【原创】抗体工程系列一：pH-sensitvie结合型抗体在抗体药物优化设计中的应用
01-治疗性抗体研发的进展和关键技术
01-治疗性抗体研发的进展和关键技术治疗性抗体是一种通过靶向特定分子或细胞表面分子来治疗疾病的生物药物。
近年来，随着生物技术和基因工程技术的进步，治疗性抗体研发取得了显著的进展。
本文将介绍治疗性抗体研发的进展和关键技术。
一、治疗性抗体研发的进展治疗性抗体研发的进展主要体现在以下几个方面。
1.抗体工程技术的发展抗体工程技术是治疗性抗体研发的核心技术，它包括人源化抗体、重链抗体、单链抗体等多种技术。
人源化抗体通过将小鼠抗体人源化，使其更适合在人体内使用。
重链抗体通过只表达重链而不表达轻链来减小分子的体积，提高肿瘤渗透性。
单链抗体则通过将两个链的抗原结合位点连接成一个链来提高抗体药物的渗透性和稳定性。
2.靶向治疗策略的发展单一抗体治疗已经不能满足临床需求，因此，针对不同靶点同时应用多种治疗性抗体的组合治疗策略逐渐被采用。
此外，还出现了针对癌症干细胞、免疫抑制分子等新靶点的治疗性抗体。
3.抗体药物研发的快速发展抗体药物的研发速度逐渐提高，成功开发出多种治疗性抗体，如临床上已经应用的西妥昔单抗、曲妥珠单抗等。
此外，抗体药物的研发不仅局限于单一的治疗领域，还涉及到多种疾病的治疗。
二、治疗性抗体研发的关键技术治疗性抗体研发的关键技术是保证其临床应用效果的重要因素。
1.高通量筛选技术高通量筛选技术是寻找高活性和高亲和力的抗体的关键技术。
通过结合自动化设备和大规模结果分析，可以快速筛选出具有良好生物学活性和亲和力的抗体药物候选物。
2.重组蛋白质表达技术重组蛋白质表达技术是治疗性抗体研发的核心技术之一、通过重组DNA技术可以在大规模中表达抗体的重链和轻链，从而获得一定量的治疗性抗体。
3.稳定性改进技术抗体药物的稳定性是影响其临床应用效果的关键因素之一、因此，开发稳定性改进技术是治疗性抗体研发中的关键问题。
目前，已经出现了多种稳定性改进技术，如PEG化、Fc片段工程等。
4.靶向破坏靶标技术靶向破坏靶标技术是治疗性抗体研发的重要技术之一、通过研发针对不同分子靶标的治疗性抗体，可以实现对特定细胞或分子的靶向杀灭，从而达到治疗的目的。
抗HPV11病毒样颗粒单克隆抗体的性质鉴定及初步应用
抗HPV11病毒样颗粒单克隆抗体的性质鉴定及初步应用李敏;林知捷;魏旻希;李少伟;夏宁邵;赵勤俭【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2016(36)4【摘要】Objective To quantitatively analyze the characteristics of a panel of murine anti-human papillomavirus(HPV)11 L1-derived virus-like particle( VLP ) monoclonal antibodies ( mAbs ) and establish the mAb-based methods for antigen quality analysis.Methods A panel of 22 murine anti-HPV11 mAbs were characterized in details with their isotype, and binding affinity, conformational sensitivity were examined quantitatively in the direct binding ELISA and Western blot.The hemagglutination inhibition activity of mAbs were identified using the hemagglutination inhibition assay and the pseudovirus ( PsV ) neutralization efficiency were examined quantitatively using the PsV-based neutralization assay.The type-specific, highly conformational sensitive and neutralizing mAbs were selected to be used in the sandwich ELISA assay.Results Based on the quantitative and semi-quantitative results, six type-specific, highly