细菌的培养法

实验一细菌的培养法

一般细菌均可用人工方法进行培养，使其生长繁殖，以便进一步观察和研究它们的各种生物学特性。为了获得良好的细菌培养物，在分离培养细菌时，除采用适宜的培养基并考虑到其他的培养条件（如温度、湿度、酸碱度、气体等）之外，掌握各种分离培养和接种的基本技术，也是重要环节。

在土壤、水、空气、以及人和动、植物体中，不同种类的细菌混杂地生活在一起。若要研究其中某种细菌，就必须先将各种细菌进行分离，以得到只含有这一种细菌的纯培养。分离培养细菌的方法有多种，平板划线法即是其中之一。该法主要是借划线而将混杂的细菌在琼脂平板表面分散开，使单个细菌能固定在某一点，生长繁殖后形成单个的细菌集团（即菌落）以达到分离纯种的目的。

当细菌分离成纯种后，常需要接种到有关的培养基中，以测试其各种生物学性状。一般可用斜面、液体和半固体培养基来检验细菌的培养特征，因此接种方法可相应的分为三种。

斜面培养基接种法常用于细菌的大量繁殖，保存菌种，或观察其某些生化特性。琼脂斜面、尿素培养基、双糖铁培养基、柠檬酸盐培养基等具有斜面外形的固体培养基均可用此法接种。

液体培养基接种法可用于观察细菌不同的生长状况，有的呈均匀混浊，有的呈沉淀生长，还有的在液体表面形成菌膜；另外还可以供测定细菌生化特性之用。凡是肉汤、葡萄糖蛋白胨水以及各种单糖发酵管等液体培养基均用此法接种。

穿刺接种法常用于半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基、双糖铁培养基等的接种，前者用于测定细菌的动力，后二者则用于观察细菌的生化反应。

目的要求

1．学习和掌握细菌分离和培养的各种基本技术。

2．进一步熟悉和掌握微生物的无菌操作技术。

材料

1．菌种和培养基

平板划线接种法斜面培养基接种法液体培养基接种法穿刺接种法

菌种葡萄球菌和大肠杆菌

的混合菌液大肠杆菌培养物大肠杆菌培养物

枯草杆菌培养物

变形杆菌培养物

痢疾杆菌培养物

培养基* 普通琼脂平板琼脂斜面培养基普通肉汤培养基半固体琼脂培养基*各培养基的组成及配置方法参见书后附录。

2．接种环、接种针、酒精灯、记号笔、试管架等

方法

1．平板划线接种法

（1）标记在培养皿底玻璃上，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、班级、日期等。

（2）灭菌接种环点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环并放置火焰中烧灼灭菌，如

图1-1，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属环端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火焰，如此2～3次。

图1-1 接种环的灭菌操作

然后将接种环移开火焰，待其冷却。注意，接种环不能距离火焰过远，一般应在距火焰10cm范围之内（视此范围为无菌环境）；灭菌后的接种环不能再碰及他物。

（3）取菌种

左手持装有葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液的试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管棉塞，将试管管口迅速通过火焰2～3次进行灭菌。

将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取一接种环的混合菌液，然后退出菌种管。将菌种管管口再次通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞，放至原来的位置。

（4）分离划线接种细菌（见图3-1）

左手持琼脂平板培养基（将皿盖反放在桌上酒精灯附近），尽量使之直立以免空气中的细菌落入其中，并靠近火焰。右手持接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一细菌薄膜（约占平板面的1/10），视为一区。划线时使接种环与平板面成30～40度角，以腕力在平板表面行轻而快地来回滑动动作。切记，接种环不应嵌进培养基内，避免将琼脂表面戳破。

旋转琼脂平板90度。烧灼接种环，以杀灭环上的残留细菌，将接种环触及培养基表面以使其冷却。灭菌接种环通过薄膜处作连续平行划线（约占平板1/5），此为二区。注意接种环只通过薄膜1～2次，以获取薄膜处少量的细菌。

旋转琼脂平板90度。烧灼接种环灭菌并使之冷却。将灭菌接种环接二区连续平行划线（约占平板1/4），此为三区。接种环只通过二区1～2次以获得少量细菌。

旋转琼脂平板90度。接种环不必再灭菌，接三区连续平行划线，划满平板其余部分，此为四区。

注意各区接种线间尽量互不交接，以达到细菌逐渐稀释的目的。

（5）划线完毕，将琼脂平板放进皿盖，将培养皿倒放（这样可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下，冲散菌落），送进37℃温箱培养。

（6）培养18～24小时后将培养皿取出。观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其

大小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。

1 2

3 4

图1-2 四区划线接种法

2．斜面培养基接种法

（1）用记号笔在待接种的培养管上写明标记。

（2）点燃酒精灯。

（3）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管，使菌种管位于左侧，斜面部均应向上，勿成水平，以免凝结水浸润培养基表面，甚至沾湿棉塞。（4）以右手拇指和食指捏持转动两管棉塞，以便在接种时易于拔取。

（5）右手持接种环，在火焰上烧灼灭菌。

（6）以右手手掌及小指，小指及无名指分别拔取并夹持两管棉塞，将两管管口灭菌。（7）将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上轻轻挑取少量菌苔退出菌种管（注意，一要防止取菌过多；二要防止弄破培养基表面）。再伸进待接种的培养基管，如图3-2进行斜面培养基接种，从斜面底部轻轻向顶端弯曲划线，不要触破培养基表面。沾有细菌的接种环进出试管时不应触及到试管内壁和试管口。

（8）接种完毕，灭菌两试管的管口，塞好棉塞，并放至原来的位置上。重新烧灼接种

环，灭菌后放回试管架上。接种好的试管放37℃温箱培养，18～24小时后观察生长情况。

图1-3 斜面培养基接种法

3．液体培养基接种法

（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。

（2）如斜面培养基的接种方法一样，握持菌种管及待接种的肉汤管。

（3）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻轻研磨，蘸取少量肉汤调和，使菌混于肉汤中（见图3-3）。塞好试管棉塞后，摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。

（4）接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。肉汤管放37℃温箱培养，18～24小时后观察生长情况。

图1-4 液体培养基接种法

4．穿刺接种法

（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。

（2）如斜面培养基接种法，握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。

（3）右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔，如图3-4垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，刺达近管底部，但不必及于管底，然后循原路退出。

（4）接种完毕，接种针重行灭菌后放至试管架上，塞好棉塞，37℃培养18～24小时后取出观察细菌的生长情况。