小麦ACCase CT功能域基因在大肠杆菌中的表达及与除草剂的相互作用
13分子习题答案
复习题:1、名词解释1、miRNA:----微小RNA,就是一种大小约为21-23个碱基单链小分子RNA,就是由具有发夹结构的约为70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工生成。
2、siRNA:----小干扰RNA(small interfering RNA),RNAi的关键效应分子,21-23个nt大小的双链RNA。
3、RNAi:----RNA干扰就是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象,它就是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象,这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(PTGS)4、PTGS:----转录后基因沉默,就是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象,它就是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)时,该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象,这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(PTGS)5、Nucleosome:----核小体:染色质的基本结构亚基,由约200 bp的DNA与组蛋白八聚体所组成6、Informasome----信息体,真核细胞mRNA通常与一些蛋白质结合成核蛋白颗粒(RNP),构成信息体7、Chaperon: ----分子伴侣就是一类能介导蛋白质进行正确折叠、组装的蛋白质,能协助蛋白质获得正确的构型。
8、Ubiquitin: ----泛素,就是生物体内广泛存在的一类酸性蛋白质;含76个氨基酸,序列在进化过程中高度保守,C-端为Gly,且分子内部有多个Lys。
9、Capsase: ----(Cysteine-containing aspartate-specific proteases天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶/切冬酶/胱冬肽酶)富含半胱氨酸,以非活性状态的酶原存在,其肽链比有活性时长一些,将多出的部分切除,就转变成有活性的caspase。
除草剂2甲4氯(小麦、大麦)
反应釜、离心机、干燥机等。其中反应釜是核心设备，用于化学合成过程中的多步反应；离心机用于 分离出化学合成或生物合成过程中的固体和液体；干燥机用于去除产品中的水分。
04
除草剂2甲4氯的毒性 与风险评估
对人体的毒性
急性毒性
2甲4氯对人体的急性毒性较低，但若摄入 大量2甲4氯，可能导致恶心、呕吐、腹痛 等胃肠道症状，以及呼吸困难、抽搐等严重 反应。
01
风险评估
在评估2甲4氯的风险时，需要考虑使用量、使用方法、天气条件、作物
类型等因素，以及可能的健康和环境影响。
02
安全使用建议
在使用2甲4氯进行除草时，应严格按照使用说明操作，避免直接接触皮
肤或吸入蒸汽。同时，应避免在风雨天气使用，以免影响效果和安全。
03
安全管理措施
在使用2甲4氯时，应穿戴防护服、手套、口罩等防护用品。如果发生意
VS
生物降解
2甲4氯在环境中能够被一些微生物降解 ，从而降低其对环境和生态系统的危害。
对环境的影响与安全性
对环境的影响
2甲4氯在使用过程中可能会对周围环境产生一定的影响，如污染水源、破坏土壤结构等。
安全性
2甲4氯在使用过程中需要注意安全问题，如避免直接接触皮肤和眼睛，以及避免吸入其粉尘等。同时，需要按照 规定使用，避免对环境和生态系统产生不良影响。
一般推荐在小麦、大麦分蘖前期或杂草出齐时使用。
使用方法
根据不同作物和防治对象，可以使用喷雾法、毒土法 或颗粒剂法进行施用。
注意事项与安全提示
注意事项
使用前需仔细阅读说明书，注意保护环境， 避免对邻近作物产生药害。
安全提示
施药时需穿戴防护服、手套和口罩，避免直 接接触皮肤和吸入药雾。
小麦TaSPX1_基因的克隆、表达及耐低氮逆境的功能研究
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2024, 50(3): 576 589 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail:***************DOI: 10.3724/SP.J.1006.2024.31025小麦TaSPX1基因的克隆、表达及耐低氮逆境的功能研究张宝华1,2刘佳静1,2田晓1,2田旭钊1,2董阔1武郁洁1肖凯3,*李小娟1,2,*1 河北农业大学生命科学学院, 河北保定071001;2 河北省植物生理和分子病理学重点实验室, 河北保定071001;3 河北农业大学农学院, 河北保定071001摘要: 包含SPX、SPX-EXS、SPX-MFS和SPX-RING四个亚族的植物SPX基因家族在磷信号应答中发挥重要功能, 但迄今对小麦的该家族基因成员功能了解尚少。