conformational sensitive and neutralizing mAbs (2A2, 4A1-3, 16G7, 14A6, 9C1 and 19C7) were identified.These mAbs, along with 10D6 were screened as the capture mAb or as the detection mAb in the sandwich ELISA.Conclusion The binding affinity, conformational sensitivity and neutralization efficiency of anti-HPV11 mAbs were characterized in details.A mAb-based sandwich ELISAassay (14A6:Ag:9C12-HRP) were developed, which could be used in the in vitro potency analysis of HPV11 VLP-based vaccine.%目的：分析和鉴定抗HPV11病毒样颗粒（ virus－like particle，VLP）鼠源单克隆抗体的性质，筛选性质和生物学活性较优的抗体，并初步应用于抗原或疫苗的质量分析。
抗体工程技术
抗体工程制药（单克隆抗体）抗体是由成熟B 细胞产生的。
抗体的应用：①研究：免疫荧光发检测特定抗原②查验特定病原体③医疗：带有毒素的抗杀伤特定细胞。
McAb 在免疫导向疗法中存在的问题：A 、McAb 均是鼠源性抗体，可产生人抗鼠抗体（HAMA ），加速了排斥反映，在人体内的半衰期只有5-6h ，难以维持有效药物作用靶组织时刻；B 、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的医治浓度。
需要解决的问题：A 、降低McAb 的免疫源性；B 、降低McAb 的相对分子质量。
基因工程包括以下内容①基因克隆技术将全套抗体Ｈ链和Ｌ链Ｖ区基因克隆出来，进行原核表达，挑选特异性的基因②噬菌体抗体库技术；③含人免疫球蛋白的转基因小鼠 广州地域销售抗体占全国的30%，第二是北京和上海（罗氏占绝对优势，鼠抗人CD3单抗是我国唯一品种）。
多克隆抗体：抗原注入—受体动物—产生多种B 细胞—取得多种抗原（通过那个流程咱们能够得出多克隆抗体的B 细胞是不用和骨髓瘤细胞杂交的也自然不用挑选）制备单克隆抗体的大体原理 ：制备：抗原—受体动物—致敏B 细胞+骨髓瘤细胞（PEG ）—杂交瘤（细胞培育（HAT 培育基）—阳性挑选—①体内培育②体外培育）—单克隆抗体；（杂交瘤细胞是为能再生成单抗，细胞活力高；这确实是什么缘故书上说单克隆抗体的技术原理是基于动物细胞融合技术得以实现的）（1）抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原；不需纯化；化学合成或提纯；微生物或细胞可直接作为抗原免疫动物：BALB/c 小鼠和Lou 大鼠；Balb/c 小鼠，8-12周龄；雄性；动物与骨髓瘤同品系；佐剂:弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂免疫方式（Attetion:是免疫不是培育）：①体内免疫:免疫原性强,抗原量多.皮下,腹腔注射免疫。
②体外免疫:不能用体内免疫的杂交瘤细胞株、不稳固初步免疫和增强免疫→测定抗体效价→处死小鼠,去脾细胞（2）细胞融合—骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 (HGPRT)缺点型）应和免疫动物属于同一品系，如此杂交率高—饲养细胞：在组织培育中，单个或少数分散的细胞不易生长繁衍，假设加入其他活细胞那么可增进这些细胞生长繁衍，所加入的细胞称饲养细胞。
生物技术制药复习题
生物技术制药复习题第一章绪论第一节生物技术的发展史1、生物技术：以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有与其性状的新物种或新品系，并与工程结合，利用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一个综合性技术体系。
它的范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。
基因工程是生物技术的核心。
