分子生物学实验技巧

限制性内切酶基础知识

?

?

?

?

如果没有限制性内切酶，当今的分子生物学研究会是个什么样子？40年来，限制性内切酶这个幕后成员默默推动着许多基础生物学研究和商业化应用。限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。通常，限制性内切酶会切割双链DNA。每个限制性内切酶会识别特定的DNA 序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA。识别序列长度通常为 4 - 8 bp，酶切之后会形成粘性末端（5′ 或3′ 突出端）和平末端（图1）。

图 1.特定限制性内切酶切割后形成的粘性或平末端（5′ 或3′ 端）示意图。

如今业内已经鉴定了大约4000 种限制性内切酶，其中超过600种可商业化供应。是一个非常有用的资源库，可查询限制性内切酶全面信息及更新信息，包括限制性内切酶的特异性、灵敏度和商业化来源等。

本页内容：

???

?

?

限制性内切酶发展史

上世纪50 年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异。Grasso 和Paigen 对此的描述如下：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆

菌C）内繁殖的噬菌体λ 感染同一种类的另一菌株（例如，大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K 的感染率出现明显下降。新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域。

直到上世纪60 年代，人们才发现宿主控制变异的机制，其与噬菌体DNA 的酶切有关，进而发现并分离出了限制性内切酶。上世纪60 年代初Werner Arber 观测发现，宿主范围的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA之中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护。这些发现最终催生了限制性修饰(R-M) 体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA 不受甲基化。

颇为有趣的是，大多数R-M 体系的早期研究工作围绕限制性内切酶的Type I 和Type III 基团进行，该分类方法主要依据限制性内切酶的结构和功能（参见）。然而在Kent Wilcox 和Hamilton Smith 发现第一种Type II 级限制性内切酶HindII 之前，限制性内切酶显然还未得到充分利用。HindII 能够识别特定的对称DNA 序列，按照精确的方式切割识别序列内的位点。此功能（大多数早期Type II 限制性内切酶均发现存在此功能）促使Kathleen Danna 和Daniel Nathans 使用HindII 研究猿猴空泡病毒40 DNA ，即所谓的限制性内切酶图谱。

凭借在限制性内切酶方面的开创性研究，Daniel Nathans、Hamilton Smith 和Werner Arber 共同获得1978 诺贝尔生理学或医学奖。随着DNA 连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶家族不断壮大，重组DNA 技术应运而生。

限制性内切酶命名规则

该命名规则综合考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶。例如，HindIII 酶（或者按照早期命名规则命名为Hin d III）代表：

?“H”代表Haemophilus

?“in”代表influenzae

?“d”代表血清型d

?“III”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶（例如，HindII 和HindIII）。

限制性内切酶分类

根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类。表1汇总了各类内切酶的区分特点

表 1.限制性内切酶类别和特性。

由于自身特殊的特点，Type II 限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA 分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。这类内切酶的特殊切割方式使其得以应用在分析，而后者也是法医学研究的基础。连接酶可酶促连接DNA 末端的5′ 磷酸基和3′ 羟基，从而使得DNA可以通过限制性内切酶产生的5′ 磷酸基和3′ 羟基末端进行重排和连接—这也是重组DNA 技术的基本原理。

由于在分子生物学研究方面很有用处，Type II 限制性内切酶成为了研究最多的酶类别，其成为了最大的内切酶类别。目前经过鉴定的Type II 限制性内切酶超过3,500 种，这些酶又被进一步细分成Type IIP、IIA、IIB、IIC、IIS 等子类别——其中的Type IIP 酶可识别回文（对称）靶标序列，是最流行的商业化限制性内切酶。

识别位点和切割特异性

另一个将限制性内切酶进行分类和比较的重要方法是同裂酶和异裂酶。

?同裂酶是具有相同识别序列及相同特异性的限制性内切酶。例如，AgeI 和BshT1 可通过相同的图谱识别和切割5′-A↓CCGGT-3′。但一系列同裂酶可能在首选位点、反应条件、甲基化敏感度和星号活性方面存在差异。

?异裂酶可以识别相同的核苷酸序列，但会在不同的位点切割DNA。例如，异裂酶SmaI (5′-CCC↓GGG-3′) 和XmaI (5′-C↓CCGGG-3′)均可识别5′-CCCGGG-3′ 但切割方式不同，因而产生不同类型的末端（此时，SmaI 产生平端，而XmaI 产生5′ 突出末端）。

识别序列和切割图谱方面的不同使限制性内切酶成为极其灵活、强大的基因材料鉴定和操作工具。

参考文献

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

限制性内切酶关键注意事项

?

?

?

?

