小鼠脐间带充质干细胞培养方法
脐带间充质干细胞制备操作规程
1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。
去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。
充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。
静置培养7天。
第8天根据生长情况，进行换液、传代。
2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。
用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。
3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。
1200rpm，离心6min，弃上清。
合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。
根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。
1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。
加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。
弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。
冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。
利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
脐带间充质干细胞培养操作细则
脐带间充质干细胞分离培养操作细则一、样本接收1.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。
2.查看客户信息是否与交接表一致。
3.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。
二、脐带间充质干细胞分离与接种1）准备耗材试剂：10cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、50ml注射器针头、封口膜、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、生理盐水、75%酒精（已过滤）。
2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、离心机3）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。
4）将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，电动移液枪、移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中，无菌棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。
50ml、15ml离心管放到离心管架上，10cm皿5-7个。
将装有灭菌器械的灭菌盒喷酒精擦拭放入生物安全柜中。
5）取5个10cm皿依次摆开，1，2，4，5号皿依次加入适量的生理盐水，3号皿加入适量的已过滤的75%酒精。
拿出灭菌盒中已灭菌的止血钳，将脐带从保存瓶中取出放到第一个皿里，并取适量样本保存液留样送检支原体。
使用两个止血钳将脐带在第一个皿里清洗尽量去除脐带外表面的血污以及动静脉的血液和血凝块，将脐带转移至2号皿中，同样的方法再次清洗一次并测量其长度。
6）将清洗干净的脐带转移到装有已过滤75%酒精的3号皿中浸泡1min左右（不要超过两分钟），计时结束后，将脐带转移至4号皿中，同样的洗涤方法去除酒精。
清洗结束后将脐带剪成1-2cm短节，放入5号皿中，再次洗涤尽量去除血管内的血污。
再次拿两个10cm皿，加入适量的生理盐水，去一皿的盖子加少许盐水湿润底部及可。
7）将1-2cm的脐带小段转移到新的皿里，用带齿口的镊子取一段脐带，将脐带展开，再按血管走势剔除脐带的两条动脉，一条静脉。
脐血间充质干细胞的培养
脐血间充质干细胞的培养
一、试剂：
胰酶、DMEM/F12培养基、胎牛血清、冻存管及二甲基亚砜(DMSO)、淋巴细胞分离液( 比重1.077g/cm3 ) 。
二、人脐血MSCs 分离和培养
1、无菌条件下采集脐带血，每份40～100 ml，肝素抗凝(20 U/ ml)，所有标本要求在6 h 内分离接种。
2、将人脐血沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液(比重1. 077 g/ cm3 )上，2000 r/min 离心20 min (离心半径15 cm)，取中间白膜层，PBS 洗涤2 次。
3、取洗涤后细胞1×107个接种于含30 % FBS 的DMEM/F12培养基中，置37 ℃、5 %CO2培养箱中培养，7d 后全量换液，去除未贴壁细胞，以后每隔2d 全量换液1次。
4、当MSCs 达到80 %融合时，1 ∶2 常规消化传代。
三、人脐血MSCs 的冻存和复苏
1、冻存
取第3 代1 ×106个MSCs 加入1 ml 含10 % DMSO 和90 %FBS 的冻存液，吹打均匀后移入冻存管，采用非程序性降温液氮冻存法进行细胞冻存，冻存管依次置于4 ℃冰箱20 min，- 20 ℃冰箱30 min 和- 80 ℃冰箱过夜，第2 d 移入- 196 ℃液氮中冻存。
2、冻存4周后复苏细胞，即从液氮中取出冻存管立即置于37 ℃水浴并轻轻摇动，1 min 内迅速解冻；冻融后的MSCs 加入含30 % FBS 的DMEM/F12 培养基洗涤2次，然后接种到含30 % FBS 的DMEM/F12 培养基中，置37 ℃、5 % CO2培养箱中培养，第2 d 全量换液。
小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢
中国组织工程研究第19卷第6期2015–02–05出版C hi n ese Jo urna l o f Tis sue Engineeri ng Res earch February 5,2015Vol.19,No.6O B x ,S y RT R 5www.CRTER.org侯晓琳，女，1989年生，山西省运城市人，汉族，北京大学航天临床医学院在读硕士，主要从事干细胞移植、消化系疾病方面的研究。
