ecl化学发光显色原理
增强化学发光法
增强化学发光法(ECL)Ecl 显色原理：鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。
在Ecl 底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。
试验步骤：1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。
2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。
3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。
5）显影、定影。
6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。
注意：荧光在一段时间后会越来越弱。
记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己（未交联的丙烯酰胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢毒害你的身体）1.如果WB前没有可参考的资料--比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件（稀释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂；2.去掉积层胶后，预染的Marker可用以识别胶上下方向和膜的正反面（预染Marker如果照着说明书用量，有可能在电泳时看不到条带，但转膜时有浓缩效应而且背景白就可以看到了。
如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量，或者多加1-2倍的量）；如果目标蛋白小，指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留意分清胶上下方向，切个小角是常用的方法。
膜和滤纸一起裁最好（不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀+尺子+垫厚报纸划比较容易）尽量和胶一样大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。
我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm，保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。
3.对于特别小的蛋白，tricine SDS-PAGE电泳有助于提高蛋白大小在1KD-20KD间的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的浓度也不用太高（可参考2004年中国生物工程杂志上有一篇文章（有效分离1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方法）4.转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。
电化学发光原理及优势
80 60
40
20
0 cobas e analyzers Access II ARCHITECT Centaur IMMULITE VISTA LOCI VITROS ECiQ
由于 ECL 技术能适合多种免疫反应原理，其特有 的优势使得罗氏能够开发出大量的检测试剂。
试剂稳定
开瓶有效期长
标本检测时间(分钟)
为什么选择电化学发光技 术
ECL优势
快速的检测时间 可控的反应体系
宽广的检测范围
高精密度和 高灵敏度
低标本检测用量
参考网站
可控的反应体系
信号产生迅速
75 60 ECL信号强度 (‘000 counts) 45 30 15 0 电压 ECL 2.0 1.6 1.2 .8 .4 0 电压(V)
0
0.5
1.0 时间(秒)
1.5
电压作为反应的启动开关能有效的消除由于试剂添加或混匀所带 来的问题从而保证反应稳定而可控的进行
可控的反应
信号产生均一而稳定
化学发光技术 反应启动不均一
电化学发光技术 电压启动反应 信号均一稳定
为什么选择电化学发光技 术
ECL优势之二
快速的检测时间 可控的反应体系
宽广的检测范围
高精密度和 高灵敏度
低标本检测用量
高精密度和高灵敏度
生物素－链霉亲和素特异性亲和作用
生物素作为第二标记物与包被链 霉亲和素的微磁珠结合 生物素与链霉亲和素特异间的特 异性亲和作用是目前已知的最牢固 的非共价生物结合作用 最大限度的捕获待测免疫复合物 大大提高ECL反应的灵敏度
标本检测用量 (ul)
ECL技术因其灵敏度很高，所以标本检测用量很低。
ECL发光液
ECL 发光液简介：ECL 化学发光检测试剂是基于Luminol 的新一代增强型化学发光底物试剂，可与二抗上偶联的辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)催化发生化学反应而发出荧光，结果可以通过X 光片压片和其他显影技术展现或使用Luminometer 检测。
Leagene ECL 发光液为普通的ECL 发光液，比DAB 显色灵敏度高数百倍以上，比Amersham 的ECL 发光液灵敏度高几十倍以上。