限制性内切酶一般反应条件

当进行限制性酶切反应时，为确保最佳的反应条件，务必要遵守限制性内切酶供应商提供的建议。在此过程中需要考虑的重要参数包括：底物(DNA) 和酶的量、反应体积以及孵育时间。

根据传统的定义，在最佳反应条件下，一个单位的限制性内切酶可以在1小时内，在50 μL体系中完全酶切 1 μL 定义底物（例如，质粒pUC19）。尽管单位定义提供了一种测定方式，但还需注意，根据DNA 底物之中的识别序列出现的频率及所用底物类型，针对不同DNA底物使用等量的限制性内切酶可能需要不同的最佳反应条件。实际上，酶供应商往往根据DNA 样本的潜在质量、数量和性质波动，推荐比完全酶切所需量多 5 至20 倍的酶（或 1 μL 酶/反应体积）。

为确保限制性内切酶的有效活性，应按照制造商的建议妥善存储并在过期前使用。通常情况下，应将酶分成小等份，存储在–20?C 条件下的无霜冰箱之中，从而在维持活性的同时最大限度避免反复冻融。DNA 样本应避免接触可能抑制酶并造成其它负面效应的污染物，如核酸酶、盐、有机溶剂（例如，苯酚、氯仿或乙醇）以及洗涤剂。

为避免在–20°C 条件下结冰，限制性内切酶往往采用50% 的甘油溶液形式提供。但甘油自身的粘度可能导致反应配制阶段移液和少量酶加样较为困难。最好是最后添加酶至终体积，添加之后就充分混匀。“用手指轻弹反应管”轻柔混匀，然后短暂离心反应管，可帮助酶在反应混合物中充分扩散，并在反应管底部收集到反应溶液。

在孵育过程中，反应须达到所需的温度，并在整个孵育期间保持恒定。如果使用5-15分钟完全酶切的快速限制性内切酶代替1小时酶切的传统限制性内切酶时，这一点尤为重要。须格外谨慎地密封反应管以避免样本蒸发，否则可能造成孵育时间延长（例如，延长至>1 小时）和体积减少（例如，减少至 <10 μL）。

除了一般的注意事项外，在您进行实验时还需注意限制性酶切的以下方面：

???

?

?

星号活性

星号或“松弛”活性是限制性内切酶的一种固有性质，即在非最优反应条件下，限制性内切酶可能会作用于与其天然识别位点存在细微差异的识别序列。例如，如图1所示，EcoRI 可以识别和切割位点5’-GAATTC-3’，但其星号活性可能导致序列在5’-TAATTC-3’ 和5’-CAATTC-3’ 处被切割。同样，BamHI 除了可切割其正常的识别序列5’-GGATCC-3’ 外，还可切割5’-NGATCC-3’、5’-GPuATCC-3’ 和5’-GGNTCC-3’（其中N 代表任意核苷酸）。

图 1.EcoRI 和BamHI 两种常见限制性内切酶的潜在星号活性或松弛活性。

需特别指出，在最佳反应条件下，“星号”位点的切割率要远远低于正常的识别位点（大约相差105–106）。因此，酶切期间出现星号活性的常见原因为限制性内切酶过量和/或孵育时间过长（过度酶切）。此外，高浓度甘油（例如，>5%）、低浓度盐、非最佳pH、存在有机溶剂，以及除Mg2+之外的二价阳离子都可能造成底物DNA 的非特异性切割。使用酶制造商推荐的实验方案和缓冲液，可避免出现星号活性。

不完全酶切

不完全酶切是在限制性内切酶使用过程中常遇到的问题之一。当酶量过多或过少时，都可能发生不完全酶切。DNA 样本中存在污染物也可能导致不完全酶切。缓冲液组分、孵育时间和反应温度等欠佳的反应条件是不完全酶切的常见原因。

部分限制性内切酶需要辅因子才能实现完全活性。例如，Esp3I (BsmBI) 需要DTT，而

Eco57I (AcuI) 需要S-腺苷甲硫胺酸。AarI 和BveI (BspMI) 等部分限制性内切酶需要两个拷贝的识别位点才能实现有效切割；针对这一类酶，通常向反应物之中添加一份带有识别位点的寡核苷酸来增强酶活性。

除了反应条件和酶性质外，DNA 自身的性质也会影响限制性酶切（表1）。甲基化的DNA 可耐受部分限制性内切酶的切割（详见）。酶的识别位点过于接近终端（线性底物DNA 中）以及切割位点相邻（双酶切）都可能影响酶切割DNA 的效率）。此外，部分超螺旋DNA 分子要比线性DNA 分子更难切割，增加5-10 倍的酶量可有助实现完全酶切。

表 1.不完全酶切的常见原因。

酶供应商在产品说明书中提供了使用建议，为实现完全酶切，必须严格遵守此类建议。

预料之外的切割图谱

即便遵守了制造商的使用说明，仍可能观察到预料之外的底物DNA 切割结果。为避免陷入此类困境，必须确保酶和DNA、反应所用的试剂均不含污染物（例如，其它限制性内切酶、DNA 和核酸酶）。

出现预料之外切割的一个原因是，在增殖和扩增过程中，底物DNA 引入了突变。突变可能破坏已知的识别位点或创造出新的识别位点，从而产生预料之外的酶切结果。对DNA 进行Sanger 测序，是一种判断突变是否引起底物DNA 出现预期外切割的有效方法。

