２ 岁， 住院号 ６ ０ １ ３ ６ ８ ， 家住 秭 归县 茅 坪 镇 方 是 一个 发 病 的高 发场 所 ， 比如 幼儿 园 、 学 校或 者 是 幼 儿 活 动场 平湖路 １ ０ — ２ ８号 ， 因拒 食 ２ 天， 口腔 、 手 足 及 全 身 多 处 出 现 红 色 所 ， 一 旦 有人 出 现 了感染 ， 很 可 能 在 这个 群 体里 造 成 群 体 内 的传 丘疹 ， 咽喉 红肿 ２天 ， 于 ７月 １ ７ １ ３ 入院 ， 经 ６天 治 疗 ， 丘 疹 红 变 播 ， 它 的传染 性相 对来 说 比较强 ． 所 以对孩 子 的 照顾 、 护 理就 非 常 暗， 结痂 ， 咽 红 消退 ， 于 ７月 ２ ２日痊 愈 出 院。病 例 ３ ， 金 某某 ， 男， 重要， 从孩 子个人 卫生 、 饮 食卫 生 、 水 源都要 很 好 的处 理 。不 要让 ６岁 ， 住 院号 ６ ０ ４ ９ ５ ３ ， 家 住秭 归 县 茅坪 镇 九 里 ２组 ， 因 咳嗽 半月 ， 孩 子 喝生水 、 吃生 冷食 物 ， 避免 接触 患 病孩 子 ； 看护 者 在接 触 孩子 口腔 、 手 足 及全 身多 处 皮 疹 ４天 ， 伴发热 ， Ｔ ３ ８ ． ５ ℃， 于２ ０ １ ２年 ９ 前、 替 孩 子换 尿 布前 、 处 理粪 便 后 都要 认 真 洗 手 ； 孩子 的奶 瓶 、 奶 月３ ０日人 住本 院儿 科 ， ｆ ｌ Ｏ月 ８日痊 愈 出院 。 病 例 ４， 王 某某 ， 嘴使 用前 后 都要 充 分清 洗 ； 手 足 口病 流行 期 间 ， 不 要 带 孩 子 到人 男， ｌ 岁， 病员 号 ２ １ ７ ６ ８ ６ ８ ， 于２ ０ １ ３ 年 １ 月 ７ 日来 本 院 门诊 儿 科 群 聚集 、 空气 流通 差的公 共 场所 。 其 次需 要 保持 家庭 环境 卫 生 ， 居 就诊 ， 病历 记 录 ， 连续哭闹 ２ － ３天 后 ， 孩 子 的 口腔 中 出现 淡 红 色 室要 经 常通 风 ， 勤晒 衣 被 ， 玩具 、 被褥 、 桌 椅 等 家庭 常用 物 品 应 该 水疱并很快破溃成 ２ － ３ 毫 米 的 小 溃疡 块 ， 主要 分 布 在 舌 、 牙龈 、 经 常进 行 消毒 ，如 ８ ４消毒 液 、漂 白粉 等 氧化 剂都 是 很 好 的杀灭 颊 部 等处 ， 流 口水 ， 不愿 进 食 ， 后 家长 发现 患 儿 手 足 、 臀 部也 出现 Ｅ Ｖ ７ １ 病 毒制 剂 ， 另 外还 有 紫外 线 照射 、 经 过晒 蒸 煮 高温 也可 以杀 疱疱 ， Ｔ ３ ８ ． ７ ℃ 。病 例 ５ ， 韩某 某 ，男 ， １ 岁 ，病 员 号 ３ ０ ０ ５ ９ ２ ８ ， 于 掉 病毒 。 此外还 要定 期做 检查 ， 做好 晨 检 ， 幼 儿 园应 该对 每个 人 园 ２ ０ １ ３ 年 １ 月 ８日来 本 院 儿 科 就 诊 ， 病历显示 ： 口腔 内舌 及 唇 齿 的孩 子早 上 要进 行健 康 检查 ， 注 意有 无 发烧 ， 张嘴 看 一 眼 是 不是 侧 黏 膜 多处 出现疱 疹 ， 流涎， 手、 臀、 足几 处 皮 肤丘 疹 ， 流黄水 ， 满 有 口腔溃 疡的情 况 ， 观 察手 掌 有无 皮疹 ， 另 外要 询 问 家长 ， 孩 子一 奶， 哭闹３ 天。 病 例 ６马某 某 ， 女， ４岁 ， 病员号 ３ ０ ８ ７ ０ ２ ２ ， 发烧 ， 咳 两天 在 家是 不是 有 精神 萎 软 、 嗓 子疼 等情 况 ， 如果 有 这 些 特 殊情 嗽， 厌 食 ２天 ， 后 发现 嘴 里 起 “ 颗颗儿” ， 身上 、 脚心也有 ， 多 处 被 况 ， 应及 时 隔离 检查 ， 治疗 ， 分 开食 宿 ， 用具 ， 玩具等 ， 以免 感 染其 抓 破 裂 ，烦 躁 不安 ，于 ２ ０ １ ３ 年 ４ 月 ４日来本 院皮 肤科 就 诊 。Ｔ 他儿童， 这样 集体 的 流行情 况 就会 降低 。现 已有 消息 报 道［ ６ １ ７ １ 手 足 ３ ８ ． ８ ｏ Ｃ ， Ｅ Ｖ ７ ｌ 型 检测 阳性 ， ＷＢ Ｃ １ １ ． ３ ×１ ０ Ｙ Ｌ ， Ｌ ４ １ ． ７ ％， 心 率 加快 。 口病 基 因工程疫 苗研 发获 得突 破 ， 我 国江 苏省 预 防 医学会 流 行病 ２ 讨 论 学 专业 委 员会 主任委 员朱 风才 教 授及 其 团 队 ， 历 时近 ３年成 功 完 ６例 均来 自于 本 院住 院及 门诊 就诊 病 人 。患 儿 均 属 １ － ６岁 成我 国 自主研 发的肠 道病 毒 ７ １ 型 灭活 疫 苗 、 Ⅱ、 Ⅲ期 临 床试 验 学龄前儿童 ， 分布 在 不 同 的 居住 点 ， 属 于散 发状 态 ， 其 共 同临 床 研 究 ，在 国内外 首次 证实 肠道 病 毒 ７ １ 型 灭活 疫 苗预 防 手足 口病 表 现 为 发热 Ｔ ３ ８ ℃左 右 ， 手、 足、 口腔 、 臀 部及 脚心 部 不 同程 度 出 安全有 效 ， 预计一 年后 可广 泛用 于预 防接 种 ， 现疱疹 ， ２例 病 人早 期 有 咳嗽 感 冒样 症 状 ， ｌ 例咯奶 ， ３例 厌 食 ， 参考 文 献 烦 躁 不安 ， ３例 门诊 病 人后 期 检查 治疗 不 详 。 肠道病毒 ７ １ 型（ Ｈ ｕ ｍ ａ ｎ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ７ １ 简称 Ｅ Ｖ ７ １ ） 属小 Ｒ Ｎ Ａ 【 １ １ 刘远 德 、 楼 永 良． 微 生 物 学检 验 【 Ｍ］ ， 第 ２版 ， 人 民卫 生 出版 社 ．