P12、蛋白质工程----第二代基因工程；海洋生物技术-----第三代生物技术P13、生物技术发展史：传统、近代（抗生素、发酵罐）、现代（DNA重组）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重组技术1975年，Koher 和Milstein 建立了单克隆抗体技术1982年，第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市1989年，我国第一个基因工程药物干扰素批准上市2003年，中国的重组腺病毒-p53注射液成为石阶上第一个正式批准的基因治疗药物。
第二节生物技术药物1、生物技术制药：生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
P42、生物技术药物：采用DNA重组技术活其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。
它与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品共同归为生物药物。
3、现代生物药物分为4类：重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；基因药物；天然药物；合成与部分合成药物。
4、生物药物按用途分为：治疗药物；预防药物；诊断药物。
5、生物技术药物的特征：（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强、疗效高；（4）稳定性差（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络性效应；（10）检验的特殊性。
第三节生物技术制药1、生物技术制药的特征：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。
P52、生物技术在制药中的应用有哪些？P7（1）基因工程制药：① 开发基因工程药物，如干扰素（IFN）、红细胞生成素（EPO）等②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗③基因工程抗体，它可以作为导向药物的载体④基因诊断与基因治疗⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型⑥应用极影工程激活素改良菌种，产生新的微生物药物⑦改进药物生产工艺⑧利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。
抗体工程技术在药物研发中的应用与发展
抗体工程技术在药物研发中的应用与发展随着科学技术的不断进步，抗体工程技术在药物研发领域中扮演着越来越重要的角色。
抗体工程技术通过利用人工合成的抗体，可以针对疾病的特定靶标，同时具有较高的特异性和亲和力。
本文将探讨抗体工程技术的应用及其发展前景。
一、抗体工程技术的基本原理抗体工程技术是利用基因重组方法，将人工合成的基因片段导入到细菌、哺乳动物细胞或植物细胞中，通过这些细胞表达、生产特定的抗体。
抗体工程技术研究的重点是抗体的变异区域，即免疫球蛋白的组成部分，其中嵌合抗体和人源化抗体的构建是当前常见的研究方向。
嵌合抗体是通过将人工合成的变异区域与常见的抗体框架结合，产生具备特定功能的抗体。
人源化抗体则是通过将动物源性的变异区域转化为与人体免疫系统兼容的成分，从而降低免疫反应的发生率。
二、抗体工程技术在药物研发中的应用1. 肿瘤治疗抗体工程技术在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。
利用特定的抗体，可以将药物直接传递到肿瘤细胞，并抑制其生长和扩散。
这种靶向治疗通过减少对正常细胞的伤害，提高了治疗效果，同时减轻了患者的不良反应。
2. 自身免疫疾病治疗抗体工程技术还可以用于自身免疫疾病的治疗。
例如，通过人源化抗体的构建，可以抑制患者自身免疫系统对身体组织的攻击。
这种治疗方法已在类风湿性关节炎、银屑病等疾病的治疗中取得了显著的效果。
3. 传染病治疗抗体工程技术还可以应用于传染病的治疗。
通过人工合成的抗体，可以直接作用于病原体，阻止其进入宿主细胞，从而抑制疾病的发展。
这种方法已在艾滋病、流感等传染病的治疗中得到了广泛应用。
三、抗体工程技术的发展前景随着科技的不断进步，抗体工程技术在药物研发中的应用前景日益广阔。
目前，研究人员已经开始探索基因编辑技术在抗体工程中的应用，这将进一步提高抗体的亲和力和特异性。
此外，越来越多的研究表明，个体的基因变异与药物的疗效和不良反应密切相关。
因此，抗体工程技术的发展也将有助于实现个体化治疗，为每个患者提供最适合的药物治疗方案。
抗体药物设计的优化策略