有时候预期之外的酶切图谱是由检测过程而非酶切过程造成的。部分限制性内切酶（例如，FokI，TauI）可能会与DNA 紧密结合，导致电泳时出现明显的凝胶迁移。使用含SDS 的上样染料，加热使酶从切割的DNA 上解离开来，均可避免出现这类凝胶迁移现象（图2）。

图 2.限制性内切酶与DNA 结合可能导致电泳时条带拖尾。

星号活性和不完全酶切也会导致凝胶电泳时出现预料外的条带。因此，进行问题排除时必须区别这两种因素。一种区分方法是根据孵育时间。如果为星号活性，孵育时间越长，不理想条带通常越容易区分，而不完全酶切的不理想条带则会随着孵育时间延长而消失。此外，不理想条带的大小也是一种区分方式。部分源于星号活性的条带会比预期条带低，而不完全酶切的条带会高于最低预期条带（图3）。

图 3.不完全酶切和星号活性的区分。

甲基化

DNA 甲基化是真核和原核生物最常见的DNA 修饰类型之一。在细菌体内，DNA 甲基化参与防御噬菌体感染的限制性修饰(R-M) 防御系统（参见），即保护宿主细菌自身的DNA 不受

内源性限制性酶切割。甲基化通常发生在胞嘧啶(C) 和腺嘌呤(A) 碱基处，主要形成5-甲基胞嘧啶(m5C)、N4-甲基胞嘧啶(m4C) 和N6-甲基腺嘌呤(m6A) 衍生物。

DNA 甲基转移酶可将来自供体的甲基基团转移到受体甲基（例如， A 和 C）上，催化甲基化反应。在实验室细菌菌株之中最常见的DNA 甲基转移酶类型包括：

?Dam：代表脱氧腺苷甲基转移酶，可以将序列5′-GATC-3′ 转化为5′-G(m6A)TC-3′?Dcm：代表脱氧胞嘧啶甲基转移酶，可以将序列5′-CCWGG-3′ 转化为5′-C(m5C)WGG-3′（其中W 代表A或T）

?EcoKI：代表大肠杆菌K12 菌株内的Type I R-M 体系，可以修饰序列5′-AAC(N)6GTGC-3′ 内的腺苷

?EcoBI：代表大肠杆菌B 菌株内的Type I R-M 体系，可以修饰序列5′-TGA(N)8TGCT-3′ 内的腺苷

在哺乳动物和植物系统中，CpG 或CpNpG 甲基化是生物进程中常见的DNA 修饰，因而成为了表观遗传学的主要焦点。

限制性内切酶对于甲基化DNA 识别位点的敏感度因酶的种类而异。例如，如图4所示，GATC 处的Dam 甲基化完全阻断了MboI，但是激活了DpnI。而5′-CCGG-3′ 的CpG 甲基化阻断了HpaII 活性，但却对MspI 没有任何影响。在部分情况下，限制性内切酶的活性会受甲基化部分抑制（例如，XhoI）。

图 4.限制性内切酶对于底物DNA 甲基化的敏感程度存在不同程度的差异。

在细菌内增殖质粒时，必须考虑到目标限制性内切酶甲基化的影响。为防止在5′-GATC-3′ 和5′-CCWGG-3′ 位点发生甲基化，质粒转化应选择缺少Dam 和Dcm 甲基化酶的感受态细胞(dam–/dcm–) 。大多数大肠杆菌细胞不含CpG 甲基化系统，因而从细菌分离的DNA 不存在CpG 甲基化问题。如果基因组DNA 提取自植物和哺乳动物，则可能在CpG 位点发生甲基化，再通过部分甲基化敏感的酶影响限制性酶切。

质量/使用寿命

在选择限制性内切酶时，一个往往被忽略的因素是供应商的生产条例和质量流程。为获得可靠的结果并最大限度避免各次实验运行间结果波动，研究人员应了解酶供应商生产这类产品时采取的质控和质量保证措施。购买此类酶时应考虑的几个关键问题包括：

?制造商的履历和资质如何？他们在限制性内切酶研究和开发方面是否具有长期良好的声誉和成就？─ 酶应该来自可靠的来源，才能获得一致的结果。

?该类酶如何生产？认证的生产地点是否符合各种国际质量标准，如ISO 9001 和无菌室环境？─ 确保酶产品可靠，最大限度避免批次间差异非常重要。

?制造商的产能如何？针对大规模实验，他们能否提供大批量生产和定制包装？─ 对于全基因组或高通量研究，稳定的大规模和定制生产很重要。

?酶的性能如何？接受过哪些测试？他们的活性、纯度和应用是如何测定的？这些测试是否足够灵敏，足以确保符合您的实验要求？─ 提供质量控制文档是质量保证的一个重要措

施。

?供应商提供的知识广度和深度如何？存在有关酶的疑问或产品相关的问题时，供应商是否积极提供了有益的支持？─ 深入理解产品和实时提供支持，是供应商行使合作伙伴职能的关键。

总之，并不是所有的限制性内切酶都是一样的。生产这类重要且关键的工具时所遵循的生产条例、质量控制和质量保证措施，是确保您的实验成功的关键，因此需要谨慎考虑。

资源

相关产品

?