在暗房内高丰度蛋白条带的荧光常数小时内仍然肉眼可见，X 线胶片曝光10～30s 即可得到高清晰条带；低丰度蛋白条带荧光肉眼可能不易察觉，但曝光30s~5min 即可检测条带；极低丰度的蛋白条带荧光可允许30min~12h 曝光以检测目的条带。
ECL 敏发光液衰减较慢，15min 内荧光几无减弱，检测时产生的非特异背景非常低，也可节省抗体和待测样品的用量，该试剂可用于PVDF 膜和NC 膜(硝酸纤维素膜)的Western blot 免疫印迹等印迹发光显色。
组成：操作步骤（仅供参考）：1、Western 二抗孵育数次洗涤后，用镊子将膜轻轻取出，用吸水纸略吸去过多的液体(勿接触膜的蛋白面)，然后置于一洁净保鲜膜或恰当容器上。
2、配制ECL 工作液：根据需要量，取HRP Substrate Luminol Reagent 和HRP Substrate Peroxide Solution 等体积混合即为ECL 工作液，室温放置备用，工作液宜在临检测前配制。
注意事项：1、HRP Substrate Luminol Reagent 和HRP Substrate Peroxide Solution 在吸取过程中必须要更换枪头，上述试剂相互污染后会导致HRP Substrate Luminol Reagent 或HRP Substrate Peroxide Solution 逐渐失效，影响后续的使用效果。
20110314电致化学分析
ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合 物混合启动发光反应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活 性。
电化学发光法应主要类型和应用
1. 聚芳香族碳氢化合物及有机物的电化学发光
PAH的激发态是在两个电极的阳极氧化产物和阴极还原产物之间反应所 产生的。PAH类物质的ECL反应一般必须在无水无氧条件下进行，因为该 反应体系在试剂分析测定中的应用很少。
溶剂的选择
DMF、二次水，甲醇、乙醇、丙酮、 二氯甲烷、三氯甲烷、乙醛
量子点的电化学发光
Bard等人在研究有机相中量子嗲的电化学和电化学发 光行为时发现半导体纳米晶体可以在一定的电位下被 氧化和还原，并且通过一定的湮灭反应导致相应的电 致化学发光过程。
氧化态或还原态的量子点可以与溶液中存在的具有氧 化或还原特性的物质产生电子转移反应产生发光。
妊娠37周
光诱导电致化学发光
四烷氧基锌酞菁（ZnPc(OR)4）在红外光照 射下产生单线态氧，光泽精可以探测到单线 态氧并与之反应产生强烈的化学发光信号， 而加入黄酮类化合物后，由于它们对单态氧 的清除作用使化学发光强度得到不同程度的 抑制。根据这一性质，可以建立研究黄酮类 化合物清除单线态氧构效关系的光敏电致化 学发光法（photo-electrochemiluminescence， PECL）
电化学发光剂
定义：通过在电极表面进行电化学反应而发 出光的物质。
特点
反应在电极表面进行 化学发光剂：三联毗啶钌 电子供体为：三丙胺（TPA）
鲁咪咯发光机理
超氧阴离子 自由基
OH
OH
OH
钌联吡啶I发光机理：
ECL原理及仪器
10. 检测结果数据自动传送
11. 可连接中文数据系统
E170
170 测试/小时
25
个试剂通道, 温控在 20°C
样本架传送式进入 利用一次性加样吸头防范样本间交叉污染 同时在仪器上 1008 个吸头和 1008个分析杯 在运行过程中可以随时添加吸头和分析杯， 二维条形码识别系统 试剂包装100/200个测试，自动开盖功能
检测时需对结合相与游离相进行分离，操作步骤多。
反应原理相对落后。
电化学发光免疫技术
电化学发光免疫测定法（ECLIA）发展于 1996年，它在
发光反应中加入了电化学反应，是继放射免疫、酶免疫、
化学发光免疫测定之后的新一代标记免疫测定技术，是
电化学和免疫测定相结合的产物。
世界公认的 最先进 的临床免疫检测技术
•直径最小– 2.8um
•表面积大而均一 •磁性微粒子呈悬浮状态 •使异相反应变成类均相反应 •加快反应速度 •提高反应灵敏度
专利的链霉亲和素-生物素包被技术
链霉亲和素- 生物素间接包被的优势
适用于包被各种化合物，如多肽、脂多糖等。
亲和素包被微粒子高效、均一、稳定、通用。 生物素结合物与标本液相反应。 生物素- 亲和素反应亲和力强。
最大四个模块组合在一起
与全自动生化分析模块（D/P）任意组合
cobas e 601
170 测试/小时
25 个试剂通道, 温控在 20°C
样本架传送式进入 利用一次性加样吸头防范样本间交叉污染 同时在仪器上 1008个吸头和 1008 个分析杯 在运行过程中可以随时添加吸头和分析杯， 二维条形码识别系统
Elecsys 原理及仪器
ecl发光液成分
ecl发光液成分
ECL发光液，也称为增强型化学发光试剂，是一种在生物学和医学实验中广泛使用的检测工具。
其核心作用是在免疫印迹过程中，与HRP（辣根过氧化酶）标记的抗体反应，产生可检测的荧光信号。
这种发光液主要由两个部分组成：A液和B液。
A液主要成分是鲁米诺（luminol）及特制发光增强剂。
鲁米诺，也被称为鲁米诺尔，是一种常用的化学发光底物。
在碱性条件下，它能够被HRP催化并与过氧化氢反应，生成一种激发态的中间体，当这个中间体回到基态时，会发出光子，最大发射波长为425 nm。
