实验二十三凝胶层析分离血红蛋白和核黄素
凝胶层析技术(凝胶过滤)
目前使用较多的是葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶，其商品为生物凝胶-P（Bio-Gel P）组成单位是丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）与 甲叉双丙稀酰胺，共聚交联成聚丙烯酰胺。 优点：全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。 缺点：不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝 胶带有一定的离子交换基团，一般只在pH为11范 围内使用。 交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）。 优点：具有良好的化学稳定性等优点。目前最常用。
原理
● 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。 ● 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙， 随着溶剂流动，首先流出层析柱； ● 相对分子质量较小的物质可自由地进出 凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率 慢而最后流出层析柱。 ● 中等大小的分子在大分子物质与小分子 物质之间被洗脱。 ● 这样，经过层析柱，混合物中的各物质 按其分子大小不同而被分离。
3、样品的加入 吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上， 不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。 打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩 展洗脱，用试管将洗脱液。 4、洗脱： 加0.1mol/l的Nacl溶液洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一 管。 5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。 6、凝胶的回收。
特点：与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大小 有关
Kd=0
大分子量 小分子量
Hale Waihona Puke 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、 多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可 以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、 去热源和脱色。
实验二 凝胶层析法
【目的】
学习和掌握凝胶层析的基本原理和操作技术
学习使用Sephadex G-75分离核黄素与酪蛋白
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。
四、核黄素与酪蛋白的分离
打开层析柱出口，使柱面溶液流出，直至床面
与液面刚好齐平，关闭出口，将10滴样品沿层析 柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，流出液
分别收集。
流速大约10滴/分钟，每管收集30滴。
从无黄色的各收集管中每管取1滴溶液加于白
瓷板上，分别滴加1滴双缩脲试剂，找到颜色最深 的2管样品，转移至Eppendorf管，标记后冻存于20℃冰箱。
凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋
白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。 单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝
胶的筛孔的大小不同。
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶 珠
凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的
程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的
顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
【实验器材】
层析柱:1.2×20cm, 1支
100ml烧杯，1只
样品的准备
0.1g酪蛋白样品置离心管中，加入 0.1mol/L NaOH溶液3ml,蒸馏水2ml,60℃水 浴使其溶解，至室温后调PH至8.0 加入少量核黄素粉末使饱和，3000rpm 离心5min，取上清液备用
凝胶层析技术(凝胶过滤)
四、凝胶层析的特点
1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不 会与被分离物质相互作用，分离效果好，重 复性高。 2、设备简单，操作简便。
五、影响凝胶层析的因素