?

?

限制性内切酶疑难解决指南

?

?

?

?

当使用电泳观察酶切结果时，您可能会观察到一些酶切问题，如：

?

?

?

您可在此了解引起这些问题的可能原因以及我们对于解决这些问题的建议。另请参见

限制性酶切相关问题

限制性内切酶在基因组作图与分析中的应用

?

?

?

?

尽管限制性内切酶广泛应用于分子克隆，但它还作为分子工具还可应用于分子生物学的其它应用。其中两大重要应用为DNA指纹识别和甲基化分析，这二者是基因组作图、分析表观遗传学图谱的主要方法。

?

?

使用限制性内切酶进行DNA 指纹识别

DNA 指纹识别或分析的概念在上世纪80 年代开始出现，是指根据来自于基因组的不同大小DNA 片段构成的独特图谱，对不同个体进行基因识别。换而言之，DNA 片段及其长度差异可作为区分标记物——即所谓的“指纹”——来进行基因识别（如等位基因），而不单纯依赖表型特征进行识别。

如今，DNA 指纹识别技术的应用已经极为常见。大多数公众已经认识到DNA 指纹识别和谱图在法医学和刑事案件之中的重要性，但该技术还在疾病检测和植物育种等其它领域也得到广泛使用。DNA 指纹识别技术的广泛应用促使业内开发了许多DNA 指纹识别方法，而如何选择这些方法主要依赖实验目标及所研究的生物体。

限制性片段长度多态性(RFLP)

限制性片段长度多态性简称RFLP (英文发音为“rif-lip”，最原始的指纹识别方法即基于此概念。

此方法的典型实验流程包括限制性酶切、片段分离、Southern 印迹杂交、探针杂交以及成像分析（图1）。

图 1.鉴定限制性片段长度多态性(RFLPs)的基本实验流程。

第一步，使用一种或多种限制性内切酶消化经纯化的基因组DNA。通常根据酶区分基因差异

的能力和酶成本来选择合适的限制性内切酶。然后使用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的片段。由于酶切产生的不同大小片段在凝胶上广泛扩散，会在凝胶上形成连续拖尾。

为了检测所需的片段，将经凝胶分离的DNA 片段转印到硝化纤维膜或PVDF 膜上进行处理和检测。将一个带有标记的单链DNA 探针杂交到膜上，以识别所需片段。将最终的结果成像，获得独特的RFLP 指纹。

RLFP 的探针基于基因组内的单拷贝数或低拷贝数序列，大小通常为500 至2,000 bp。将探针进行标记，检测超低量的样本，并识别将用作指纹基础材料的片段。观测到的RFLP 标记

物为特异性探针和限制性内切酶结合的结果。例如，探针 A 和EcoRI 酶切的DNA 可确定某个基因组的一种RFLP。探针 A 和HindIII 酶切的DNA 会确定该基因组的另一种RFLP （图2A）。事先了解模板序列（虽然非必需），可以快速开发出有用的RFLP 探针。

RFLP 和限制性内切酶还可用于检测两个不同个体的DNA 差异。图2B简单阐释了探针杂交和检测，比较了两个个体的两个等位基因的HindIII 酶切RFLP（标为“1”和“2”）。在本例中，根据等位基因 2 HindIII 限制性位点的缺失或获得，探针 A 可以识别两个个体的不同限制性指纹。但在多数情况下，两个个体的片段长度差异是由于酶切位点外的DNA 序列插入或缺失（由天然的重组或复制引起）所致。RFLP 分析还用于遗传咨询、动植物育种以及疾病监测等应用。

Figure 2. Simplified RFLP fingerprinting. (A)Different RFLP markers are obtained from digestion of the same sample with two restriction enzymes separately, EcoRI and HindIII.(B)Two individuals (A and B) are distinguished by HindIII digestions of two alleles (1 and 2).

尽管RFLP 用处很大，但其仍存在部分局限。这种分析方法需要大量的起始样本DNA，而且整个操作流程进展缓慢且繁琐。随着PCR 技术的发展，许多此类缺点均已被解决——例如，可采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术，后者所需的样本更少，同时可采用更多基于快速PCR 技术的实验方案执行。

了解更多相关产品

???

?

?

?