特制发光增强剂的作用是增强鲁米诺的发光效果，使其更加明显和稳定。
B液的主要成分是过氧化氢（H2O2）及特殊稳定剂。
过氧化氢在这里作为氧化剂，与鲁米诺反应产生发光的激发态中间体。
特殊稳定剂的作用是保持过氧化氢的稳定性，防止其在未使用时发生分解，从而确保发光液在需要时能够正常工作。
ECL发光液的使用通常是在Western Blot等免疫印迹技术的最后一步。
在加入等量的A 液和B液后，它们会覆盖在PVDF膜等固相支持物上，与HRP标记的抗体发生反应，产生荧光信号。
这个信号可以通过X光片压片、显影技术或者Luminometer等设备进行检测和记录。
总的来说，ECL发光液是一种基于鲁米诺化学发光原理的试剂，通过HRP的催化作用，与过氧化氢反应产生可检测的荧光信号。
它的成分复杂且精细，需要特定的稳定剂来保持其活性和稳定性。
在使用过程中，需要注意按照说明书的要求进行操作，以保证实验结果的准确性和可靠性。
电化学发光简介
1.1 电化学发光简介近年来，电化学发光(ECL)作为一种高灵敏度和高选择性的分析方法已引起人们极大的究兴趣。
电化学发光是指通过电化学方法来产生一些特殊的物质，然后这些电生的物质之间或电生物质与其它物质之间进一步反应而产生的一种发光现象。
它是化学发光方法与电化学方法相互结合的产物。
它保留了化学发光方法所具有的灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点；同时具有许多化学发光方法无法比拟的优点，如重现性好、试剂稳定、控制容易和一些试剂可以重复使用等优点，从而引起人们的注意。
目前，ECL技术已广泛应用于免疫分析、核酸杂交分析和其他生化物质的测定，不仅大大推动了生物化学和分子生物学的研究，而且带来了临床诊断的又一次技术革命。
1.1.2 电化学发光反应原理电化学发光分析是通过电极对含有化学发光物质的某化学体系施加一定的电化学信号（包括电压和电流），一直产生某种新物质，该物质能与体系中存在的化学物质反应或自身进行分解反应，反应不但提供足够的能量，而且还能产生合适的发光体并接受该反应的释放能量，形成激发态发光体，不稳定的激发态返回基态时便发出与该发光体性质相一致的发射光，用光电倍增管等普通光学手段测量发光光谱或发光强度从而对物质进行痕量分析。
如果按激发态分子或离子产生的历程，可将电化学发光分为四种类型。
[7-8]1.1.2.1 通过单重激发态途径的电化学发光（S-Route）一般是在电极上施加一定的电压，是分子R在电压作用下氧化或还原产生R+或R-，然后，R+和R-互相反应产生单重激发态，激发态回到基态时发光。
用方程式表示如下：R → R+ + eR + e → R-R- + R+→ 2R*R*→ R +hv大多数芳香族化合物的电化学发光是按此机理进行。
1.1.2.2 通过三重激发态途径的电化学发光（T-Route）一般是在电极上施加一定的电压，使分子R在电压作用下氧化或还原产生R+或R-，然后，R+或R-互相反应产生三重激发态，激发态回到基态时发光，用方程式表示如下：1.1.2.3 由于共存物质的二次反应的电化学发光溶液内存在的另一种物质与电解产物之间发生氧化或还原反应，生成激发态分子或离子。
ecl显色原理
ecl显色原理
ECL（Electrochemiluminescence）显色原理是指在电化学发光过程中，通过电化学反应在电极表面生成一种激发态的物质，该物质随后发光并产生色彩。
ECL显色原理基于电化学发光的原理，主要分为双极ECL和单极ECL两种类型。
双极ECL是指在双极电极（例如金、铂等）上，电化学活性物质首先被氧化还原反应激发，产生可激发态物质（常为金属离子或有机分子）。
激发后的物质经过激发态传能过程，将激发能量传递给另一组电化学活性物质，激发后的物质通过非辐射跃迁返回基态，产生发光。
单极ECL是指在单极电极（例如玻碳电极等）上，电化学反应激发产生的离子或分子形成激发态，通过电极表面修饰的某种物种（常为有机分子）传递能量，然后产生发光。
总体来说，ECL显色原理是通过电化学反应产生的激发态物质在电极表面发光，实现显色效果。
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ECL（Electrochemiluminescence）化学发光是一种基于电化学过程产生光的现象。
它常用于生化分析、免疫分析、基因检测等领域。
ECL技术的原理如下：
1.电化学过程：ECL基本上是在电化学反应的影响下产生发光。
这涉及到电子传递和离
子移动，通过在电极表面引入可发光的物质。
2.共振能级：ECL发光通常涉及在电极表面上固定的特定分子，这些分子具有称为共振
能级的特殊能级。
这个能级之间的跃迁产生了发光。
3.反应过程：在ECL反应中，通常使用特殊的电化学活性物质，如氧化还原剂和共振能
级发光分子。
当外加电势施加在电极上时，氧化还原反应发生，产生激发态的分子。
然后，这些激发态分子会退回到低能级态，释放出能量，产生光。
4.光产生：在电极表面进行的氧化还原反应导致了激发态分子的产生。
这些分子的跃迁
到基态会释放出光子，从而产生发光。
ECL化学发光显色原理涉及在电极表面的电化学反应，通过电子传递和分子激发，导致发光分子从激发态到基态的跃迁，从而产生发光现象。
这种技术在生物化学和生物医学研究中具有重要应用，尤其是用于检测和测量微量分子。