（一）凝胶的选择： （二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。 100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对 称和狭窄。 250-400目为最细粒。 （三）洗脱流速对分离效果的影响： 一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。 （四）离子强度和附值 （五）样品液体积对分离效果的影响 通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。 （六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系 （七）Vo和Vi
其结构如图：
由右旋葡萄糖单位通过1.6-糖苷键连结成链状结构，再由 3-氯-1,2-环氧丙烷（Cl-CH2-CH-CH2）作交联剂而形成 的多孔网状结构的高分子 、 （1）凝胶在使用前必须在过量的溶剂中充分地 膨胀，否则影响层析的均一性，甚至使柱破裂， 自然溶解需24小时以上，加热至沸需2小时即可。 （2）用倾斜法除去混杂的小颗粒，重复2-3次。 2、凝胶的装填 、 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作。 a.将柱垂直安装好 b.在柱内先装入1/5的水，用玻棒搅拌凝胶沿玻 棒倒下待凝胶开始沉降时，打开出口。凝胶床 必须装得均匀，尽量一次装完，以免出现不均 匀的凝胶带，因此，在装柱时需打开下口，并 调节适当的流速。 c.连接恒压洗脱瓶，平衡流速，开始流速不能 太大，应低于层析时所需的流速。 d.经平衡后的凝胶床顶部留下1ml左右的液体。 关闭出口管上的螺旋夹。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外还可进入凝胶颗粒的微孔之中因此在向下移动的过程中它们先从凝胶内扩散至颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒这样不断进入和扩散必然使小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而使样品中分子大小不同的物质流出柱外而得到分离
生化实验血红蛋白的凝胶过滤
血红蛋白的凝胶过滤植物098 原硕0901080808摘要：用凝胶过滤分离血红蛋白样品，理解凝胶过滤原理，熟悉凝胶过滤操作方法。
关键字：血红蛋白，凝胶过滤一、研究背景及目的：凝胶过滤（gel [filtration] chromatography ; gel filtration chromatography ; GFC）作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，具有它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果等优点。
在很多方面都有所应用：⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液所以理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解凝胶过滤的基本原理，熟悉和掌握凝胶过滤的基本操作技术。
凝胶柱层析分离丙种球蛋白与核黄素
丙种球蛋白：按其来源不同可分为两种， 一种是从健康人静脉血中提取制成的人血 丙种球蛋白，另一种是从健康人胎盘血中 提取制成的人胎盘血丙种球蛋白。二者作 用相同，后者价格低于前者，且用量多于 前者，但目前已停产。有些人盲目地、错 误地认为丙种球蛋白是营养药、是补针， 于是不管病情轻重、有病无病地滥用，结 果会导致不良反应
（三）上样
1. 先将柱的出口打开，让PBS逐渐流出，待 液面与凝胶床面平齐时，关闭出口（注意： 不可使凝胶柱表面干涸）。 2. 用刻度吸管取样品混合液0.5ml，沿管壁小 心加于柱床表面，打开层析柱出口端，待 样品完全渗入胶内，开始收集流出液，同 时小心加洗脱液（PBS），
控制流速：1滴/5-6秒。（注意柱床上要不 断加PBS，保持1cm高水层）
凝胶柱层析法分离丙种球蛋白与核黄素
班级：生药1313 姓名：汤浩俊 组别: 第五组 学号：2013040947
一、简介 二、层析技术的原理 三、层析
四、实验器材
五、实验步骤 六、注意事项
简介
核黄素：维生素B2，又称核黄素，维他命B2。 分子式C17H20N4O6。作为维生素B族的成员之 一，核黄素水溶性较低，但在碱性溶液中 容易溶解，在强酸溶液中稳定，光照及紫 外照射引起不可逆的分解。可溶于氯化钠 溶液，维生素B2是机体中许多酶系统的重 要辅基的组成成分，参与物质和能量代谢。 核黄素在机体中有递氢的作用，并是机体 中一些重要的氧化还原酶的辅酶。
四、实验步骤
凝胶的溶胀
装柱
上样
洗脱、收集及测定
四、实验步骤
（一）凝胶的准备 称取Sephadex G-50 3g，臵于锥形瓶中， 加PBS约50ml，在沸水浴中加热2h溶胀 凝胶，用PBS漂洗，去除飘浮的细小颗 粒，冷却到室温后再装柱。
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是一种存在于红细胞中的重要蛋白质，它负责运输氧气到身体的各个部位。
对于血红蛋白的分离和提取，无论是在医学研究、疾病诊断还是生物技术领域，都具有重要的意义。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先需要了解它的基本性质。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，相对分子质量约为 64500，等电点在 7 左右。
准备工作是必不可少的。
我们需要新鲜的血液样本，通常可以从健康的志愿者或者实验动物身上获取。
采集到血液后，要尽快进行处理，以防止血红蛋白的变性和降解。
第一步是红细胞的分离。