本研究前期从小麦(Triticum aestivum)中鉴定得到一个SPX亚族成员基因TaSPX1 (GenBank No. Ak332300), 亚细胞定位分析发现其定位于细胞核。
对TaSPX1和来自小麦、拟南芥和水稻SPX家族的同源蛋白进行系统进化分析, 结果表明, 其与水稻SPX亚族的OsSPX1亲缘关系较近。
应用RT-qPCR技术研究发现, TaSPX1的表达量在低氮胁迫下显著增加。
构建烟草(Nicotiana tabacum)过表达转基因系(overexpression lines, OE), 应用MS营养液培养对野生型(WT)和OE株系OE3和OE4植株表型进行鉴定。
发现在低氮胁迫下, OE3和OE4较WT表现明显的生长优势, 植株鲜重、根重和叶面积显著增加; 包括光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度和蒸腾速率在内的光合参数, 以及氮含量、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量也都较WT显著增加。
对氮吸收和同化相关基因的表达和酶活性测定结果表明, 上述基因的部分成员在OE植株中的表达量和氮同化酶活性升高。
利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC互作蛋白质
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(3): 423 430 /zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家自然科学基金项目(30871471), 河北省自然科学基金项目(C2011205085), 河北省自然科学基金基地项目(08B019)和河北师范大学博士基金(L2005B20)资助。
*通讯作者(Corresponding author): 赵宝存, E-mail: baocunzh@, Tel: 0311-********第一作者联系方式: E-mail: linfangfang1227@Received(收稿日期): 2012-07-09; Accepted(接受日期): 2012-11-16; Published online(网络出版日期): 2013-01-04. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20130104.1734.013.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00423利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC 互作蛋白质蔺芳芳 杨 旭 武小翠 刘晓梅 葛荣朝 赵宝存*河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄 050024摘 要: TaSC (Triticum asetivum L. salt-tolerance related gene, GenBank 登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。
以该基因编码的蛋白质TaSC 为诱饵, 运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA 表达文库中钓取互作蛋白质, 筛选到一个编码小麦未知功能蛋白质的基因(GenBank 登录号为AK336035), 命名为TaSCIP1 (TaSC interaction protein 1)。
双分子荧光互补(BiFC)实验证实TaSCIP1与TaSC 存在互作。
病毒介导的GFP-ATG8在小麦上的表达和在自噬活性监测上的应用
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(12): 2371 2378 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.01094病毒介导的GFP-ATG8在小麦上的表达和在自噬活性监测上的应用胡蕊洁杨向芸贾磊李玉如项月岳洁瑜王华忠*天津师范大学生命科学学院 / 天津市动植物抗性重点实验室, 天津 300387摘要: 自噬相关因子ATG8定位于自噬结构的膜上, 荧光蛋白标记的ATG8在过表达细胞内所呈现的点状荧光常用于表征自噬结构和监测自噬活性。
病毒介导的过表达(virus-mediated over-expression, VOX)是一种简便、快速制备目的基因过表达植株的技术。
