猪圆环病毒Ⅱ(PCV2)衣壳蛋白羧基端基因在T4噬菌体表面的展示
DNA病原—圆环病毒2型PCR检测方法
猪圆环病毒2型PCR检测方法操作程序廖荣斌，何启盖（华中农业大学动物医学院）一、原理猪圆环病毒2型感染引发的仔猪断奶衰竭综合症、肾炎与皮炎、增生性肠炎以及母猪繁殖障碍。
通过病原检测和病毒分离是确证本病的重要手段。
猪圆环病毒分为2种，即圆环病毒1型和圆环病毒2型。
前者不致病，后者可致病。
猪圆环病毒2型（PCV2）的基因组大小为1768 bp或1767bp。
其中，PCV2ORF2基因与免疫保护和毒力等重要特性有关，同时，此基因与PCV1的同源性较低，通过合理设计引物，扩增ORF2，从而可检测并区分PCV2与PCV1。
PCR技术具有快速、敏感的优点，已经用于许多动物疾病病原的检测。
本试验是利用我们设计的引物，通过反应条件的优化，以感染猪组织或血液为模板，扩增PCV2的ORF2基因，从而作出感染的结论。
二、材料准备1、手术器械：采样用。
根据样品数量来确定。
2、微量移液器（规格：2.5μl，10μl，100μl，200μl，1000μl）3、反应引物上游引物：CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT；下游引物：CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC4、磁珠：用于吸附和分离DNA4、PCR仪：东胜创新5、电泳仪：北京六一电子设备6、紫外检测仪：Bi0-RAD凝胶成像系统7．相关溶液及配方：1╳TAE buffer（电泳缓冲液）配方：（1）称量Tris：242g，Na2EDTA.2H2O：37.2g，置于1L的烧杯中；（2）向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解；（3）加入57.1ml的醋酸，充分搅拌；（4）加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存；（5）使用时将室温保存的该溶液稀释50倍即可使用。
扩增产物的样品缓冲液：全式金生物6╳Loading buffer。
三．样品采集感染猪或流产的胎儿的肺脏、淋巴结、脾脏和肾脏；发热期猪的抗凝血或血清；每个样品用单独的剪刀或刀片，避免交叉污染。
控制猪圆环(PCV2)的4个基本原理
控制PCV2的4个基本原理PCV2 是迄今为止可使猪患病的最小病毒。
PCV2会长时间抑制免疫系统，使受感染的仔猪和育肥猪对其他病原体格外敏感。
PCV2 感染的临床和经济后果可能是巨大的。
因此，在许多欧洲国家，预防性PCV2 疫苗接种是“标准仔猪疫苗接种”。
然而，PCV2 方法不仅仅基于仔猪疫苗接种。
如果想把PCV2对企业的影响降到最低，我们还必须在其他方面做出努力简而言之：我们对这种病毒了解多少？PCV2 的各种变体已通过突变产生，范围从基因型2A 到基因型2H。
基因型2A 至2D 是迄今为止农场中最常见的基因型（占所有检查的PCV2 病毒的96%）。
这些类型的致病潜力是相当的。
要引起临床疾病，必须始终存在其他因素。
实际上，这通常是另一种病毒或细菌的同时感染。
这种额外因素也可能具有非传染性，例如压力。
如何应对PCV2？控制PCV2 有两个目标：将感染造成的生产损失降至最低，以及将公司的感染压力（病毒颗粒数量）降至最低。
该方法基于4 个基本原则：1、稳定的母猪群仔猪在出生时就可能已经感染PCV2（称为“病毒血症仔猪”）。
当免疫状态低下的母猪在怀孕期间感染病毒时就会发生这种情况。
一般来说，后备母猪的风险比母猪更大，因为母猪通常已经建立了免疫力。
病毒血症仔猪随后可感染同窝仔猪。
如果转移许多仔猪，就会有助于这种病毒的传播，这意味着许多仔猪可能在很小的时候就被感染。
在这种情况下，仔猪疫苗接种来得太晚，无法起到保护作用。
要控制PCV2，首先要保证母猪体内有足够的、同质的免疫力，让病毒没有机会在母猪群中传播。
也就是说，必须保证母猪存栏稳定作为基础。
2、正确的疫苗接种策略疫苗接种可确保仔猪增强抵抗力，因此感染PCV2 后的后果要小得多。
疫苗已被证明对最常见的基因型有效，包括无需针头即可皮内注射的疫苗。
无针皮肤给药的优点是接种疫苗的动物的疫苗接种反应较小，因为这种给药方法造成的压力较小。
此外，仅注入少量液体；0.2毫升而不是传统方式用针头的2毫升。