将采集到的血液加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，然后通过离心的方法，将红细胞从血浆中分离出来。
离心的速度和时间需要根据具体情况进行调整，一般来说，以较低的转速离心一段时间，就可以使红细胞沉淀在离心管的底部。
得到红细胞后，接下来就是裂解红细胞以释放出血红蛋白。
常用的方法是低渗裂解法，将红细胞置于低渗溶液中，如蒸馏水，红细胞会因为吸水而膨胀破裂，释放出其中的内容物，包括血红蛋白。
然后是去除杂质。
裂解后的溶液中含有大量的其他细胞成分和杂质，需要通过过滤、离心等方法进行去除。
例如，可以再次离心，使较大的细胞碎片沉淀下来，然后取上清液。
接下来就是血红蛋白的初步分离。
常用的方法有盐析法。
向溶液中逐渐加入适量的中性盐，如硫酸铵，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度会逐渐降低而沉淀出来。
不同的蛋白质在不同的盐浓度下沉淀，通过控制盐的浓度，可以初步分离出血红蛋白。
经过初步分离后，还需要进一步的纯化。
层析法是常用的手段之一。
比如凝胶过滤层析，根据蛋白质分子大小的不同进行分离；离子交换层析，依据蛋白质的带电性质差异来分离。
在分离和提取的过程中，要始终注意保持适当的温度、pH 值等条件。
温度过高或过低、pH 值不适宜都可能导致血红蛋白的变性和失活。
另外，实验过程中的操作要规范、细致，尽量减少人为因素造成的误差和损失。
例如，在转移溶液时要避免洒出，使用的仪器要经过严格的清洗和消毒。
【凝胶色谱法的原理和方法】血红蛋白的提取和分离
【凝胶⾊谱法的原理和⽅法】⾎红蛋⽩的提取和分离【课题】：课题6 ⾎红蛋⽩的提取和分离【备课⼈】：【备课时间】：【上课时间】：【课型】：复习【课时数】：1课时【复习⽬标】本课题通过尝试对⾎液中⾎红蛋⽩的提取和分离，使学⽣能够体验从复杂体系中提取⽣物⼤分⼦的基本过程和⽅法，并了解⾊谱法、电泳法等分离⽣物⼤分⼦的基本原理，为今后学习运⽤这些技术打下基础。
【复习重点与难点】复习重点：凝胶⾊谱法的原理和⽅法。
复习难点：样品的预处理；⾊谱柱填料的处理和⾊谱柱的装填。
【知识回顾】：⼀、实验原理蛋⽩质的物化理性质：形状、⼤⼩、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和⼒等千差万别，由此提取和分离各种蛋⽩质。
1．凝胶⾊谱法（分配⾊谱法）：（1）原理：分⼦量⼤的分⼦通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分⼦量⼩的分⼦穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：混合物上柱→洗脱→⼤分⼦流动快、⼩分⼦流动慢→收集⼤分⼦→收集⼩分⼦＊洗脱：从⾊谱柱上端不断注⼊缓冲液，促使蛋⽩质分⼦的差速流动。
（4）作⽤：分离蛋⽩质，测定⽣物⼤分⼦分⼦量，蛋⽩质的脱盐等。
2．缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的⽤量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作⽤：抵制外界酸、碱对溶液pH的⼲扰⽽保持pH稳定。
3．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋⽩质的带电性质、电量、形状和⼤⼩不同，在电场中受到的作⽤⼒⼤⼩、⽅向、阻⼒不同，导致不同蛋⽩质在电场中的运动⽅向和运动速度不同。
（2）分离⽅法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
（3）分离过程：在⼀定pH下，使蛋⽩质基团带上正电或负电；加⼊带负电荷多的SDS，形成“蛋⽩质－SDS复合物”，使蛋⽩质迁移速率仅取决于分⼦⼤⼩。
⼆、实验步骤1．样品处理①红细胞的洗涤洗涤红细胞的⽬的是去除杂蛋⽩，采集的⾎样要及时采⽤低速短时间离⼼分离红细胞，然后⽤胶头吸管吸出上层透明的黄⾊⾎浆，将下层暗红⾊的红细胞液体倒⼊烧杯，再加⼊五倍体积的⽣理盐⽔，缓慢搅拌10min，低速短时间离⼼，如此重复洗涤三次，直⾄上清液中没有黄⾊，表明红细胞已洗涤⼲净。
凝胶层析分离混合蛋白实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除凝胶层析分离混合蛋白实验报告篇一：凝胶过滤法分离蛋白质实验报告凝胶过滤法分离蛋白质一、实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
二、实验原理凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。
高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。
当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。
由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。
三、试剂与仪器0.1mol/L磷酸缓冲液（ph7.0），0.4%K3Fe(cn)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒四、实验步骤1.凝胶溶胀2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。
使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。