采用基于狗尾草花叶病毒FoMV的VOX技术(FoMV-VOX)在小麦植株中表达GFP标记的小麦ATG8家族成员TaATG8a, 建立小麦活体植株的自噬活性监测技术平台。
构建了融合基因GFP-TaATG8a的FoMV-VOX载体, 采用Agroinfiltration方法在本氏烟草叶片中表达携带GFP-TaATG8a的FoMV基因组RNA和组装病毒粒子, 将烟草汁液中的病毒粒子摩擦接种于小麦幼苗植株叶片, 对接种植株叶片和根组织中的荧光信号进行观察和特征鉴定。
结果表明, 采用FoMV-VOX技术在小麦植株上不仅可以实现GFP-TaATG8a在接种叶片中的高效表达, 还可以借助病毒的系统侵染实现该融合基因在未接种叶片和根组织中的高效表达。
经饥饿处理激活自噬, 融合蛋白GFP-TaATG8a在植株叶表皮、叶肉以及根细胞中呈现表征自噬结构的点状荧光。
采用FoMV-VOX技术获得的GFP-TaATG8a过表达植株可以应用于小麦多种组织类型中的自噬活性调节机制和生理功能研究。
关键词:小麦; 病毒介导的过表达; ATG8; 细胞自噬Virus-mediated expression of GFP-ATG8 for autophagy monitoring in wheatHU Rui-Jie, YANG Xiang-Yun, JIA Lei, LI Yu-Ru, XIANG Yue, YUE Jie-Yu, and WANG Hua-Zhong*School of Life Sciences, Tianjin Normal University / Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin 300387, ChinaAbstract: ATG8 is an essential autophagy-related factor decorating on the membranes of autophagic structures. Fluorescenceprotein-tagged A TG8 expressed in live cells has been widely used to visualize autophagic structures and to monitor the activity ofautophagy. Virus-mediated over-expression (VOX) is a simple technique for rapid expression of genes of interest in plants. Herethe foxtail mosaic virus (FoMV)-based VOX was adopted for preparation of wheat seedlings over-expressing the GFP-taggedform of the wheat ATG8 family member TaATG8a. An FoMV-VOX vector was constructed for expression of the recombinantFoMV genomic RNA carrying the GFP-TaATG8a sequence. Expression of FoMV genomic RNA and assembly of FoMV virionswere accomplished in Nicotiana benthamiana leaves through agroinfiltration. N. benthamiana leave extract containing FoMVvirions was used to inoculate leaves of wheat seedlings. Fluorescence microscopy of virus-inoculated wheat seedlings showed theefficient expression of GFP-TaATG8a was in not only inoculated leaves but also systemic uninoculated leaves and roots. More-over, punctate fluorescence of GFP-TaATG8a representing autophagic structures was clearly observed in leaf epidermal cells,mesophyll cells, and root cells of wheat seedlings subjected to autophagy-stimulating starvation stress. The autophagy activity inthese cells