质粒和载体的关系
质粒载体的特点及应用
三、质粒载体的构建及特点
1．天然质粒用作克隆载体的局限性
天然质粒，一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造 的质粒。在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有ColE1 、pSC101等。 鉴于天然质粒用作基因克隆载体存在着不同程度的局限性，科学工作 者便在其基础上进行了修饰改造，发展出了一批低分子量、高拷贝、 多选择记号的质粒载体。 现行通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改建而成的。
③质粒对宿主生存并不是必需的 质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿 主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞在特定条件下生 存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分 解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药 性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存 繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。
4、质粒载体不稳定性
分离的不稳定性
DNA的缺失、插入和重排都是造成质粒载体结构不稳定性 的原因。
结构的不稳定性
在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，也是导致质 粒不稳定性的重要原因。
影响质粒载体稳定性的主要因素
(1)新陈代谢载体稳定性的影响 (3)寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应
都能便利的加以检测
如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因。将受体细胞放在含有 该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的 受体细胞才能存活。
质粒的基本知识
质粒 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。
这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。
没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。
基因表达载体复制原点作用
基因表达载体复制原点作用基因表达是在细胞内进行蛋白质合成的一个过程，基因表达载体则指的是一种质粒或病毒，它能够将外源DNA转录成RNA，并翻译成蛋白质。
这些载体通常被用于常规实验室技术，例如在重组DNA技术中添加特定的DNA片段等。
基因表达载体需要一个复制原点进行复制，其作用是什么呢？复制原点是某些基因表达载体的一个重要组成部分，它在载体的稳定性和复制中起到关键作用。
下面我们将详细探讨它的三个作用。
1.质粒复制基因表达载体中的复制原点提供了开创分子复制的起点。
当质粒进入细胞时，里面的DNA有助于细胞在细胞分裂过程中改变或保持DNA 序列。
复制原点是质粒DNA一部分，它允许质粒的整个DNA序列能够被复制。
这个过程是精确和可靠的，并且能够在一定时间内进行。
质粒复制通常是在细胞分裂过程中完成的。
2.质粒稳定性复制原点也有助于基因表达载体的稳定性。
质粒DNA不固定，可变，需要稳定性以避免基因重组和丢失。
复制原点可以帮助质粒保持稳定性。
例如，基因表达载体EGFP，其中的复制原点能够确保其DNA 的稳定性，并保证基因表达良好，让实验结果更加准确。
3.增加载体数量复制原点还能够增加基因表达载体的数量。
它能够确保在细胞分裂时，复制原点会被复制，而复制的质粒也会被分发到新形成的细胞中。
这样一来，新细胞就拥有了原始细胞中的所有质粒和基因表达载体，数量也得到了增加。
这个过程对于一些需要高剂量的药物、蛋白质等的生产非常重要。
总之，复制原点作为基因表达载体的重要组成部分，其功能不仅仅是质粒复制，还能提高基因表达载体的稳定性和数量。
这为生物学家提供了一种有用的工具，以便更好地研究各种细胞和疾病的发展过程，从而更好地理解人类生命的本质。
基因工程载体
基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到能够自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)确实是携带外源基因进入受体细胞进行繁育和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种要紧类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒〔cosmid〕载体基因工程对载体的要求〔1〕在宿主细胞内能独立复制。
〔2〕有选择性标记。
〔3〕有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不阻碍载体的复制。
〔4〕分子量小，拷贝数多。
〔5〕容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依靠于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞那么不能存活，而宿主即使没有它们也能够正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常显现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA〔cccDNA〕②开环DNA〔open circular,ocDNA〕③线形DNA〔linear,lDNA〕〔二〕质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套操纵细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒〔性质粒或F因子〕甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了操纵细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒〔抗性质粒〕、Col质粒〔细菌素养粒〕。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状〔resistance〕。
Col质粒：细菌素通过与敏锐细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
重组质粒构建注意事项
重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。
下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。
1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。
因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。
一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。
2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。
在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。
因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。
3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。
在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。
因此，设计合适的引物非常重要。
引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。
此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。
4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。