猪圆环病毒2型检测技术及研究进展
猪圆环病毒2型检测技术及研究进展猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是一种广泛分布于全球范围的病毒，属于猪圆环病毒科。
该病毒在猪群中引起了严重的疾病，主要表现为猪繁殖与生产性能下降、控制性的呼吸道疾病和消化道疾病，并使猪对其他传染性疾病易感，导致了重大经济损失。
目前，猪圆环病毒2型的检测技术主要包括传统的分子生物学方法和免疫学方法。
分子生物学方法中，常用的PCR技术可通过扩增病毒基因组中的特定片段来检测病毒。
常用的PCR方法包括常规PCR、实时荧光定量PCR（qPCR）和逆转录PCR等。
这些方法具有灵敏度高、特异性强的优点，能够快速准确地检测病毒。
PCR技术还可以用于基因测序和基因型分析，有助于研究病毒的遗传变异和演化规律。
免疫学方法中，常用的技术包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术和免疫杂交等。
ELISA技术是一种常规的血清学检测方法，可以通过检测病毒抗原或抗体来确定样品中是否存在PCV2。
免疫荧光技术可以利用荧光染料标记的抗体与病毒抗原或抗体结合，通过荧光显微镜观察来检测病毒。
免疫杂交是利用放射性同位素或酶标记探针与病毒核酸结合，采用一定的检测方法来确定样品中是否存在病毒。
猪圆环病毒2型的检测技术在近年来得到了广泛的关注和研究。
研究人员通过不断改进和创新，提高了检测方法的灵敏度和特异性。
研究者们通过对PCR技术的不断改良，将其应用于PCV2的早期诊断和病毒载量的定量分析。
向PCV2的抗原和抗体的检测方法中引入了新的标记物和探针，进一步提高了检测的准确性和可靠性。
一些新兴的技术也正在被应用于PCV2的检测，如新一代测序技术和基于CRISPR-Cas9技术的病毒诊断方法，这些技术有望在未来得到更广泛的应用。
猪圆环病毒2型的检测技术是研究人员关注的焦点。
随着技术的不断发展和创新，我们可以期待更加准确、快速、灵敏的检测方法的应用，为PCV2的防控和研究提供有力的支持。
猪圆环病毒2型灭活疫苗及其亚单位疫苗对PCV2d流行毒株攻毒保护试验
猪圆环病毒(PCV)是主要包括PCV1、PCV2、PCV3和PCV4两个血清型。
其中PCV1对猪不致病,PCV2给国内外养猪业造成了巨大的威胁,给养猪业造成了严重的经济损失。
PCV3作为一种新发病毒,2016年在美国首次报道,被认为与猪的多种临床疾病相关,呈世界范围内流行;2019年PCV4首次在中国发现,其流行情况和致病性目前还不确定。
而PCV2基因组大小约为1.7kb,具有两个主要开放阅读框(O R Fs)。
其中,O R F2基因编码病毒结构蛋白Cap,是PCV2主要保护性抗原。
已有科学研究充分表明,PCV2感染仔猪,可以引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PM W S),主要临床表征为进行性消瘦,该病于1991年首次发现是在加拿大的西部猪群中爆发,紧随其后,在世界各地的其他养猪国家均有相继报道。
根据PCV2基因组序列特征的差异,将其分为PCV2a亚型、PCV2b亚型、PCV2c亚型、PCV2d亚型和PCV2e亚型。
在2006~2007年, PCV2b亚型为主要的流行基因型,2008年后,PCV2d 亚型成为了主要的流行基因型。
目前在我国猪群中流行的PCV2毒株是以PCV2d基因亚型为主。
PCV2疫苗是临床防控PCV2相关疾病的有效手段,其中病毒灭活疫苗和PCV2-Cap亚单位疫苗的研究取得成功。
美国富道动物保健品公司研制的PCV1/PCV2-Cap重组嵌合灭活疫苗,法国梅里亚动物保健品公司生产的PCV2全病毒灭活疫苗,德国勃林格殷格翰动物保健品公司推出重组PCV2-Cap 的亚单位疫苗。
国内猪圆环病毒2型灭活疫苗和PCV2-Cap亚单位疫苗也相继研制成功,大规模应用已达10年之久,随着PCV2不断变异,现阶段PCV2d亚型毒株为主要流行毒株,但是专门针对PCV2d毒株的全病毒和亚单位疫苗还未上市,现如今国内外的商品化PCV2疫苗多来源于PCV2a亚型和PCV2b亚型毒株,能否对PCV2d亚型毒株提供长期有效保护有待于进一步证实。
猪圆环病毒2型基因组DNA的结构与功能研究进展