通讯作者：崔梅花，主任医师，副教授，硕士生导师，北京大学航天临床医学院消化科，北京市100049d oi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.007[http://www.crter.o rg]中图分类号:R394.2文献标识码:A 文章编号:2095-4344(2015)06-00854-07稿件接受：2015-01-13Hou Xia o-lin,Stud y ing for ma ste r ’s de gree,Dep artment of Gastroe nterolo gy,Pe king Unive rsity Aero space Sch ool o f C lin ical Me dicine,Beijing 100049,ChinaC orresp ond ing a uthor:Cui Me i-hu a,C hie f ph ysicia n,Asso ciate pro f e ssor,Master ’s su pervisor,De partmen t of Gastroe nterolo gy,Pe king Unive rsity Aero space Sch ool o f C lin ical Me dicine,Beijing 100049,China 53小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢侯晓琳1，郁卫东2，崔梅花1，何湘君2，梁君1(1北京大学航天临床医学院消化科，北京市100049；2北京大学人民医院临床分子生物学研究所，北京市100044)文章亮点：1文章创新性地采用胶原酶消化法联合组织块贴壁法从小鼠脂肪组织中有效、快速分离出了脂肪间充质干细胞，其增殖活力良好，具备间充质干细胞的生物学特性，表达CD29、CD44、CD90，不表达CD45，能够向成骨细胞和脂肪细胞诱导分化。
小鼠间充质干细胞分离培养与纯化
小鼠间充质干细胞一、细胞复苏和接种1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。
2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。
3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。
4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。
5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。
6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。
7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。
8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。
9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。
10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
二、细胞换液和培养注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。
1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。
2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。
3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。
三、消化细胞1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，用前按1：1混合。
将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。
2．具体操作如下：（1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。
1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。
（2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection.2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, /sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days.（二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged.(三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。
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小鼠脐间带充质干细胞培养方法
引言
充质干细胞（me se nc h ym al st em ce ll s，M SC s）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，具有广泛的应用前景。
在生物医学领域，小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的来源之一。
本文将介绍小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，帮助研究人员更好地利用这一珍贵的细胞资源。
原料与试剂准备
1.小鼠脐带组织
2.DM EM/F12培养基
3.胎牛血清（F BS）
4.细胞培养袋
5.1×PB S缓冲液
步骤
1.小鼠脐带的处理
（1）准备一个无菌操作台，并在工作区上喷洒酒精消毒剂，手套等工具也需要经过灭菌处理。
（2）取出小鼠脐带组织，置于无菌的1×P BS缓冲液中，用剪刀剪碎细胞片段。
（3）将小鼠脐带组织片段转移到细胞培养袋中。
（4）加入适量的DME M/F12培养基，保证组织片段被完全浸润。
（5）将细胞培养袋密封，并置于37°C恒温培养箱中，进行消化和悬浮培养，时间约为4-6小时。
2.细胞的收获和培养
（1）将消化后的细胞悬液通过100μm的细胞滤网过滤，去除大颗粒
残渣。
（2）将滤液离心，去除上清液，沉淀的细胞用DM EM/F12培养基洗涤。
（3）将洗涤后的细胞沉淀用适量的D MEM/F12培养基重新悬浮。
（4）将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，每瓶加入适量的培养基和10%
的F BS。
（5）将细胞培养瓶放置于37°C恒温培养箱中，进行培养。
（6）每2-3天更换一次培养基，保持细胞的健康生长。
3.细胞的传代与冻存
（1）当细胞达到80-90%的密度时，将培养瓶内的细胞用1×P BS缓
冲液洗涤。
（2）用胰酶对细胞进行消化，停止细胞的生长。
（3）加入适量的DME M/F12培养基，将细胞悬液转移到新的细胞培养
瓶中。
（4）将细胞培养瓶放置于恒温培养箱中继续培养。
4.脐带间充质干细胞的鉴定
（1）使用流式细胞仪对培养的小鼠脐带间充质干细胞进行免疫鉴定。
（2）选择适当的免疫标记物，如CD44，C D90，CD105和CD34等进
行细胞表面标记。
（3）根据免疫标记物的阳性率来评估细胞的纯度和有效性。
结论
小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的研究资源，在生物医学领域具有
广泛的应用前景。
本文介绍了小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，从样品
处理、细胞的收获和培养、细胞的传代与冻存、以及细胞的鉴定等方面进
行了详细的介绍。
希望这一方法能够帮助研究人员更好地利用小鼠脐间带
充质干细胞，推动生物医学的发展与进步。