扩增片段长度多态性(AFLP)

AFLP 是另一种基因作图技术，该技术不需事先了解基因组序列，即可通过RFLP 及之后的选择性PCR 从任意生物体的基因组DNA 扩增片段。此外，AFLP 分析仅需少量起始模板（通常为ng 级）。

尽管AFLP 最初专门针对植物研究而开发，但如今其已在许多领域广泛使用，如：

?绘制新物种的基因图谱

?测定不同品种的相关性

?建立交叉关联群

?研究遗传多样性和分子亲缘关系

AFLP 操作流程包括：酶切基因组DNA 获得限制性切割片段，接头连接接头，PCR 扩增，电泳进行片段分离，以及通过放射自显影或荧光法进行PCR 扩增子最终成像（图3）。

Figure 3. Illustration of the basic amplified fragment length polymorphism (AFLP) workflow. AFLP 的第一步，使用限制性内切酶（通常使用EcoRI 和MseI）酶切基因组DNA 样本。基因组DNA 的GC 含量会影响酶切效率和最终的指纹。例如，如果使用MseI，当GC 含量为<50% 时酶切效果最佳。GC 含量过高（例如，>65%）可能妨碍MseI 的酶切作用，导致片段量过低。同样，较低的GC 含量可有助EcoRI 完全酶切。

酶切完成后，会有两个接头连接在片段两端。这些接头经设计包括19–22 bp 序列以便后续引物结合，而接头的链接会破坏原来的MseI 和EcoRI 识别位点（图3B）。

接下来进行两轮PCR 扩增：选择性预扩增以及之后进行的更具选择性扩增反应。在选择性预扩增PCR 阶段，首先扩增连接有EcoRI 和MseI 接头的DNA 片段（图3C）。完成此步骤后，使用3′ 端最多带三个额外碱基的引物对进行更具选择性的PCR 反应（图3D）。这类引物包括选择性核苷酸，其和严格的PCR 条件一起作用可有助于确保仅与选择性引物3′ 端具有序列同源性的DNA 片段才能被扩增。在这一选择性扩增步骤中，EcoRI 接头引物进行放射性标记或荧光标记以便进行下游片段检测，而Msel 引物则不会被标记。

选择性引物和选择性标记的组合可以精简后续的图谱，通过凝胶或电泳揭示独特的指纹（图

3E）。扩增后的指纹最佳组成范围为50 至200 个片段，片段长度范围为45 至500 核苷酸。在各种成像方法中，首选荧光标记结合毛细管凝胶电泳的方法，这是因为该方法可实现从片段分离到数据收集的自动化流程，有助于提高效率和稳定性。

了解更多相关产品

????

?

?

?

限制性内切酶进行甲基化分析

甲基化是一种在真核和原核生物基因组内都会存在的内源性DNA 修饰和调控方式。尽管DNA 甲基化也属于原核生物限制性修饰系统的一部分（参见），但其在调控真核生物基因表达方面却发挥着更重要的作用。目前人们已发现DNA 甲基化参与调控许多细胞进程及疾病状态，如胚胎发育、X 染色体基因沉默、细胞周期调控和肿瘤形成。

在许多植物和动物体内，甲基化通常发生在5′-CpG-3′，表现形式为甲基基团添加到胞嘧啶的含氮环的第五个碳上，形成5-甲基胞嘧啶。在植物体内，5′-CpNpG-3′ 和5′-CpNpN-3′ 处也会发生胞嘧啶甲基化，其中的N 代表除鸟嘌呤之外的任意核苷酸。甲基化分析中的另一种重要成分是CpG 岛。CpG 岛是一个长度500–2,000 bp，富含GC 的DNA 区域，通常见于基因的启动子和第一个外显子。由于CpG 岛的甲基化状态可能会影响基因转录的失活和激活，因而成为了频繁研究的对象。

在诸多研究DNA 甲基化状态的方法中，限制性内切酶因其可用性和易用性而成为了热门工具。部分限制性内切酶的识别位点含有CpG 序列，而这些酶对甲基化底物可能表现出不同的敏感度（例如，不受影响，被损坏、阻断或存在依赖性；另请参见）。研究人员充分利用这一性质，广泛使用限制性内切酶作为位点特异性甲基化分析的基本工具。一些较为知名的方法包括：结合重亚硫酸盐限制性内切酶分析(COBRA)，限制性酶切后进行qPCR （又称实时荧光定量PCR 法DNA 甲基化分析，简称qAMP）。

结合重亚硫酸盐限制性内切酶分析(COBRA)

COBRA 是最热门的位点特异性CpG 甲基化分析方法之一。其实验流程包括：通过重亚硫

酸盐处理实现胞嘧啶的化学转化，PCR 扩增经重亚硫酸盐处理的DNA，PCR 产物的酶切消化，最后查看限制性酶切图谱，检验目标位点的胞嘧啶甲基化。

图4阐释了COBRA 检测的步骤。重亚硫酸盐处理DNA 样本会将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶（5-甲基化胞嘧啶）则不受影响。在之后的PCR 过程中，引物在指定的位点扩增CpG 岛。经PCR 形成新链过程中，尿嘧啶作为胸腺嘧啶复制，而5-甲基化胞嘧啶则作为胞嘧啶复制。随后使用可识别扩增区域内CpG位点的限制性内切酶消化PCR 产物。如果原位点序列未甲基化，由于PCR 扩增后酶切位点的胞嘧啶已被胸腺嘧啶取代，则不会发生酶切。如果原始序列上的酶切位点含有5-甲基化胞嘧啶，则由于PCR 后未修饰识别位点，限制性内切酶会在此处酶切DNA。通过PCR 产物的酶切图谱，可以判定原始位点序列的甲基化状态。

Figure 4. Illustration of the combined bisulfite restriction analysis (COBRA) workflow with a 5′-CGCG-3′ locus sequence and a restriction enzyme (Bsh1236I) that recognizes a CG-containing sequence.