抗体药物设计的优化策略抗体药物的设计与优化是现代生物医药研究中的重要领域。
随着免疫治疗在癌症、自身免疫疾病和感染性疾病等方面的成功应用，抗体作为治疗手段日益受到广泛关注。
为了提高抗体药物的效率和安全性，科学家们不断探索多种优化策略。
本文将从不同的角度探讨抗体药物设计的优化策略，包括结构优化、亲和力改造、选择性增强、免疫原性降低及生产工艺优化等。
结构优化抗体的功能主要依赖其三维结构，因此，合理的结构优化是提高抗体药物效果的重要环节。
在这一过程中，研究者们主要关注以下几个方面：重组DNA技术通过重组DNA技术，可以实现对抗体基因进行精确修改以构建新的抗体变体。
这种方法可以对抗体进行人源化，提高其在临床应用中的适应性。
例如，将小鼠抗体的可变区序列重组为人源性序列，可以显著降低免疫原性。
蛋白质工程蛋白质工程技术能够在特定位点引入氨基酸突变，从而改变抗体的稳定性和功能。
通过计算机辅助设计（CAD）和分子动力学模拟等方法，研究者可以预测突变对抗体性能的影响，从而设计出具有更高特异性和亲和力的抗体。
创新架构随着对抗体结构理解的深入，研究者开始设计新的抗体架构，例如双特异性抗体、单域抗体等。
这些新型结构可同时靶向多个标志物或细胞，提高治疗效果，并降低耐药性的发生率。
亲和力改造亲和力是决定抗体效果的重要参数。
优化抗体的亲和力通常采用以下几种策略：定向进化定向进化是一种模拟自然选择过程的方法，可以通过在细胞中随机突变并筛选出高亲和力抗体。
这一方法能够有效地提升抗体与靶标间的结合能力，并在实际应用中获得了良好的成果。
酶促衍生近年来，酶促衍生技术逐渐被探索用于亲和力提升。
利用特定酶促进抗体与小分子靶点结合，并通过反应聚合得到具有更高亲和力和稳定性的抗体。
单细胞测序单细胞测序技术为亲和力优化提供了新的思路。
通过分析大量单细胞中产生的不同抗体，可以快速筛选出高亲和力的单克隆抗体。
这一技术不仅提高了筛选效率，也为个性化医疗奠定了基础。
抗体优化方法
抗体优化方法
抗体（antibody）优化是指通过改良抗体的结构、亲和性、稳定性等性质，以提高其在治疗、诊断或实验等方面的效能和特异性。
以下是一些常见的抗体优化方法：
亲和力成熟：
通过定向演化（Directed Evolution）或随机突变，提高抗体与靶标结合的亲和力。
这可以通过使用蛋白工程技术或体外进化技术实现，以筛选出具有更高亲和力的抗体变种。
人源化：
使抗体更接近人体自身抗体的结构，以降低免疫原性和提高在人体内的生物相容性。
这通常包括将小鼠源抗体人源化，通过改变抗体的框架区域或引入人源抗体片段。
Fc区域优化：
通过改变抗体Fc区域的结构，可以调整其在免疫系统中的清除速度、细胞毒性和效应器功能。
这有助于优化抗体的药代动力学和药效学特性。
稳定性改进：
提高抗体的物理和化学稳定性，以增加其在贮存和使用过程中的稳定性。
这包括避免蛋白质聚集、氧化和降解等问题，以延长抗体的使用寿命。
特异性增强：
通过选择性的突变或改变抗体的结构，优化其对靶标的特异性。
这有助于减少交叉反应，提高治疗和诊断中的准确性。
多功能性引入：
引入适当的改变，使抗体具有多个功能，如同时具有结合两个不同靶标的能力，或者激活免疫系统的能力。
这有助于提高抗体的治疗效果。
结构生物学和计算学方法：
利用结构生物学和计算学方法，如晶体学、模拟和建模，来理解和优化抗体的结构。
这些方法可以指导有针对性的改变，以提高抗体的性能。
以上是一些常见的抗体优化方法，这些方法可以根据具体应用的需要进行组合和调整，以获得更理想的抗体产品。
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【原创】抗体工程系列一：pH-sensitvie结合型抗体在抗体药
物优化设计中的应用
编者按
抗体工程学的快速发展在改善抗体药物活性、特异性、药代动力学性质等方面发挥了巨大作用，同时拓展了抗体药物的应用领域。
近十几年来，围绕抗体与FcRn的pH-sensitve binding的特点，多家药企发展了明显延长半衰期的工程抗体技术平台。
本文对此进行简单梳理介绍。
由于抗体与FcRn的结合是pH敏感型的形式，抗体通过胞饮作用进入细胞，在酸性pH的内涵体中，抗体与FcRn结合，FcRn介导抗体回到细胞外，在胞外中性pH条件下，与FcRn解离。
这样FcRn避免了其他血液中蛋白通过胞饮作用进入细胞内被溶酶体降解的命运，从而达到长效目的，半衰期长达几周（IgG1、IgG2、IgG4半衰期三周，IgG3为9天）。
多家药企尝试改造抗体以特异性提高低pH条件下与FcRn的亲和力，达到进一步长效化的目的。
本文统计了该领域的主流技术平台，介绍其技术特点及相应在研药物的进展情况：
一、MedImmune的YTE
