蛋白实验技术——免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤流程
免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。
之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。
b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。
2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。
抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。
3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。
4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。
b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。
6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。
b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。
7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。
8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。
9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。
10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。
根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。
需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。
因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化检测法
免疫组化检测法免疫组化检测法是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测和定量分析细胞或组织中特定分子的存在和表达水平。
本文将介绍免疫组化检测法的原理、步骤和应用领域。
免疫组化检测法是基于免疫学原理的实验技术，通过特异性抗体与目标分子的特异性结合来实现对目标分子的检测。
该方法可以检测蛋白质、多肽、抗原、细胞因子等多种生物分子的存在和表达水平。
免疫组化检测法的步骤主要包括样品制备、抗体染色和结果分析。
首先，需要对样品进行固定、包埋和切片等处理，以保持样品的形态和结构。
然后，将抗体与样品中的目标分子进行特异性结合，通常可以使用一抗和二抗的结合方式。
一抗与目标分子结合后，再使用与一抗结合的二抗进行染色。
最后，通过显微镜观察染色结果，根据染色的颜色和位置判断目标分子的存在和表达水平。
免疫组化检测法在生物医学领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究细胞和组织中不同分子的表达情况，帮助科学家了解生物分子在细胞和组织水平上的分布和功能。
其次，免疫组化检测法可以用于诊断疾病，例如通过检测肿瘤标志物的表达情况来辅助肿瘤的诊断和分期。
此外，该方法还可以用于药物研发，如通过检测药物对特定分子的影响来评估药物的疗效和毒副作用。
在免疫组化检测法的应用中，需要注意一些问题。
首先，选择合适的抗体非常重要，需要确保抗体的特异性和亲和力。
其次，样品的处理要细致并且标准化，以保证实验结果的准确性和可重复性。
此外，对于染色结果的分析和解读也需要经验和专业知识的支持。
总结起来，免疫组化检测法是一种重要的实验技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
它通过特异性抗体与目标分子的结合来实现对分子的检测和定量分析。
免疫组化检测法的应用范围广泛，可以帮助科学家了解生物分子的分布和功能，辅助疾病的诊断和分期，评估药物的疗效和毒副作用。
在应用过程中，需要注意抗体的选择、样品的处理和结果的分析解读等问题。
通过免疫组化检测法的应用，可以更好地理解生物系统的复杂性和疾病的发生机制，为生物医学研究和临床诊断提供有力支持。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以让科学家们观察到细胞内部的微小世界。
那么，这个神奇的过程到底是怎么进行的呢？下面就让我们一起来揭开免疫组化的神秘面纱吧！我们要了解一下什么是免疫组化。
简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去识别和标记细胞表面或者细胞内部的一些蛋白质分子。
这些抗体可以是医生们自己设计的，也可以是从动物或者植物中提取出来的天然抗体。
当这些抗体与目标蛋白结合时，就会发生一些特殊的反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
通过观察这些反应，科学家们就可以了解到细胞内部的结构和功能特点。
接下来，我们来看一下免疫组化的完整步骤及各步原理。
首先是样品制备，也就是把待测的细胞样本取出来进行处理。
这个过程非常重要，因为只有处理好的样品才能够被抗体识别和标记。
接着就是抗体制备，也就是把医生们设计好的抗体合成出来。
这个过程需要一定的技术和经验，因为不同的抗体可能适用于不同的细胞类型和目标蛋白。
然后就是抗原检测，也就是把制备好的抗体加入到样品中，看看它们是否能够与目标蛋白结合。
如果结合了，就会发生一些特殊反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
最后就是结果分析，也就是根据观察到的反应来推断出细胞内部的结构和功能特点。
虽然免疫组化看起来很复杂，但是只要掌握了其中的原理和技巧，就可以轻松地完成实验了。
当然啦，在实际操作过程中也会遇到各种各样的问题和挑战，比如说抗体的选择、样品的质量等等。