could be evaluated by quantifying the GFP-TaATG8a-labeled autophagic structures. These results lay a foundation forstudies of the regulating mechanisms and physiological roles of autophagy in various wheat tissues.Keywords: wheat (Triticum aesticum L.); virus-mediated over-expression (VOX); ATG8; autophagy细胞自噬(autophagy, 简称自噬)与植物生长、发育、衰老、细胞死亡和逆境响应等过程密切相关[1-3]。
小麦重要自噬相关基因atg18的鉴定和表达分析_孙鸿
【 中国农业科学 2014,47(9):1657-1669 Scientia Agricultura Sinicadoi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.09.001小麦重要自噬相关基因 ATG18 的鉴定和表达分析孙鸿，张微，卫晓静，王华忠（天津师范大学生命科学学院/天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）摘要：【目的】克隆小麦重要自噬相关基因ATG18，分析其编码产物的序列特征和高级结构，了解其在生物、 非生物胁迫及激素处理条件下的表达模式，阐明其生物学功能。
【方法】利用EST 拼接和RT-PCR 方法从白粉菌侵 染的小麦叶片中克隆ATG18cDNA 序列，利用生物信息学方法进行基因的外显子-内含子结构分析、编码蛋白的结 构域和保守氨基酸预测、高级结构分析和物种间同源蛋白的进化分析。
采用实时荧光定量PCR 方法研究基因表达 对白粉菌侵染和外源激素处理的响应模式及对高盐、干旱、低温黑暗和缺氮培养等逆境胁迫处理的响应模式。
结 果】获得了4个小麦ATG18家族成员（TaATG18a 、TaATG18b 、TaATG18c 和TaATG18d ）cDNA 。
4个基因高度相似， 均含有1158bp 开放阅读框（ORF ），编码385个氨基酸的蛋白质。
4个基因的编码蛋白在一级结构上均含有典型 的WD-40结构域、磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P ）结合基序和保守的ATG2结合位点氨基酸残基。
4个基因均具有2 种转录后的可变剪接方式，2种剪接产物mRNA 分别编码完整的有功能蛋白和N 端截短导致结构域和功能位点缺失 的无功能蛋白。
TaATG18a 蛋白在高级结构上折叠成与其他WD-40蛋白类似的β-推进器样构象，PI3P 结合基序位 于推进器第五叶片的折叠4和第五、六叶片的连接部分，ATG2结合位点位于连接第二叶片和第三叶片的loop 上。
TaATG18s 能够被白粉菌侵染诱导表达，但具体的诱导表达模式在抗、感白粉病反应之间存在明显差异。
中国农业大学分子生物学导论实验技术习题
《分子生物学常用实验技术》课堂练习题参考答案学号：姓名：一、填空题。
1.在用SDS分离DNA时，要注意SDS浓度，0.1%和1%的SDS作用是不同的，前者，后者。
2.SDS是一种提取DNA时常用的阴离子去污剂，它可以溶解膜蛋白和脂肪，使细胞膜和核膜破裂，使核小体和核糖体解聚，释放出。
它还可以使蛋白质变性沉淀，也能抑制。
3.在分离DNA时，需要带手套操作，是因为。
4.用酚-氯仿抽提DNA时，通常在氯仿或酚-氯仿中加入少许异戊醇，这是因为有机溶剂异戊醇可以。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白质相和下层有机溶剂相维持稳定。
5.在分离DNA时，要用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸等，其目的是：。
6.在DNA分离过程中，造成DNA分子断裂的因素很多，主要有：、和。
7.在分离DNA时，常用酸变性、碱变性、热变性和来去除蛋白质。
8.用乙醇沉淀DNA的原理是：。
9.用乙醇沉淀DNA时，通常在DNA溶液中加入单价阳离子，如氯化钠和乙酸钠，其目的是。
10.通常可在3种温度下保存DNA：4～5℃、-20℃和-70℃，其中以℃为好。
11.浓缩DNA的方法通常有：包埋吸水法、蒸发法、膜过滤法和。
12.碱裂解法和清亮裂解法是分离质粒的两种常用方法，二者的原理不同，前者是根据，后者是根据。
13.在技术中，DNA限制性酶切片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素薄膜上，然后与放射性标记的DNA14.SSC是氯化钠和柠檬酸钠组成的试剂，其中前者作用是：，后者的作用是：。
15.在southern杂交中，DNA转移的速度取决于、和。