猪圆环病毒2型基因组DNA的结构与功能研究进展赵燕;喻正军【摘要】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒病相关疾病的主要致病原,可损伤宿主的免疫系统,加剧一些细菌病和病毒病感染的临床症状,在全球养猪业中造成巨大损失.PCV2的基因组DNA含有11个开放阅读框(ORFs),其中至少有7个ORFs编码的蛋白质分子质量大于5 ku,但目前只有5种编码的蛋白(Rep、Rep’、Cap、ORF3和ORF4)发现于PCV2复制过程中.作者概述了当前PCV2基因组DNA的结构与功能,阐明PCV2的病原学,为防控PCV2感染提供科学依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)005【总页数】6页(P1176-1181)【关键词】猪圆环病毒2型;基因组DNA;开放阅读框;病毒编码蛋白【作者】赵燕;喻正军【作者单位】湖南中岸生物药业有限公司,长沙410199;湖南中岸生物药业有限公司,长沙410199【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型(PCV2)引起的一系列疾病的总称[1]，主要包括猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)及繁殖障碍等疾病。
PCV2感染可严重破坏易感动物的免疫系统，产生严重的免疫抑制，且易诱发多种细菌及病毒的协同或继发感染，给该病的防控带来巨大困难[2]。
1991年，猪圆环病毒病首次发现于加拿大，之后迅速在北美洲、南美洲、欧洲、亚洲、大洋洲和非洲流行，严重威胁生猪养殖业的可持续发展。
中国自2001年首次分离到PCV2以来，山东、浙江、山西、广东、河南等省先后报道该病发生，近年来由PCV2引起的PMWS在中国相关养猪地区呈现暴发流行趋势，对中国的生猪产业造成巨大经济损失[3]。
PCV2是圆环病毒科的一种无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒，直径平均为17 nm，是目前发现最小的动物病毒[4]。
圆环病毒病
猪圆环病毒（PCV-2）常见混合、继发感染防治措施及体会2、左新桐2、河南农业大学动物疫病检测诊断中心猪圆环病毒是小的无囊膜单链环状DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属。
根据病毒的抗原性和基因组成的不同分为PCV1和PCV-2两个基因型。
其中，PCV1可污染PK15细胞系且不产生CPE，对猪无致病作用，PCV-2具有致病性。
PCV-2在很多国家猪群中广泛存在。
由于PCV2严重破坏了猪的免疫系统,造成免疫功能低下,PCV-2的感染往往与其他多种病原混合或继发感染,而继发感染又是造成PCV2病情加重的原因。
规模化猪场发生PCV-2的混合或继发感染时，预防和治疗效果常常不明显（尤其在冬春季节），本文旨在让大家了解流行情况、发病原因、临床症状、诊断方法等，更重要的是总结几年来的具体防治措施和方案，以供参考。
一、了解猪圆环病毒病（PCD）(一)猪圆环病毒病是由PCV-2引起的以断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸系统混合疾病、繁殖障碍症为代表的疾病。
（二）猪圆环病毒病的含义是指群体病或是与PCV-2相关的疾病（Allan等，2002）。
（三）PMWS感染及亚临床感染的致病机理中，PCV-2对免疫系统的影响具有重要作用。
PMWS感染猪组织典型的显微镜下淋巴病变，疾病与机会病原的联合及淋巴组织中免疫细胞亚群和外周血单核细胞的其他变化，是PMWS严重感染猪的常见特征，表明发病后机体处于免疫抑制状态（《猪病学》P314）。
（四）Allan等通过接种PCV-2及与其他感染和非感染因子共同作用，复制出了PMWS，表明圆环病毒病的发生是在包括环境条件等发生变化的情况下（不利于猪的生长发育），PCV-2与其他病原共同的结果。
（五）免疫刺激是圆环病毒病发生的重要步骤。
二、当前圆环病毒病（PCD）流行情况（一）PCV2感染在我国规模化猪场已普遍存在1、PCV2感染在我国各地已广泛存在，猪群感染率高，阳性猪场多，并有逐年上升趋势。
猪圆环病毒2型衣壳蛋白优势b细胞表位重组蛋白免疫原性研究
%研究论文%
猪圆环病毒2型衣壳蛋白优势B细胞表位