但是只要我们保持耐心和信心，相信总会找到解决问题的方法的。
免疫组化是一项非常重要的技术，它可以帮助我们更好地了解细胞内部的结构和功能特点。
虽然它看起来有些复杂难懂，但是只要我们认真学习和实践，相信一定可以掌握其中的精髓并取得优异的成绩！。
免疫组化操作方法
免疫组化操作方法免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的表达。
它结合了免疫学和生化学的原则和技术，可以提供对细胞或组织中不同蛋白质的分子特征、活动状态和相互作用的信息。
本文将详细介绍免疫组化的操作方法，包括材料和试剂的准备、标本的制备和固定、抗原检测和可视化等步骤。
材料和试剂的准备1.活体或固定的细胞或组织标本。
2.组织培养基和适当的培养器具。
3.PBS(磷酸缓冲盐溶液)或其他细胞/组织冲洗缓冲溶液。
4.组织切片刀、显微刀片、显微镊子、镊子等操作工具。
5.细胞/组织固定剂，如乙醛、甲醛、乙酸乙酯等。
6.可溶性和固相抗原检测试剂，如抗体、蛋白质等。
7.染色试剂，如荧光染料、酶底物等。
8.实验室耗材和设备。
标本的制备和固定1.如果使用活体标本，如细胞培养物，应先将其转移到无菌培养器皿中，并在适当的培养条件下培养至合适的生长期。
2.对于组织标本，可以通过切片或切块的方式进行制备。
切片时要求切片薄而均匀，一般为5-10μm。
切块时要求尽量保持组织完整性。
3.制备好的细胞或组织标本需要尽快进行固定，以保持其形态和蛋白质的天然状态。
常用的细胞/组织固定剂有乙醛、甲醛和乙酸乙酯。
不同的固定剂选用方法有一定差异，具体应根据实验要求和文献建议进行选择。
抗原检测和可视化1.固定后的标本需要进行脱水和透明化处理，以便于抗原检测的进行。
可以使用乙醇或队列进行脱水处理，然后用透明化溶剂进行透明化处理。
2.抗原检测需要使用抗体识别目标蛋白质。
对于免疫组织化学，常用的抗体类型包括一抗和二抗。
一抗为直接与目标抗原反应的抗体，二抗为与一抗结合并由可视化标记物进行信号产生的抗体。
一抗和二抗的选择应根据目标抗原和实验要求进行合理选择。
3.免疫染色前，可进行一些前处理步骤以增强染色效果，如抗体预处理、抗原修复、背景消除等。
4.免疫染色操作中，需要逐层进行抗体处理、洗涤和可视化标记物处理。
一般步骤包括：一抗与标本结合、一次洗涤、二抗与一抗结合、二次洗涤、可视化标记物与二抗结合、最终洗涤。
免疫组化流程
免疫组化流程
免疫组化是一种生物技术，用于研究一个或多个蛋白质的交互性及它的细胞上的定位，从而探究蛋白质在复杂的细胞环境中的功能及其作用机制。
免疫组化是以抗体作为特异性
捕获识别分子的标记物，以检测某一特定的蛋白质在细胞中的形态分布，其主要分为三个
步骤：样本处理、抗体淬取和检测荧光。
1. 样本处理：由于免疫组化需要在细胞环境下完成实验，所以在处理样品前，先要
将细胞或组织悬浮，再利用活细胞分离技术将其分离出来，以制备出水平固定、正常形态
的细胞阵列。
2.抗体淬取：抗体淬取是查找蛋白质在细胞中的分布的主要步骤，将具有指示特定蛋
白质的特定抗体喷射在分离的细胞上是大多数实验的基本过程，抗体可以通过多种不同的
方法混合到细胞上，例如管接收、块接收和碰撞接收。
3.检测荧光：检测荧光是一种利用荧光探针标记抗体和膜蛋白，在荧光显微镜上观察
膜蛋白的分布情况，字膜上的膜蛋白和脱离细胞膜的膜蛋白也可以由不同颜色的荧光探针
标记，从而确定膜蛋白的分布情况。
以上三个步骤合在一起，就能完成免疫组化实验，从而检测蛋白质在细胞中的空间分布，免疫组化还可以用来分析蛋白质如何在细胞周围的其他分子之间相互作用。
这个实验
技术具有高灵敏度、可重复性强和节省时间等优点，可以大大提高细胞内目标蛋白质的分
析能力，同时为细胞医学研究和更深入地研究细胞功能提供重要的实验证据。
免疫组化方法
免疫组化方法
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质
的表达和定位。
其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，再通过
染色或荧光标记等方法来检测抗体与蛋白质的结合情况。
免疫组化方法主
要包括以下几个步骤：1.样品制备：将组织或细胞样品固定、切片或涂片
等处理，以便于后续的抗体结合和检测。
2.抗原修复：对于某些抗原易于
失活或难以检测的样品，需要进行抗原修复处理，如加热、酶解等，以恢
复抗原的结构和活性。
3.抗体结合：将特异性抗体加入样品中，与目标蛋
白质结合形成免疫复合物。
抗体可以是单克隆或多克隆，也可以是直接标
记或间接标记的。
4.洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体和杂质，以减少假阳性的干扰。
5.检测标记：将荧光标记、酶标记或金标记等标记
物加入样品中，与免疫复合物结合，以便于检测和定位。
6.显色或荧光：
通过染色或荧光显微镜等设备，观察样品中的免疫复合物的分布和定位，
以确定目标蛋白质的表达和定位情况。
总之，免疫组化方法是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开
发等领域。
免疫组化实验原理及其步骤
免疫组化实验原理及其步骤大家好，今天咱们聊聊免疫组化实验，这是一个听起来有点高大上的实验，但实际上，它可以用简单的话来解释清楚。
免疫组化实验，简单来说，就是通过抗原抗体反应来识别细胞或组织中的特定蛋白质。
听上去是不是有点神秘？别担心，我们一步步来解开这个谜团。
1. 什么是免疫组化实验免疫组化实验其实就是一种用来观察细胞或组织中特定蛋白质的技术。
想象一下，你在大海里找宝藏，免疫组化实验就像是你用来找宝藏的那把神奇的探测器。
它能帮助我们在复杂的组织中找到目标蛋白，就像在沙滩上找到了隐藏的珍珠一样。
这个过程可以分为几个关键步骤，每一步都至关重要。
2. 实验步骤2.1 准备工作首先，你得准备好样本。
无论是组织切片还是细胞涂片，都要处理得当。
就像是做菜前，你得把所有的食材都准备齐全一样。
样本处理得当，才能保证接下来的实验顺利进行。
2.2 固定和切片接下来是固定。
固定的目的是让样本中的蛋白质不变形，保持原有的状态。
这一步就像是给样本穿上保护衣，确保它们在实验过程中不会跑偏。