16.在重蒸酚中加入1%的8-羟基喹啉及少量β-巯基乙醇，不仅可以防止酚氧化，还可以抑制活性以及。
17.RNA分子经凝胶电泳后按大小不同分开，然后被转移到一张硝酸纤维素膜（尼龙膜）上，同一放射性DNA探针杂交的技术称__。
18.根据Northern杂交结果可以说明__。
TaCAD12和TaPK-R1过量表达转基因小麦的分子特性与功能分析
TaCAD12和TaPK-R1过量表达转基因小麦的分子特性与功能分析关键词：转基因小麦；小麦纹枯病；TaCADl2；TaPK-R1Ⅱ万方数据The analysis of TaCADl2 and TaPK-R1 overexpresstransgenic wheat lines with characterization and functionLuo Mei—ying(College ofAgriculture，Guangxi University,Nanning 5 3 0004，China)AbstractWheat is the main food crops in China．Wheat sharp eyespot is a soil—borne disease causing mainly by Rhizoctonia cerealis．Freezing is the one of the main natural disasters to affect thegrowth of wheat．Wheat cultivars resistant to sharp eyespot and freezing werevery scarce，therefore it is important significance to that isolation and cloned resistance to anti-R．cerealis freezing injury genes，studies its function，providing theoretical basis forbreeding of tolerance to both abiotic and biotic stress．In this study,we construction of theexpression vector and embryo calli of wild-type were bombarded by the gold particlecontaining p20一Rssp2897：6MYC-TaCAD 12 and pAHC25一MYC—TaPK-R1 vector DNA．achieved the TaCADl2 and TaPK-R1 transgenic wheat lines．The main results of TaCADl2 transgenic wheat lines are as follows：(1)Transgenic wheat plants in To-T2 generations were subjected to PCR，and qRT-PCR analyses．Five transgenic wheat lines were obtained．(2)Western blot analysis showed that five transgenic wheat lines c—MYC—TaCADl2 fusion proteins were expressed．(3)Sharp eyespot severity assessments analysis showed that the transgenic wheat plants expressing TaCADl 2displayed significantly enhanced resistance to sharp eyespot compared with non-transgenic wheat WT．The main results of TaPK-R1 transgenic wheat lines are as follows：(1)Analyses of the transgenic wheat plants in To—T4 generations with PCR，RT-PCR and qRT-PCR，and three transgenic wheat lines were obtained．(2)Western blot analysis showed that five transgenic wheat lines c-MYC—TaPK—R1 fusion proteins were expressed．