重组蛋白免疫原性研究
高 雪张辛铭肖星星杨顺利】，尚佑军-尹双辉'*，蔡建平⑺*
(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州730046； 2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009)
关键词：猪圆环病毒2型；衣壳蛋白；抗原表位；免疫原性
中图分类号：S852.61007-5038(2020)03-0001-07
猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus type 2 , PCV-2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎 与肾病综合征、猪呼吸道综合征和母猪繁殖障碍等 猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原⑴，主要侵害猪的免疫 系统，引起机体免疫功能紊乱、细胞因子失调，进而 继发多病原的混合/继发感染⑵。PCV-2能够逃避 宿主抗病毒免疫清除反应，造成机体持续带毒感染 或隐性感染，对猪的健康造成极大的危害。尽管现 有疫苗可以减少感染和毒力，但在根除病毒方面并 不有效。此外.PCV-2的高突变率和疫苗所施加的 选择压力，有利于新毒株的出现和病毒优势基因型 的改变⑷。
收稿日期,2019-04-15 基金项目：国家自然科学基金项目(31602085)；中国农业科学院农业科技创新工程专项(2014-LVRI-09)
作者简介：高雪(1993-),女，山东临沂人.硕士研究生，主要从事分于生物学研究。*通讯作者
2
动物医学进展 2020年 第41卷 第3期（总第321期）
猪圆环病毒2型截短的衣壳蛋白的表达和抗原特征
猪圆环病毒2型截短的衣壳蛋白的表达和抗原特征
佚名
【期刊名称】《中国猪业》
【年(卷),期】2011(005)006
【摘要】设计三对特异性引物扩增F2—1．F2-2和XF2—2截短猪圆环病毒2型（PCV-2）衣壳蛋白基因。
扩增序列分别克隆到pET-32a（＋）载体，并在Rosetta（DE3）大肠杆菌中IPTG诱导表达。
融合蛋白可与猪圆环病毒2型抗体和His—XF2—2反应。
【总页数】1页(P71-71)
【正文语种】中文
【中图分类】S852.659.2
【相关文献】
1.重组表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的抗原特性分析 [J], 商绍彬;周继勇;吴建祥;陈庆新;龚辉
2.表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒的构建及鉴定 [J], 钟罗华;邓舜洲;胡杨;徐昌满;罗锋;张文波;陈松昌
3.利用细菌展示技术系统地筛选猪圆环病毒2型衣壳蛋白的线性抗原区域 [J], 徐文娟;张瑛杰;李青青;吴强;于向纺;郭笑辰;尹杰超;任桂萍;李德山
4.猪圆环病毒1型衣壳蛋白基因启动子增强人类免疫缺陷病毒1型质粒疫苗的抗原表达和免疫原性的研究 [J], Fiona L Tanzer;刘丹
5.猪圆环病毒1型衣壳蛋白基因启动子增强人类免疫缺陷病毒1型质粒疫苗的抗原表达和免疫原性的研究 [J],
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猪圆环病毒2型的分离鉴定及其全基因组序列分析
猪圆环病毒2型的分离鉴定及其全基因组序列分析汪磊;赵宝磊;冯华;刘运超;魏蔷;张改平【摘要】为分离鉴定流行于河南省的猪圆环病毒2型(PCV2),对河南省不同地区猪场的11份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪的病料进行分离鉴定,得到PCV2毒株.通过PCR检测,11份临床疑似病料中,7份确诊为PCV2阳性病料,阳性率为63.6％.挑选出阳性值较高的毒株命名为zmd-20161022,通过增殖培养筛选出优良毒株,并对其进行单层过氧化物酶试验(IPMA)鉴定,分析免疫原性;应用PCR 对该病毒全基因组进行特异性扩增,经测序后对该病毒的同源性和系统进化进行分析.