进行COBRA 分析各个步骤时，需要考虑若干注意事项。重亚硫酸盐处理时，由于任何残留

的未甲基化胞嘧啶都会造成假阳性结果，所以胞嘧啶的转化效率尤为关键。但重亚硫酸盐对DNA 作用剧烈，为避免DNA 损伤，处理时间不可超过所需时长。请遵照试剂盒制造商建议的重亚硫酸盐转化处理时长，或在处理后根据经验判定转化效率。重亚硫酸盐处理后，由于DNA 序列在未甲基化的胞嘧啶位置含有尿嘧啶，在PCR 过程中，DNA 聚合酶必须能够读取含尿嘧啶的DNA 模板（例如，）。最后，在酶切步骤，选择的限制性内切酶必须能够有效酶切PCR 产物，以便获得可靠的甲基化分析酶切图谱。妥善解决这些问题后，COBRA 即可成为出色的甲基化分析方法。

了解更多相关产品

???

?

?

?

?

??

使用限制性内切酶和实时荧光定量PCR 进行DNA 甲基化定量分析

另一分析位点特异性DNA 甲基化的常用方法是：直接酶切DNA 模板，然后进行实时PCR 或定量PCR (qPCR)。此方法需要使用一组具有不同甲基化敏感度的，从而检测特定位点的胞嘧啶甲基化状态。由于避开了重亚硫酸盐转化DNA（参见COBRA 分析）步骤，这一方法所需的起始DNA 量更少，避免了重亚硫酸盐处理可能带来的DNA 损伤，简化了实验流程。此外，与COBRA 分析相比，此方法的qPCR 还可对样本的甲基化状态进行定量检测。

选择不同甲基化敏感度的同裂酶或异裂酶的依据标准包括：目标位点（例如，CpG 岛或基因体）以及可选的限制性内切酶。CpG 甲基化研究常用的一对内切酶是MspI 和HpaII，二者具有相同的识别位点5′-CCGG-3′。靶标位点的胞嘧啶甲基化会完全阻断HpaII 酶切，而MspI 活性则不受影响。此外，为研究基因体（指基因被转录的序列）或低GC 含量基因组区域的甲基化，您可改选其它同裂酶，如含有相同识别序列5′-TCGA-3′ 的HpyF30I 和TaqI。如果序列中的胞嘧啶被甲基化，HpyF30I 的酶切被阻断，而TaqI 则不受影响。为了更彻底地鉴定位点特异性甲基化，除了对甲基化敏感的同裂酶/异裂酶外，还可使用只会酶切含甲基化胞嘧啶序列的限制性内切酶（图5A）。

经限制性酶切后，可以直接将DNA 样本进行凝胶电泳，定量分析甲基化。请注意，酶切的DNA 可能出现拖尾或多个较小的条带。使用凝胶电泳法时，根据此检测方法的灵敏度，可能需要加入更多量的DNA 才能观察到片段（图5B）。

Figure 5. Methylation analysis by restriction digestion followed by gel electrophoresis and qPCR.进行甲基化定量分析时，酶切的DNA 样本要进行qPCR。PCR 引物经设计位于目标位点侧翼，从而使未酶切的底物继续作为PCR 模板。剩余的未酶切DNA 的水平取决于所用限制性内切酶的甲基化敏感度，如图5A所示。DNA 的完整性水平越高，可供PCR 扩增的DNA 模板就越多，在实时荧光定量PCR 中就越早检测到DNA 扩增（即，）。根据这一原理，依据PCR 分析即可测定位点的甲基化状态（图5C）。

了解更多相关产品

?????

?

?

?

?

参考文献

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

传统分子克隆基础

?

?

?

传统分子克隆依赖重组DNA 方法，即首先通过限制性内切酶酶切，制备接受DNA 插入片段的载体。随后，通过连接酶将酶切的片段拼接在一起（即连接过程），形成可以表达目标基因的新载体。这可能是传统克隆最简单、最老的技术，但也为研究人员开发各种新型克隆方法打下了基础，如TA cloning?、TOPO? 克隆、PCR 克隆、不依赖连接酶的克隆，以及利用其它修饰酶独特性能的基因组装。

传统分子克隆的一般实验流程包括如下步骤（图1）：

Figure 1. Traditional cloning workflow.