然后，将样本切成非常薄的片，这样才能方便后续的操作。
这就像是做蛋糕时，你要把蛋糕切成薄片，好让每一片都能均匀上色。
2.3 阻断非特异性结合在这一步，咱们需要阻断样本上那些可能干扰实验的东西。
这就好比你在派对上，得先处理好背景噪音，才能好好享受音乐。
这里用一些阻断液体，确保后续的抗体只会和目标蛋白结合，不会出现误会。
2.4 加入抗体这是整个实验的核心部分。
我们要用到的抗体，就像是侦探寻找线索。
首先加入一抗，这是一种能特异性识别目标蛋白的抗体。
然后加入二抗，这个二抗就像是给目标蛋白贴上了一个显眼的标签，能帮助我们看到它。
二抗一般会和一种显色剂结合，这样我们就能通过显微镜看到目标蛋白的存在了。
2.5 显色和观察最后，我们要显色。
显色的过程就像是把照片上的黑白图案变成彩色，让一切都变得清晰可见。
通过显微镜观察样本，看看那些我们感兴趣的蛋白质在哪里，就像在寻找隐藏的宝藏一样。
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蛋白实验技术——免疫组化实验步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。
2. 水浴锅。
（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。
8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。
（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复：在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b 沸热修复：电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
c 微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等。
B 酶消化方法：常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。
适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等（四）、免疫组化染色SP法（1）脱蜡、水化；（2）PBS洗2-3次各5分钟；（3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；（4）PBS洗2-3次各5分钟；（5）抗原修复；（6）PBS洗2-3次各5分钟；（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体；（8）滴加一抗50μl，室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时；（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟；（10）PBS洗3次每次2分钟；（11）滴加Ⅱ抗45-50μl，室温静置或37℃1小时；（12）二抗中可加入0.05%的 tween-20；（13）PBS洗3次各5分钟；（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度；（15）PBS或自来水冲洗10分钟；（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；（17）自来水冲洗10-15分钟；（18）脱水、透明、封片、镜检。
（五）、SABC法（1）脱蜡、水化；（2）PBS洗2次各5分钟；（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次；（4）抗原修复；（5） PBS洗5分钟；（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体；（7）滴加Ι抗50μl，室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时；（8）PBS洗3次各2分钟；（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟；（10）PBS洗3次各2分钟；（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟；（12） PBS洗4次各5分钟；（13） DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色；（14）脱水、透明、封片、镜检。
（六）、免疫组化问题解答1、染色过强a 抗体浓度过高或孵育时间过长降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜b 孵育温度过高超过37度一般在室温20-28度c DAB显色时间过长或浓度过高显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准2、非特异性背景染色a 操作过程中冲洗不充分每步冲洗3次每次5分钟b 组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长c 组织中含内原性生物素正常非免疫动物血清再封闭d 血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间3、染色弱a 抗体浓度过低、孵育时间过短提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟b 试剂超过有效使用时间应更换试剂c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释（应防止切片干燥）d 室温太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜e 蛋白封闭过度封闭不要超过12分钟4、染色阴性a 操作步骤错误应重试设阳性对照b 组织中无抗原设阳性对照以验证试验结果c 一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗二抗种属无误（七）免疫组化染色一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃ 1小时）。