(3)We wereIII万方数据statistical its survival rate，observational of proline comem and electrolyte leakage rate after freezing the transgenic wheat plants in T4 generations，the results showed that TaPK-R1 overexpression transgenic wheat lines adaptability to cold environment．(4)After inoculation丽th R．cereal&virulent-isolations R0301 and WK207，the sharp eyespot resistance tests showed that the transgenic wheat plants expressing TaPK-R1 displayed significantly enhanced resistance to sharp eyespot compared with non-transgenic wheat WT．(5)After inoculation with R．cerealis and freezing stress，three TaPK-RI transgenic wheat lines defense sharp eyespot and freezing tolerance were obtained．Key words：Transgenic wheat；wheat sharp eyespot；TaCADl2；TaPK-R1IV万方数据目录1前言．．1 1．1概述．1 1．2植物抗病机理的主要研究进展．．1 1．2．1小麦纹枯病研究进展一3 1．2．2冻害研究进展一5 1．3研究纹枯病的重要性．7 1．4本研究的目标．7 1．5技术路线．9 2转TaCADl2基因小麦的分子检测与功能分析．10 2．1材料与方法．11 2．1．1材料．11 2．1．2方法12 2．2结果与分析19 2．2．1转TaCADl2基因小麦的获得19 2．2．2转TaCADl2基因小麦的PCR检测19 2．2．3 TaCADl2在转基因小麦株系叶鞘中的转录分析20 2．2．4转基因植株的Western blot分析．2 1 2．2．5转基因小麦的纹枯病抗性鉴定．22 2．3讨{仑23 2．4结{仑24 3转TaPK-R1基因小麦的分子检测与功能分析．25V万方数据3．1材料与方法26 3．1．1材料．26 3．1．2方法27 3．2结果与分析32 3．2．1 TaPK-R1转基因小麦的获得．32 3．2．2转TaPK-R1基因小麦的PCR检测．32 3．2．3 TaPK-RI在转基因小麦株系中的转录分析33 3．2．4低温胁迫条件下TaPK-R1基因的表达特征分析34 3．2．5电解质渗漏率(相对电导率)的测定．35 3．2．6脯氨酸含量的测定．36 3．2．7转基因植株的Western blot分析．37 3．2．8低温胁迫表型鉴定与存活率统计．37 3．2．9转基因小麦的纹枯病抗性鉴定．39 3．3讨论40 3．4结论、42 4全文结论．．42 4．1转TaCADl2基因小麦的分子检测与功能分析．．42 4．2转TaPK-R1基因小麦的分子检测与功能分析43致谢．．44参考文献46VI万方数据英文缩略表英文缩写英文全称中文名称碱基对bp base pairCTAB cetyl trimethyl ammonium bromide 十六烷基三甲基溴化铵CAD cinnamyl alcohol dehydrogenase 肉桂醇脱氢酶DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯oI江open reading frames 开放阅读框IU’-PCR Reverse transcription PCR 半定量反转录PCR qRT-PCR Quantitative reverse transcription PCR 定量反转录PCR WT 、Ⅳild．锣pe 野生型VII万方数据亡堕盔堂塑主苎垡鲨壅丝堡趔星塑丝旦生丝塾量壅整整叁垦尘童垫坌至笪丝量盈整坌堑1前言1．1概述小麦是世界重要的粮食作物。
小麦TaMICU1-6A基因的克隆、生物信息学及表达分析
小麦TaMICU1-6A基因的克隆、生物信息学及表达分析李欣;李鲁华;任明见;安畅;洪鼎立;赵鹏鹏;徐如宏【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2024(52)5【摘要】为了探讨线粒体稳态调节蛋白TaMICU1基因在小麦生长发育中的功能,以小麦中国春为材料,对其TaMICU1-6A基因进行克隆、生物信息学分析、表达分析研究,结果表明,小麦TaMICU1-6A基因全长为1 398 bp,编码465个氨基酸,定位于线粒体,具有2个EF-hand家族的保守结构域,启动子含3种激素响应元件、3种光响应相关反应元件、1个缺氧特异性诱导相关元件;多重序列比对发现,其与野生二粒小麦、乌拉尔图小麦、小麦中的同源蛋白或同源基因的亲缘关系比较近。