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肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）属于小RNA 病毒科肠道病毒属，为危害程度仅次于脊髓灰质炎病毒的嗜神经性肠道病毒，可引起5岁以下儿童手足口病（Hand -foot -mouth disease ，HFMD ），少数重症患者可并发严重的中枢神经系统疾病和肺部感染，重症患儿病程进展迅速，预后差［1-4］。
目前，HFMD 尚缺乏有效的预防措施和治疗方法，研制疫苗是控制HFMD 流行的重要手段。
中和效价是评价疫苗免疫原性的关键指标之一［5-8］，检测结果的准确性对疫苗研发和应用均具有重要意义。
目前，EV71中和抗体检测方法多采用微量细胞病变法，该方法影响因素较多，且国内各实验室的应用时间尚短，为探讨和规范该测定方法，准确评价EV71疫苗毒株的免疫原性和保护能力，本实验对实验室内、实验室间以及不同毒株对EV71抗基金项目：国家科技支撑项目（2008BAI69B01）资助项目.作者单位：1中国药品生物制品检定所（北京100050）；2华兰生物工程股份有限公司研发部（河南新乡453003）；3北京生物制品研究所（北京100024）；4北京科兴生物制品有限公司研发部（北京100085）；5中国医学科学院医学生物学研究所免疫室（昆明650118）.通讯作者：毛群颖，E -mail:maoqunying@*：共享第一作者中国图书分类号R373.2R392-33文献标识码A 文章编号1004-5503（2010）08-0885-04【实验技术】人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价毛群颖1*何鹏1*于祥2李楠2郝春生3高强4董承红5梁争论1李凤翔1沈心亮3王军志1【摘要】目的对人肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）中和抗体检测方法进行实验室评价，为该方法的标准化提供依据。
方法5个实验室按照统一制定的EV71中和抗体检测操作细则（SOP ），应用A 、B 和C 基因型的10株EV71病毒株，分别测定10份人免疫球蛋白、20份健康成人血浆和15份EV71动物高效价免疫血清样品中EV71中和效价，检测实验室内、实验室间重复性及不同EV71病毒株对中和抗体检测的影响。
结果相同实验室应用各病毒株重复测定中和效价的最大值与最小值（Max -Min ）倍数差均在4倍以内，3次重复试验结果间差异无统计学意义（P 值均＞0.05）；不同实验室应用相同病毒株检测结果的Max -Min 倍数差在4倍以内；不同实验室应用不同病毒株检测结果为：A 型株与其他基因型病毒株中和效价的Max -Min 差在192倍以内，B3与C4亚型的病毒株中和效价的Max -Min 倍数差在64倍以内，C4亚型不同病毒株之间中和效价的Max -Min 倍数差在16倍以内。
结论按统一SOP 操作后,EV71中和抗体检测方法应用相同毒株在实验室内和实验室间具有较好的重复性，而不同病毒株对中和效价的测定结果有较大影响。
【关键词】肠道病毒A 型，人；手足口病；中和抗体；基因型Laboratory Evaluation of Method for Determination of Neutralizing Antibody against Human Enterovirus 71MAO Qun -ying △,HE Peng,YU Xiang,LI Nan,HAO Chun -sheng,GAO Qiang,DONG Cheng -hong,LIANG Zheng -lun,LI Feng -xiang,SHEN Xin -liang,WANG Jun -zhi （△National Institute for the Control of Pharmaceuticaland Biological Products,Beijing 100050,China）【Abstract 】ObjectiveTo evaluate the method for determination of neutralizing antibody against human enterovirus 71（EV71）in laboratory and provide a basis for standardization of the method.MethodsThe neutralizing antibody titers against EV71in 10human immunoglobulin,20healthy adult plasma and 15high titer animal immune serum specimens were determined with 10EV71strains of genotypes A,B and C by 5laboratories according to the SOP for EV71neutralizing antibody,based on which the in －tra -and inter -reproducibility of the method as well as effect of various EV71strains