载体制备

传统分子克隆方法所用的载体基于质粒，而后者为不依赖基因组DNA 在细菌内复制的双链游离DNA。所有基于质粒的克隆载体包含许多关键要素，包括：确保在细菌宿主细胞内能有效增殖的复制原；单一酶切位点，或更常见的是，含有多克隆位点(MCS)，其含有一系列酶切位点，可插入目的片段；载体成功转化后的细菌筛选标记（例如，抗生素耐受）。

在一些载体中，MCS 位于作为标记物的基因内，可筛选已经成功拼接进插入片段的克隆。例如，pUC18 载体中的lacZα 基因经表达编码β-半乳糖苷酶的α 肽段，其和X-gal 可通过显色来筛选克隆（更多信息请见蓝/白筛选法）。

图2：pUC18 及其MCS 的图谱。

传统分子克隆载体制备的第一步是，通过限制性酶切构建插入位点。限制性内切酶的选择取决于载体和插入片段上是否存在相应的识别序列以及识别序列的位置，以及是否适于连接。载体

图谱上可查到载体上的酶切位点，也可使用等免费在线工具绘制载体酶切位点。MCS往往是插入片段的首选，因为该区域专用于克隆。

酶切后，为防止载体自连，可能有必要进行载体的去磷酸化，尤其当载体酶切后末端可互补或是平端时。在去磷酸化过程中，碱性磷酸酶可去除末端的5′ 磷酸基。此处理可避免载体自连，因为连接酶同时需要5′ 磷酸基和3′ OH 才能在载体环化过程中连接载体（参见）。

载体的去磷酸化对于降低背景、促进所需片段插入载体非常重要。自连载体和带有插入片段的载体都可在转化过程中被细菌摄入，从而为这些细菌细胞植入抗体耐受性（参见和图6）。

如果载体未经去磷酸化处理，则会产生较高的非所需克隆背景。

根据所用的限制性内切酶，可能需要载体具有平端。为确保成功连接，还建议对所需片段进行纯化。

插入片段制备

克隆的插入片段来源可能为基因组DNA、另一质粒的一部分或者线性DNA 片段。无论来源DNA 类型如何，制备插入片段时常用的第一个步骤是进行限制性酶切，产生匹配的粘性末

端，以便接下来将片段插入在载体中。

与载体制备一样，选择适于将插入片段克隆进载体的限制性内切酶。对此最通用的一种策略是，对插入片段和载体进行双酶切，以实现定向克隆。在以下实例中（图3A），使用了两种可生成不兼容末端的的内切酶（EcoRI 和KpnI）。由于载体和插入片段末端之间的兼容匹配性（EcoRI 和EcoRI，KpnI 和KpnI），二者仅可沿一个方向连接，因而这种方法可实现定

向克隆插入片段。

Figure 3. Common restriction enzyme cloning strategies.(A)Double digestion of the vector and the insert (e.g., EcoRI and KpnI) for directional cloning.(B)Single digestion of the vector and the insert with two separate restriction enzymes (e.g., BamHI and PstI), followed by blunt-end digestion or polishing.(C)Single digestion of the vector and the insert with the same restriction enzyme (e.g., BamHI) for cloning.(D)Single digestion of the vector and the insert with two restriction enzymes with compatible ends (e.g., BamHI and BglII) for cloning.

进行双酶切时，同时提供两种酶所需最优的反应缓冲液和反应条件至关重要；因此，为确保酶切成功，应严格遵守制造商提供的双酶切反应建议。

在某些情况下，如果无法找到合适的限制性内切酶，使用所选内切酶消化得到的DNA末端可能需要平端化。平端化会改变DNA 末端周围的原始序列；这可能导致基因翻译区域出现移码突变或基因调控区域被破坏。此外，平端DNA 的连接通常要比粘性末端难度更大、效率更低（图3B）。

某些情况下，可能会选择一种内切酶同时切割插入片段和载体DNA，以生成连接所需的互补

末端（图3C）。该方法常用于基因组DNA 克隆。

如果出现无法使用单一限制性内切酶的情形，可以考虑换用一对具有不同的识别序列，但是会产生兼容匹配突出端的酶。例如，BamHI 可以识别5′-G↓GATCC-3′，而BglII 可以识别5′-A↓GATCC-3′；这两种酶均可以产生在连接反应中可进行连接的5′-GATC 突出端。但请注意，在此情形下进行连接后，两个酶切识别位点不可恢复（图3D）。

通常用来平端化的酶是大片段的DNA 聚合酶I 的大片段(“Klenow 片段”)和T4 DNA 聚合酶。聚合酶的选择取决于限制性内切酶生成的3′ 或5′ 突出端。如果生成3′ 突出端（例如，使用KpnI ），则首选T4 DNA 聚合酶，因为其3′ 至5′ 核酸外切酶活性比Klenow 更强。在此情况下，T4 DNA 聚合酶会消化或“回切” 3′ 突出端。如果为5′突出端（例如，使用EcoRI ），可使用Klenow 或T4 DNA 聚合酶，通过其5′ 至3′ 聚合酶活性补齐突出端。个别情况下，可过量加入绿豆核酸酶或S1 核酸酶，通过二者在单链DNA 上5′ 至3′核酸外切酶活性，切除单链DNA 突出端（图4）。