RT-PCR结果表明,TaMICU1-6A基因具有组织特异性,不同非生物胁迫、不同激素处理下在根、茎、叶中的表达水平不同。
黑暗处理下,TaMICU1-6A基因在根、茎、叶中的表达水平均在6 h时达到最低;低温处理下,TaMICU1-6A基因在根、茎中的表达水平呈先降后升的趋势;在赤霉素处理下,TaMICU1-6A基因在叶片中的表达水平在6 h时达到最高。
综上所述,推测TaMICU1-6A基因通过激素介导的信号途径参与不同的非生物胁迫。
期待本研究结果可为进一步探讨小麦TaMICU1基因在逆境下的生物学功能提供一定的参考价值。
【总页数】10页(P42-51)【作者】李欣;李鲁华;任明见;安畅;洪鼎立;赵鹏鹏;徐如宏【作者单位】贵州大学农学院;国家小麦改良中心贵阳分中心【正文语种】中文【中图分类】Q78;S512.101【相关文献】1.小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析2.小麦TaWRKY71a基因克隆、生物信息学及表达分析3.小麦TaZFP33基因克隆、生物信息学分析、亚细胞定位与表达分析4.小麦丙氨酸-乙醛酸转氨酶基因(TaAGT2)的克隆、生物信息学预测及表达分析5.小麦Ta-UBX1基因克隆、表达及生物信息学分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
燕麦乙酰辅酶A羧化酶基因CT区的克隆及CRISPRCas9技术体系建立
燕麦乙酰辅酶A羧化酶基因CT区的克隆及CRISPR/Cas9技术体系建立燕麦属于禾本科燕麦属(Avena L.),一年生草本植物,是重要的粮食及饲草、饲料作物。
化学除草剂的出现及广泛使用为田间除草带来了有效且省工的办法。
“拿捕净”又名稀禾啶,是一种选择性除草剂,使用“拿捕净”清除燕麦田间的禾本科杂草时会对燕麦造成伤害,限制了除草剂对燕麦田间禾本科杂草的清除。
乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是植物代谢过程中催化植物脂肪酸合成的关键酶、限速酶,是“拿捕净”除草剂作用的靶蛋白,“拿捕净”识别ACCase的蛋白结构并与之相结合,从而达到抑制ACCase活性的目的,使脂类代谢受阻,进而杀死禾本科杂草。
本研究克隆甜燕1号(sweety 1)的ACCase的CT区序列,进行生物信息学分析;构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过基因枪转化法将载体导入甜燕1号(sweety 1)成熟胚中,以期获得抗“拿捕净”燕麦新种质。
研究得到以下结果:1.利用同源序列克隆的方法,得到燕麦ACCase基因的CT区序列的2188bp,与已经报道的小麦(Triticum aestivum)、日本看麦娘(Alopecurus japonicus)、大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides)等ACCase序列同源性较高。
且小麦序列中第1769个氨基酸位点是异亮氨酸,对“拿捕净”不敏感,通过对比燕麦的ACCase基因在该位点因为同样是是异亮氨酸。
2.利用CRISPR/Cas9技术构建了抗“拿捕净”表达载体。
3.得到53株经基因枪转化的植株,经阳性鉴定分析,一共获得2株Cas9编辑所产生的突变植株。
均为小片段的缺失,这种缺失是随机的不定向缺失,但在这2株有突变的转基因植株中,均没有检测到修复模板的正确整合。
4.本试验中利用基因枪法的转化效率为3.8%。
本研究首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对燕麦基因组进行编辑,为基因编辑技术在燕麦分子育种中的应用提供了实验依据。
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高纯度 目的蛋白， 在此基础上对蛋白的性质进行了优化和调整 ， 并采用圆二色光谱及差热扫描分析对 纯化的 Ｃ Ｔ功能域蛋白与除草剂的相互作用进行 了初步研究．
收稿 日 ： ０ ０１ － ． 期 ２ １． ２ ２ ３
基金项 目： 国家 自然科学基金 （ 批准号 ： ０ ３ ００， ００ ０ ５和 ３ ８ ０３ ） 助． ２４ ２ １ ２ ８２ ２ ０ ７ ５９ 资
但是 以包涵体形式存 在 ； １６ ｐ ３ ０ ｐ基 因则不能表达．通 过圆二 色光谱及差热 扫描分析对纯化 的 而 ８ ９ｂ 及 ５ １ｂ Ｃ Ｔ功能域蛋 白与除草剂 的相互作用进行研究表 明， 除草剂存在下 ，Ｃ 在 Ｔ蛋 白的光谱发生显著 变化 ， 明除 说 草剂与可溶性蛋 白之间存 在较 强的相互作用 ．