（1）二甲苯I、II，各10分钟。
（2）梯度酒精：100%，2分钟 95%，2分钟? 80%，2分钟 70%，2分钟。
（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。
3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：抗原修复液（10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制（1）储备液的配制：A液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000mlB液：枸橼酸21g + 蒸馏水1000ml（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml抗原修复的方法：（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
（2）微波处理技术：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档，5分钟；取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档，5分钟。
（最佳温度为92~95℃）（3）酶消化处理：此略。
抗原修复的注意事项：（1）组织不能干。
（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。
（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
（4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
5．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织。
周围的水分（保持组织呈湿润状态），滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：正常血清配制（或按试剂盒规定的浓度配制）按1：20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50ml+5ml （10%抛洒量）计算。
7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2小时（也可置于4℃冰箱过夜）。
8．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
9．滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。
10．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
11．滴加三抗（SAB复合物），37℃，40分钟。
12．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
13．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。
附：DAB的配制（1）储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成1ml,100ml,50ml，20ml等，—20℃，冻存。
（2）工作液：DAB储备液20ml + PBS 1000ml + 3% H2O2 5ml14．自来水（细水）充分冲洗。
15．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。
16．自来水冲洗返蓝，15分钟。
17．梯度酒精脱水：80%，2分钟 ? 95%，2分钟 ? 100%，2次，5分钟。
18．二甲苯透明：I，II（二甲苯）各5分钟19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。
二．细胞爬片的免疫组化染色：1.取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定20 ~30分钟。
2.蒸馏水浸泡5分钟，2次。
3.打孔液浸泡5分钟。
4.蒸馏水浸泡5分钟，2次。
5.后接前述实验步骤的第6步（正常血清封闭）。
注：第3、4步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。
三．冰冻切片的免疫组化染色：1.新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6mm。
2.载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。
3.如不马上染色，可密封后-20℃保存。
4.染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。
5. PBS洗2次，每次5分钟，(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)。
6. 3% H2o2灭活内源性过氧化物酶，20分钟，避光。
7.用PBS洗2次，每次5分钟。
8.接前面实验步骤第六步。
四．载玻片的预处理：1.洗衣粉液浸泡30分钟，冲洗，晾干。
2.洗液（含强酸、高锰酸钾等）浸泡24小时，冲洗，晾干。
3. APES（1:50丙酮溶液）10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。
4.纯丙酮I，约10秒。
纯丙酮II，约5秒。
5.晾干或烤箱内烤干，备用。
（八）、免疫组化技术的关键问题1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1）组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，（也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定）。