on determination of neutralizing antibody were analyzed.ResultsThe fold differences in maximum and minimum （Max -Min ）of determination results of neutralizing antibody titerswith various EV71strains by the same laboratory were less than 4,and the results of 3repeat tests showed no significant difference （P >0.05）.The fold differences in determination results with the same EV71strain by various laboratories were also less than 4.The determination results with various EV71strains by various laboratories were as follows:the fold differences of the Max -Min of neu －tralizing antibody titers of EV71strain genotype A with other genotypes were not more than 192,while those of subtypes B3with C4were not more than 64,and those of subtype C4with other strains were not more than 16.Conclusion By operation according to the unitary SOP,the method for determination of neutralizing antibody against EV71showed satisfactory intra -and inter -reproducibility.However,various EV71strains showed significant effect on the determination result.【Key words 】Enterovirus A,human;Hand -foot -mouth disease;Neutralizing antibody;Genotype体检测结果的影响进行了比较，现报道如下。
1.材料与方法1.1协作实验室中国药品生物制品检定所（A）及4个EV71疫苗研发企业（B、C、D、E）。
1.2样品人免疫球蛋白制品10份（RB1～RB10）和健康成人血浆20份（J1～J20）均由华兰生物工程股份有限公司惠赠；EV71动物高效价免疫血清15份（M01～M15）由参加本研究的各实验室共同制备。
全部样品均由中国药品生物制品检定所盲编后分发于各协作实验室。
1.3中和抗体检测用病毒株5个实验室应用3个基因型（A、B和C型）的10株EV71病毒株（基因型见表1）进行检测。
表1EV71中和抗体检测用病毒株Tab1.Virus strains used for detection of EV71neutralizing antibody实验室C4基因型A基因型B3基因型A B-01--B B-01，B-02BrCr-b*-C C-01--D D-01，D-02-D-03E E-01，E-02BrCr-e*-注：*：为两个实验室分别保存，不同来源、不同代次的BrCr病毒株（标准株）1.4EV71中和抗体检测操作细则（SOP）的制定为保证研究结果的准确性，本研究根据文献［9-11］，并结合各协作实验室的前期工作经验，确定了待测抗体与病毒的中和条件、细胞种类、细胞接种量以及培养条件等，制定EV71中和抗体检测SOP，主要为：待测样品用统一的稀释液按1∶8比例稀释，56℃灭活30min；于96孔板中2倍系列稀释后，分别与100CCID50的EV7137℃中和2h，每块细胞培养板均设细胞对照、血清对照和病毒对照；加入RD细胞悬液，100μl／孔，细胞终浓度为2×105个／ml，置CO2培养箱中35℃培养7d，将能抑制50%细胞病变的最高稀释度判定为EV71的中和效价，以稀释倍数的倒数表示。
每次试验均设病毒回滴试验，回滴结果在32～320CCID50／孔时，试验判为成立。
以中和效价≥8判为EV71中和抗体阳性，阴性样品的GMTs均按4计算。
1.5实验室内重复性检测各实验室分别采用表1中的EV71病毒株，按照统一的SOP测定10份人免疫球蛋白及10份健康成人血浆样品。
试验重复3次。
1.6实验室间重复性检测A、B、C3个实验室分别采用A实验室统一分发的EV71病毒株A-01（C4基因型，分离自2008年北京地区），按照SOP测定15份EV71动物高效价免疫血清样品。
1.7不同EV71病毒株对中和抗体检测的影响各实验室分别采用表1中的EV71病毒株，按照SOP测定20份健康成人血浆和10份人免疫球蛋白样品。
1.8统计学分析检测结果均汇总至中国药品生物制品检定所，解盲后应用SPSS10软件，计算抗体几何平均滴度（GMTs）和变异系数（CV），并将中和效价取对数后进行配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。