目 ， 前 禾本科植物的质体 Ａ Ｃ ｓ 被发现是芳氧苯氧丙酸类 （ ｒ ｏｙｈｎｘｐ ｐ ｎｔ， Ｐ ） Ｃ ａｅ Ａｙ ｘｐ ｅｏｙｒ ｉ ａ Ａ Ｐ 和环 ｌ ｏｏ ｅ 己二酮类 （ ｙｌ ｅａｅｉ ｅ Ｃ Ｄ） Ｃ ｅ ｈｘｎｄ ｎ ， Ｈ 两大类除草剂作用于植物的靶蛋 白 ｌ ．动力学研究表 明， ｏ ｏ ～ Ｏ Ｊ 这两 类 除草剂 作用 的靶点 是 Ａ Ｃ ｓ Ｃ ａｅ的 Ｃ Ｔ功能 域 ¨ 它 们选 择 的基 础是 识别 其 结构 ， 制 其活 性 ， 卜ｎ ， Ｊ 抑 使
联系人简介 ： 曹淑桂 ， ， 女 教授 ， 博士生导师 ， 主要从事酶工程研究．Ｅｍ ｉ ｃｏ ＠ｊ ．ｄ ．ｎ — ａ ： ａ ｇ ｌ ｅｕ ｃ ｌ ｓ ｕ 郑 良玉 ， ， 女 博士 ， 副教授 ， 主要从事化学生物学研究 ． － ａ ：ｙ ｅ ｇ ｌ．ｄ ．ｒ Ｅｍ ｉ ｌ ｈ ｎ＠ｊ ｅｕ ｃ ｌ ｚ ｕ ｌ
脂肪 酸生 物合成 受 阻 ， 成禾本 科植 物死 亡．这两类 除 草剂 可 以选 择性 地 杀 死禾 本科 杂草 ，而对 其它 造 作 物无影 响 ，因此作 为 高效低 毒 的除草剂 在农业 中广泛 应用 ．然 而 ，随着 这 两类 除 草剂 的长期 大 面积 使用 ， 其不 敏感 的禾本科 杂 草相继 出现 ， 何克服 禾 本科 植 物 的耐 药性 成 为 近年来 的研究 热 点 ．对 对 如 这一 问题 进行 系统研究 的前 提是 了解 禾本 科 植 物 Ａ Ｃ ｓ Ｃ ａｅ的 Ｃ Ｔ功 能域 对 除 草剂 的选择 性识 别 机 制 和 抗性 机制 ．然 而 ，对 于 机 制 的研 究 首 先 需 要 获 得 足 量 的 高 纯 度 实 验 材 料—— ｃ Ｔ功 能 域 蛋 白．由 于 Ａ Ｃ ｓ 在生 物体 内含量 低 ， 以纯化 且该酶 稳定 性不 高 ，因此从 组织 、 胞 中提取该 酶作 为 研究 材料 Ｃ ａｅ 难 细 几乎 是不 可能 的 ’ ．通过 体外 表达 获得 重组蛋 白是解 决这 一 问题 的有 效途 径 ｕ Ｊ ¨ Ｊ ． 本 文采 用基 因工程 的方 法在 大肠杆 菌 中成 功表 达小麦 质体 Ａ Ｃｓ Ｔ功 能域蛋 白，经纯 化后 获得 Ｃ ａｅＣ
Ｖｏ ． ２ １３
２１ ０ １年 １ ２月
高 等 学 校 化 学 学 报
ＣＨＥＭＩ ＡＬ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＩ Ｃ Ｊ ＮＥＳ Ｅ ＵＮＩ ＶＥＲＳＴ ＥＳ ＩＩ
Ｎｏ． ２ １
２ ７～２ ２ ８ｌ ８２
小 麦 ＡＣ ａｅＣ Ｃ ｓ Ｔ功 能域 基 因在 大 肠 杆 菌 中的 表 达 及 与 除 草 剂 的相 互 作 用
的 ３个 功 能域 组成 曲Ｊ 别 为生 物 素羧 化 酶 （ ｉｉ ａｂｘｌｓ，Ｂ ） 能域 、生 物素 羧基 载 体 蛋 白 ，分 Ｂｏｎｃｒｏｙ ｅ Ｃ 功 ｔ ａ （ ｉｉ ｃｒｏｙ ｃｒｅ ｒｔｎ Ｂ Ｃ ） Ｂｏ ｎ ａｂｘｌ ａｒ ｒ ｏｅ ， Ｃ Ｐ 功能 域及 羧基转 移酶 （ ａｂｘｈａｓ ｒｓ， Ｔ 和 Ｃ —） ｔ ｉ ｐ ｉ Ｃｒｏｙｒｎｆ ａｅ Ｃ ｅ Ｔ 功能域 ．
关键词 乙酰辅酶 Ａ羧化酶 ；羧基转移 酶功 能域 ； 白表达 ； 蛋 相互作用 ； 除草剂 中图分类号 ０ ２ ； ７ ６ ６ ９ Ｑ ８ 文献标识码 Ａ 文章编号 ０ ５ －７０ ２ １ ）２２ １－６ ２ １ ９ （０ １ １ —８７ ０ ０
乙酰辅酶 Ａ羧化酶（ ｃｔ ．ｏ ａ ｏｙ ｓ， Ｃ ａｅ 在生物体 中广泛存在 ， Ａ ｅ １ Ａｃｒ ｘｌ ｅ Ａ Ｃ ｓ） ｙＣ ｂ ａ 是控制脂肪酸代谢的 关键酶 ， 也是近年来发现的可以开发手性抑制剂的重要靶标¨ ．植物中的 Ａ Ｃ ｓ Ｊ Ｃａ ｅ由一条多肽链构成
Ａ Ｃｓ Ｃ ａｅ的主要 功能是 催化 乙酰辅 酶 Ａ（ ｅｔ —ｏ 羧 化 生成 丙 二 酰 辅酶 Ａ（ ｌ ｙ－ ｏ ，反 应包 Ａ ｅ ｌ Ａ） ｙＣ Ｍａ ｎ Ｃ Ｔ功能 域催化 完成 ， 而连 接有生 物 素的 Ｂ Ｃ Ｃ Ｐ功 能域则 在 Ｂ Ｃ和 Ｃ Ｔ功能 域之 间 传 递羧基 ， 一过 程是生 物合 成脂肪 酸 的限速 步骤 ． 这
王瑞俭 ， 良玉 杨 雪莹 ， 郑 ， 杨 晔 王晓娟 ， ，曹淑桂
（ ．吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室 ， １ 长春 １０ １ ； ３０ ２
２ ．北华大学林学 院林业与生态环境实验室 ，吉林 １２ １ ） ３ ０ ３
摘要
以中国春小麦幼苗为材料 ， 克隆构建 了小麦 质体 乙酰辅酶 Ａ羧化 酶 （ Ｃ ａｅ 的羧基 转移 酶（ Ｔ） Ａ Ｃ ｓ） ｃ 重
组质粒 （ Ｃ １—） 并实现 了重组质粒在大肠杆菌 中的可溶性高表达．对重组蛋 白的性质研究 表明 ， Ｒ Ｐ ８５ ， 该蛋 白
具有较强 的疏水性 ， 稳定性不高．为改善这种状况 ， Ｃ 对 Ｔ功能域基 因进 行 了截短和延 长 ，同样 于大肠杆菌 中进行表达．结果表 明，仅长度为 ２ ２ ｐ的完整 ｃ ３５ｂ Ｔ功能域基 因能 以可 溶形式表 达 ； １９ｂ ２０ ｐ基 因可表达 ，