结果显示,该毒株序列全长1 767 bp,同源性分析发现与国内3株PCV2毒株(AY686763、HM641752、HM038034)的同源性为95.2％～98.3％,与基因登录号为HM038030.1的同源性高达98.6％.系统进化树分析发现,zmd-20161022毒株与基因登录号为HM038030.1的亲缘关系很近,被鉴定为PCV2b-1c型,属于PCV2b的一种亚型.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2018(047)006【总页数】5页(P117-121)【关键词】猪圆环病毒2型;分离鉴定;IPMA;全基因组;序列分析【作者】汪磊;赵宝磊;冯华;刘运超;魏蔷;张改平【作者单位】河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV),属于圆环病毒科(Circoviride)圆环病毒属,是一种无囊膜的单股环状负链DNA病毒,是目前发现的最小的动物病毒之一[1]。
猪圆环病毒2型检测技术及研究进展
猪圆环病毒2型检测技术及研究进展1. 引言1.1 猪圆环病毒2型概述猪圆环病毒2型（PCV2）是一种引起猪瘦弱综合征和猪圆环病毒病的病毒，属于环状病毒科。
PCV2是一种小型非包膜的双链DNA病毒，病毒颗粒直径约17-25nm。
PCV2主要感染猪，特别是生长发育中的猪，并可引起多种免疫抑制相关疾病，严重影响了猪的生长发育和生产性能。
PCV2感染广泛分布于全球范围内，给猪养殖业造成了巨大的经济损失。
PCV2感染的临床症状主要包括疲劳、厌食、呼吸困难等，重症时还可导致猪的死亡。
随着猪养殖业的快速发展和养猪密度的增加，PCV2感染的发病率也在逐渐上升。
加强PCV2的检测和研究对于控制和预防猪瘦弱综合征和猪圆环病毒病具有重要意义。
通过对PCV2的检测技术和研究进展的深入探讨，可以为疫苗研制和防疫工作提供重要的参考和支持。
【字数：276】1.2 研究意义猪圆环病毒2型是一种广泛存在于猪群中的病原体，能够引起猪圆环病毒病，严重危害猪的生产业。
猪圆环病毒2型检测技术的研究意义在于及早发现并控制病毒传播，保障猪群的健康和生产安全。
通过对猪圆环病毒2型检测技术的研究和应用，可以提高疾病的早期诊断率和治疗效果，降低疫情的传播风险，减少养猪业的经济损失。
研究猪圆环病毒2型的检测技术还可以为相关病毒的检测提供借鉴和参考，推动病毒学领域的发展。
加强对猪圆环病毒2型检测技术的研究具有重要的意义，有助于提高我国养猪业的竞争力和可持续发展能力。
【研究意义】2. 正文2.1 猪圆环病毒2型检测方法猪圆环病毒2型（PCV2）是一种严重危害猪只健康的病毒，因其高度变异性和传染性而备受关注。
为了及时发现和控制PCV2感染，研究人员开发了多种检测方法。
1. 病毒核酸检测：PCR技术是目前应用最广泛的检测方法之一。
通过设计特异性引物，可以实现对PCV2基因组的扩增和检测，具有高灵敏度和特异性。
2. 免疫学检测：病毒抗原检测通过检测病毒在体内产生的蛋白质来确认感染情况。
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农业生物技术学报Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００９，１７（３）：５４１～５４２
・
研究简报・
猪圆环病毒１１（ＰＣＶ２）衣壳蛋白羧基端基因在Ｔ４噬菌体表面的展示木
王宪文 ，曹永长 ，马静云 ，谢青梅－，于康震ｔ，毕英佐・
（１．华南农业大学动物科学学院基因工程室，广州５１０６４２；２．河南科技学院动物科学学院，新乡４５３００３）
关键词：猪圆环病毒Ⅱ型；衣壳蛋白基因；展示
中图分类号：ｓｌ８８文献标识码：Ａ 文章编号：１００６一ｌ３０４（２００９）０３—０５４１—０２
Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ
ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２（ＰＣＶ２）Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｔ４ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｓｕｒｆａｃｅ
ＷＡＮＧ Ｘｉａｎ—ｗｅｎ 。，ＣＡＯ Ｙｏｎｇ—ｃｈａｎｇ ，ＭＡ Ｊｉｎｇ—ｙｕｎ ，ＸＩＥ Ｑｉｎｇ—ｍｅｉ ，ＹＵ Ｋａｎｇ—ｚｈｅｎ ，ＢＩ Ｙｉｎｇ—ＺＵＯ