待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。
3.样品处理4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm 处沿管内壁轻轻加入样品。
打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。
凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。
5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。
并观察柱上的色带，待黄色篇二：生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。
2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。
二、实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
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实验二十三凝胶层析分离血红蛋白和核黄素
实验二十三凝胶层析分离血红蛋白和核黄素
【目的】
1. 掌握凝胶层析的基本原理。
2.熟悉凝胶层析的操作过程。
【原理】
凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。
当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。
本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。
这样就可达到分离核黄素和血红蛋白的目的。
收集洗脱液后，在分光光度计上测定两种组分的吸光度，绘制洗脱曲线。
【器材】
分光光度计、离心机、层析柱、细乳胶管、三角烧瓶、刻度吸管、量筒、试管、试管架、滴管、细玻璃棒、可调螺旋夹、坐标纸、铅笔、玻璃棉或海绵垫。
【试剂】
1．葡聚糖凝胶SephadexG-25 或SephadexG-50
2．核黄素饱和水溶液
3．生理盐水
4．甲苯
5．血红蛋白溶液
取抗凝血2ml置离心管中，2000r/min离心10min，使血细胞沉淀，弃去血浆及白细胞层。
向红细胞沉淀加入生理盐水4ml，振摇洗
涤，2000r/min离心10min，弃去上清液，共洗涤三次。
向沉淀加入蒸馏水2ml，混匀，再加入甲苯1 ml，猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。
2000r/min离心10min，取上清血红蛋白溶液备用。
6．0．1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）
取0．1mol/L磷酸氢二钠720ml和0．1mol/L磷酸二氢钠280ml,混匀。
【操作】
1.凝胶准备
称取SephadexG-25 5g或SephadexG-50 3g,加磷酸盐缓冲液50ml，置于水中浸泡6小时（沸水浴中溶胀2小时），用磷酸盐缓冲液漂洗，去除漂浮的细小颗粒。
2.装柱
取直径0.8～1.2cm长25～30cm的层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫。
关住层析柱出口，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。
当凝胶颗粒沉积约2cm高时，打开出口，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达18cm时为止。
关闭层析柱出口，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。
如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。
凝胶床表面要保留1cm高的缓冲液。
3.样品制备
将核黄素饱和水溶液和血红蛋白溶液按1:1(体积比)混匀。
4.加样
打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。
用吸管吸取待分离样品溶液约0.5ml,在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。
打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床。
然后再用滴管沿层析柱内壁加入磷酸盐缓冲液，约1cm高。
加样不可过多，以免分离不完全。
5.洗脱
将装有细玻璃管的橡胶塞塞住层析柱入口，使细玻璃管的下端插入液面，但不可接触凝胶床表面。
将装有磷酸盐缓冲液的下口瓶调好位置，使其略高于层析柱，将其流出管接在层析柱橡胶塞的细玻璃管上，保持密闭状态。
打开下口瓶出口，然后打开层析柱出口,使磷酸盐缓冲液缓缓流出，保持4～6滴/min的流速。
洗脱速度不可过快，以免区带不清晰。
6.收集
随着层析的进行，凝胶床将出现两条明显的区带，血红蛋白区带在下，核黄素区带在上。
当血红蛋白区带即将流出时，开始收集，每管收集约1ml，直到流出液变为无色为止，约需收集5～6管；以同样方法收集核黄素。
7.测定
在540nm波长下，以磷酸盐缓冲液调零，测定血红蛋白和核黄素各管吸光度。
【结果及分析】
以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。
分析实验结果并说明原因。
【思考题】
1．比较凝胶层析与分配层析在实验原理上的区别。
2．要使凝胶床达到实验要求，需注意哪些操作？。