图 4.通过酶消化，将限制性酶切得到的突出端变成平端。

插入片段和载体经酶切后（以及之后可能进行的平端化和去磷酸化），可在琼脂糖凝胶上进行电泳并切割出目标片段，纯化所需的片段。通过凝胶电泳还可去除酶切反应物中存在的酶和盐。。此类试剂盒基于使用促溶试剂、加热来融化凝胶的操作步骤，然后再使用硅胶柱或磁珠纯化片段。为了温和地、有效地回收较长的DNA 片段（例如，>10 kb 片段），可以结合使用低溶解度凝胶和琼脂糖酶（可分解琼脂糖）。从溶解的凝胶之中回收核酸的传统方法是苯酚/氯仿提取，然后再乙醇沉淀片段。但苯酚/氯仿提取可能会降低得率，且残留的苯酚可能会影响下游实验。为确保成功连接，提取的DNA 应具有较高的纯度。检验纯度最简单的方法就是测定：纯净的DNA 的A260/A280比率约为>1.8，A260/A230比率约为 2.0。

连接

获得目标片段后，可以构建连接反应，连接插入片段和载体。连接最常用的酶为T4 DNA 连接酶，可连接DNA末端的5′ 磷酸基和3′ 羟基。T4 DNA 连接反应需要ATP、DTT 和

Mg2+，这些成分通常由反应缓冲液提供（图5）。为了改善连接结果，通常建议构建几个具有不同插入片段:载体摩尔比率的反应，通常的比率范围为1:1 至5:1。（下载使用各种便利的工具和计算器，如Vector to Insert Molar Ratios Calculator（载体/插入片段摩尔比率计算器）。）如果连接效率较低，或者由于DNA 片段为平端，通常建议加入聚乙二醇(PEG) 等惰性高分子，增加反应组分的有效浓度，进而提高连接效率。

图 5.T4 DNA 连接反应。

根据DNA 片段类型和所需的得率，反应温度范围可能为14°C 至25°C（室温），反应时间可能为10 分钟至16 小时（过夜）。通常，反应温度越高，所需的时间越短，但得率也越低。。

连接后的混合物可直接用于化学感受态细胞的，如使用电转感受态细胞则之前需要进行纯化。如果连接反应使用PEG，不建议在反应后热灭活连接酶，因为这样会降低转化效率。

转化

转化是细菌细胞低频率吸收外界DNA 的自然过程。在分子生物学实验中，这一过程得到增强，用来在专门为吸收DNA 而制备的“感受态”细菌内增殖质粒。

市面上提供可实现高效、可靠转染的感受态细胞。制备可进行转化的“感受态”细菌的最常用方法是采用氯化钙处理对数期细菌细胞。将化学感受态细胞和连接反应物混合，然后在42°C 下热激活，部分DNA 会被细菌细胞吸收，并在细胞内开始复制。

您可根据实验目标和下游应用，选择不同的菌株。例如，为了进行“，必须选择带有lacZ突变(lacZΔM15) 的细菌菌株。如果实验需要使用甲基化敏感的限制性内切酶进行酶切，则应在dcm–/dam–细菌菌株内增殖质粒。如用于蛋白表达研究，则菌株应具有mRNA 稳定性和翻译功能，同时可以较高的重组蛋白表达诱导能力。

此外，感受态细胞的也是一个重要的考虑因素。生产商会以每微克DNA形成菌落数(CFU/μg)来表示感受态细胞的转化效率，数值范围通常为 1 x 106至1 x 109 CFU/μg。在较为困难的连接和克隆中，选择具有最高转化效率的感受态细胞可大幅提升获得目标克隆的几率。

另一个细菌细胞转化方法是电穿孔。这一技术使用电流处理电转化感受态细胞及经连接的质粒，在细菌细胞膜上形成瞬时微孔，以便吸收DNA。

随后，将转化的细菌（经过热激活或电穿孔后）置于含有适量抗生素的琼脂板上，（通过蓝-白筛选或其它方法）筛选含有所需质粒及插入片段的菌落。

克隆筛选

转化反应同时包含不带载体的细胞、不含插入片段的载体、纯插入片段、以及成功连接的载体和插入片段。不含载体的细菌缺少抗生素耐受性基因，因而不会生长；经转化含有载体的细菌（带或不带插入片段）可表达抗生素耐受性基因，因而可存活（图 6）。因此，可通过抗生素耐受性筛选细菌是否吸收完整质粒。

Figure 6. Mixture of bacteria after transformation and their phenotypes (growth/no growth/blue-white) on an antibiotic selection media plate.The ligation mixture may include failed products (unligated insert, unligated vector and the no-insert/empty vector), as well as desired/undesired insert-carrying vectors. The undesired insert may harbor an incorrect, mutated or truncated sequence.

为确定转化的菌落是否含有插入片段，可采用多种方法，其中最常用的是“蓝/白”筛选法和阳性筛选法。蓝白斑筛选法的依据是，待转化的细菌菌株会表达突变的lacZ基因(lacZΔM15)，而该基因可与载体上编码的β-半乳糖苷酶α肽段互补（α互补）。将经转化的细胞涂布到含

有lacZ转录诱导子、IPTG、LacZ显色底物X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的生长培养基上。在蓝白斑筛选中，LacZ 会水解X-gal，产生蓝色染料进而形成蓝色菌落。当