ｒＪ．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｃｈｉｎａ）
Ｋ哆啪ｆｄ８：Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｍｓ ｔｙｐｅ ２；ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ；ｄｉｓｐｌａｙ
２０世纪７０年代Ｔｉｓｃｈｅｒ ｅａ ａ１．（１９７４）首次发现猪圆环病
毒（ＰＣＶ２），它所引发的猪网环病毒病给养猪业造成很大的经
济损失。ＰＣＶ２衣壳蛋白是ＰＣＶ２衣壳的主要结构成分、是 ＰＣＶ２的主要免疫原性蛋白。因而对ＰＣＶ２衣壳蛋白基因进 行研究具有重要的实践意义。 １材料和方法 １．１噬菌体、质粒、菌种和酶类 Ｔ４噬菌体南３部分组成，穿梭质粒ｐＲ、中Ｔ４（野生型Ｔ４ 噬菌体）和中Ｔ４一ｚ１（ＳＯＣ基 缺失的突变型Ｔ４噬菌体），为 溶菌酶依赖型株，均由任兆钧博士惠赠，本实验室保存；ｃａｐ—Ｔ 重组载体由本实验室构建并保存。Ｔ４噬菌体整合质粒ｐＲ，基 因Ｔ程菌大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｅ２，均由任兆钧博十惠 增，本实验室保存；酶均为ＴａＫａＲａ公司产品。 １．２ 引物设计与合成 根据广东省流行毒株的衣壳蛋白基因序列设计１对引 物即Ｔ１／Ｔ２，引物序列内有ＥｃｏＲ Ｉ酶切位点。根据已发表的 Ｔ４噬菌体小外壳蛋白（ｓｍａｌｌ ｏｕｔｅｒ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＯＣ）基因 的序列，设计了１个检测融合基因ＳＯＣ—ｃａｐ的检测引物 ｐＳＯＣ—ＵＰ，用于检测衣壳蛋白基因插入的方向的正确与否。 引物序列分别为： Ｔ１：５ 一ＣＴＣＴＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧ一３ ： Ｔ２：５ 一ＣＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＡＴＧＴＡＡＧＴＧＴ．３ ： ｐＳＯＣ—ＵＰ：５ 。ＧＡＡＴＣＡＩＡ ＪＧＧＣＡＴＣＧＣＴＣＧＣＧＣ一３ 。 １．３重组质粒ｐＲ—ｃａｐ的构建 以重组质粒ｃａｐＴ为模板，进行ＰＣＲ扩增、纯化，并将纯
化的ＰＣＲ产物用ＥｃｏＲ Ｉ酶切并电泳回收，ｐＲ质粒也经同样
处理，按常规方法连接、转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞，并
以ｐＳＯＣＵＰ／Ｔ２为引物，用ＰＣＲ方法鉴定重组菌；抽提重组
质粒ｐＲ—ｃａｐ，测定插入的ｃａｐ基因序列，确定所构建ｐＲ—ｃａｐ
读码框的正确性。
１．４ Ｅ２一ｐＲ—ｃａｐ与中Ｔ４一ｚｌ的同源重组
参照Ｒｅｎ ｅｔ ａ１．（１９９６）ｆｌ￣ｊ方法进行。
１．５重组噬菌体的鉴定
以Ｔ１／Ｔ２为引物，梅花魔溶液为模板ＰＣＲ鉴定重组噬
菌体；将重组噬菌体扩大培养并经离心浓缩后，样品中加入
２×上样缓冲液，混匀，反复冻融几次后，沸水浴５ ｍｉｎ，用１２％
的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测，同时 ＰＣＶ２特异阳性血清作Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ鉴定
２结果
２．１ ＰＣＲ扩增
以Ｔ１／Ｔ２为引物，重组质粒ｃａｐ—Ｔ为模板进行ＰＣＲ扩
增，ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳，扩增ｍ一约３８４ ｂｐ大小的
特异性片段，与预期结果相符（图１，Ａ）。
＋基金项目：广东省科技厅重大专项资助项目（Ｎｏ ２００４Ａ２０９０１０２）资助。
通讯作者。Ａｕｔｈｏｒｆｏｒ ｃｏ￣ｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．教授，主要从事动物疫病防制的研究。Ｅ—ｍａｉｌ：＜ｙｚｂｉ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ＞
收稿日期：２００７ ０７．０６接受日期：２００７—０８—２６