MedImmune是最早开发pH高敏感型抗体的药企之一，其技术同样是通过Fc几个氨基酸的突变（M252Y/S254T/T256E，因而该技术命名为“YTE”），达到特异性提高低pH条件下抗体与FcRn的结合力，从而可以延长半衰期。
如处于二期研究阶段MEDI8897，给药频率可以达到3个月一次。
二、Xencor的Xtend技术平台
Xencor的Xtend技术平台，通过个别氨基酸突变（如M428L/N434S），进一步提高低pH条件下抗体与FcRn的结合力。
Xencor将该技术平台与双特异性抗体技术平台结合，开发长效肿瘤免疫抗体PD1/CTLA4双特异性抗体XmAb20717，目前处于临床前研究阶段，预计2017年底完成IND申请。
三、Genetech的技术
Genetech的技术集中在434位氨基酸上，发现N434W可以同时提高pH=6.0和pH=7.4的抗体与FcRn的亲和力，从而对半衰期无作用。
N434A则特异性的提高了pH 6.0条件下抗体与FcRn的亲和力，从而延长了2.3倍半衰期（恒河猴）。
四、中外制药SMART-Ig技术平台
中外制药采取了一种独特的技术途径，改造抗体与抗原的结合为pH敏感型，而非FcRn的结合。
SMART-Ig的限制是需要对不同抗原进行特定的设计，普适性不如基于FcRn的技术，但由于其独特的设计原理可达到不同的目的：再循环抗体和Sweeping antibody（有效降低血液中抗原的浓度）。
4.1 再循环抗体
传统抗体与膜固定抗原结合后，复合物会在溶酶体中降解，抗体药物半衰期因而缩短。
再循环抗体与膜固定抗原的结合为pH敏感型，
细胞外环境中性条件下，抗体与膜固定抗原紧密结合，复合物进入酸性pH的内涵体后，抗体药物与抗原解离，在FcRn介导下，抗体重新回到细胞外。
如此，再循环抗体可以多次完成该循环，介导降解抗原而自身不被降解，从而可以延长半衰期。
该技术原本是在试图延长现有药物Actemra (Tocilizumab，托利珠单抗)的半衰期时发明的，优化路径为把CDR的一个酪氨酸突变为碱性的组氨酸（酸性条件下，组氨酸带正电，与IL-6结合位点的正电荷互相排斥，从而解离），形成的抗体药物即为SA237。
Actemra是一种IL-6R抗体，用于治疗RA，2005年获得FDA批准，2015年销售额14亿美元。
Il-6R是一种合成速度很快的膜固定抗原，这就导致托利珠单抗会消耗很快，半衰期相应缩短。
优化后的SA237通过再循环，大幅度延长了Actemra的半衰期，目前处于三期临床研究阶段。
4.2 清除抗体（Sweeping Antibody）
传统抗体与游离抗原结合后，通过胞饮作用进入细胞，复合物在FcRn介导下会再回到保外。
Sweeping antibody与游离抗原结合后，通过胞饮作用进入细胞，复合物在酸性环境的内涵体内会解离，抗体在FcRn介导下回到保外，抗原则被降解。
Sweeping antibody不仅可以阻断抗原与其效应因子的作用，还可以直接清除抗原本身，这样可以降低抗体药物剂量，并能有效降低抗原浓度，从而提高药效。
五、亚力兄的ALXN1210
Soliris（Eculizumab，依库组单抗）是亚力兄开发的C5抗体，用于治疗PNH、aHUS，是最成功的罕见病药物之一，2015年销售额
25亿美元。
亚力兄目前正积极开发新一代C5抗体ALXN1210。
更多信息可参见前文：补体抑制剂药物研发格局研究报告。
C5是血浆中含量很高的一种补体蛋白，根据文献知道其血浆浓度为70-140ug/ml，因而依库组单抗给药需要大剂量给药，只能采取静脉滴注（皮下注射剂量不足以中和血浆中大量的C5）。
ALXN1210技术同样提高低pH条件下抗体与FcRn的亲和力，通过多次循环，在内涵体内降解C5，而ALXN1210本身不被消耗。
使得ALXN1210的给药频率可以达到至少每月一次，同时因为剂量低可以实现皮下注射，这样患者可以在家中自己给药，避免的医院护理的麻烦，节省了医疗成本。
围绕活性、特异性、药代动力学等性质，抗体工程改造在新型抗
体药物的开发中取得了许多进展。
糖基化改造、structure-based改造等是最为常用的技术手段，产生了一系列前景看好的技术平台和候选药物。
pH-sensitve binding性质改造是抗体工程中一个分支，主要围绕改善药代动力学特征。
当然也出现了中外制药和亚力兄这样，以清除某些血浆含量高的靶标如IgE、C5等为目的的抗体药物。
期待相应技术平台的长效化抗体药物能早日上市，造福患者。
感谢Jone提供的支持。
作者信息
Armstrong
小编公众号：Biopharm2016
小编团队：Armstrong、医药局外人、Fairy、Jone。