常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。
在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。
5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。
在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。
此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。
质粒与基因治疗
质粒与基因治疗摘要:基因治疗是与传统治疗完全不同的一种新型治疗方法,它针对的是疾病的根源即基因,开创了医学的新纪元。
在基因治疗中载体是不可缺少的基因转移工具。
质粒作为一类非病毒载体,有着安全性高,制备简单、方便快捷等优点,因此是现今最主要也是被广泛地用于基因治疗的一类载体。
本文综述了质粒的特点以及它在基因治疗中的应用机理、应用现状和应用前景。
关键词:质粒基因治疗载体从20世纪70年代初基因工程诞生以来,其发展都与克隆载体的发现及构建有密切关系。
要把一个目的基因通过基因工程手段送进生物细胞中,需要运载工具,这个携带目的基因进入受体细胞中的工具就称为载体(Vector)[1]。
质粒(Plasmid)就是目前应用最广泛的一类基因克隆载体,它种类多,在自然界种群中分布复杂。
它是细胞内独立于染色体外存在于胞质中的遗传物质,能自行复制而传递许多世代,分子量仅为染色体DNA的0.3%～0.5%。
质粒同染色体一样,是遗传和变异的物质基础,但又有别于染色体,有它自己的特点,能进行自我复制外,还可通过细胞接合等途径在不同质粒种类或个体间进行转移。
获得质粒的细胞即获得质粒编码的生物学性状,如耐药性、产生细菌素等性状,而失去质粒即失去其控制的生物学性状。
1 基因治疗基因治疗,就是将有治疗价值的基因构建到特定的载体中,再导入人体细胞,纠正人体自身基因结构或功能上的紊乱,或抑制外援致病遗传物质的复制,达到治疗目的[2]。
1990年9月14日,美国政府批准了世界上第一项人类基因治疗临床研究方案,对一名患有重度联合免疫缺陷症(SCID)的四岁女童进行基因治疗并获得成功,从而开创了医学的新纪元。
目前,已有为数众多的人类基因成功地转入各种类型的靶细胞中。
1990年,Wollf等用质粒直接肌肉注射小鼠,并得到表达[3]。
从此揭开了质粒载体用于基因治疗研究的序幕。
传统治疗法针对病人的具体症状进行治疗,而基因治疗则瞄准治病的根本原因即基因,所以基因治疗被认为是制药领域的一场革命。
载体
基因工程的载体载体的特征：在寄主细胞中能够自主复制；有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点插入外源基因片段；在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；载体分子较小，以便体外基因操作；对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件；载体的类型⏹质粒⏹噬菌体⏹其他载体(如:酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物Ti质粒、动物病毒)质粒(plasmid): 多数情况下,质粒是存在于细菌染色体外的小的双链闭合环状DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞⏹并不是所有的质粒都是环状分子, 在多种细菌中都发现有线性质粒⏹质粒广泛存在于原核生物中, 其大小从相对分子量小于1X106 到大于200X106质粒的形态1) cccDNA—双链闭合环状DNA2) ocDNA—开环DNA3) cDNA—线形DNA（L型）在DNA促旋酶（gyrase）作用下成负超螺旋构型, 在拓扑异构酶I的作用下解旋。
溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）也有解旋作用溴化乙锭插入DNA超螺旋的作用随着插入的溴化乙锭数目增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直至产生环状分子的开放形式. 进一步的插入在双螺旋中引入了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋方向). 为了清楚起见,只表示了双螺旋的一条单链质粒DNA的复制类型⏹严紧型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。
所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝⏹松弛型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。
如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数穿梭载体（shuttle vector) 可以在两种生物体内复制的载体分子质粒的命名规则⏹小写字母p表示质粒（plasmid)⏹p后面的两个大写字母表示发现或者构建该质粒的作者或者实验室名称⏹数字表示编号⏹例：pBR322、pET21、pGEM-T质粒的宿主范围⏹质粒只编码少数几个其自身复制所需要的蛋白质,甚至在许多情况下只编码其中一个蛋白质⏹所有其他复制所需的蛋白,包括DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶等都是由宿主细胞提供的⏹质粒所编码的复制蛋白质定位在ori 附近，因此只有ori 周围的一小部分区域是复制所必需的⏹因此，把质粒的其他部分删除掉，把外源序列加到质粒上，复制仍然可以继续进行⏹质粒的宿主范围是由它的ori 决定的质粒的不相容性⏹在没有选择压力的情况下，两种质粒不能共存于同一个宿主细胞内⏹如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容显性质粒和隐蔽质粒⏹显性质粒(表达型质粒)----除了携带与本身复制和转移有关的基因外, 还携带一些其他的基因, 宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状, 这样的质粒称为显性质粒⏹隐蔽质粒----无异常性状表现出来克隆载体例：pBR322、pUC18、pUC19、pGEM-T表达载体例：pET-21、pGEX⏹质粒DNA的制备碱裂解法、煮沸法、层析柱过滤法碱裂解法原理：在高pH的碱性条件下，染色体DNA和蛋白质变性，质粒DNA由于其超螺旋共价闭合环状结构，尽管其DNA的大部分氢键也断裂，但是双链DNA仍然不会分离，当恢复到中性时，染色体DNA复性，并聚集形成不可溶的网架。
基因工程载体
第三章基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制。
（2）有选择性标记。
（3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA（cccDNA）②开环DNA（open circular,ocDNA）③线形DNA（linear,lDNA）（二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
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质粒和载体的关系
质粒是指在细胞质内具有自主复制能力的一类DNA分子，通常被用作基因克隆和基因表达等生物学实验中的载体。
载体是指能够携带外源DNA并进行转移、复制和表达的一类生物分子，其中质粒是最常用的一种载体。
质粒和载体的关系可以通过以下几点来说明：
1. 质粒是载体的一种形式。
质粒作为一种能够独立复制的DNA 分子，可以携带外源DNA序列，并被用作基因工程和遗传学实验中的载体。
在细胞内，质粒可以复制自身，同时也可以复制携带的外源DNA序列，从而实现基因表达等功能。
2. 载体可以是多种类型的分子。
除了质粒以外，还有病毒、贝壳蛋白、脂质体等分子可以作为载体。
不同类型的载体具有不同的特点和应用范围，但质粒作为一种常用的载体，因其构建简单、易于操作等特点，被广泛应用于生物学实验。
3. 质粒和载体的选择取决于实验需求。
在进行基因克隆和基因表达等实验中，研究人员需要根据实验所需的外源DNA序列大小、表达强度、转染效率等因素，选择适用的质粒载体。
同时，还需要考虑质粒在目标细胞中的稳定性、毒性等因素，以确保实验结果的准确性和可重复性。
综上所述，质粒是载体的一种形式，作为常用的载体之一，广泛应用于生物学实验中。
质粒和载体的选择应根据实验需求进行，以确保实验结果的准确性和可重复性。