酶工程复习题(用)

1.酶工程主要涉及哪些方面的研究和运用。

酶工程主要指天然酶制剂在工业上的大规模应用，由4个部分组成：①酶的产生；②酶的分离纯化；③酶的固定化；④生物反应器。

酶工程的应用范围:（1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；（5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。

2.应用微生物来开发酶有哪些优点。

①微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样

②微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶

③微生物培养基来源广泛、价格便宜

④可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高

⑤可以利用以基因工程为主的近代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种

3.什么是专一性不可逆抑制，试举例说明。

专一性不可逆抑制：不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性。如有机磷杀虫剂抑制昆虫的乙酰胆碱酯酶就是这种方式。有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，乙酰胆碱不能及时分解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状。4.联系实验教学举例说明菌种分离的一般过程。

菌种分离的一般过程：土样的采取，预处理，培养，菌落的选择，产品的鉴定。

以枯草芽胞杆菌的分离为例：

②带菌土壤的热处理：称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。

②配制分离选择培养基，灭菌备用。

③稀释制备菌液：取5支灭菌带帽15ml离心管，各加入无菌水9ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水50ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入1ml微生物悬液，混合均匀后再取1ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取1ml 到第三支试管中，以此类推。

④配制斜面培养基，灭菌备用。

⑤涂布培养：取10-3、10-4、10-5、10-6稀释菌液各0.2ml，采用涂布和混合法形成8 个平板，倒置后在37℃培养24-48 小时，观察水解圈的形成，在无菌条件下将水解圈最大的菌落(水解圈/菌落最大者)转接种于斜面试管中在37℃培养。

5.酶发酵生产的菌株一般需具备什么条件。

①不是致病菌，在系统发育上最好是与病原体无关

②能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高

③菌种不易变异退化，不易感染噬菌体

④最好选用产生胞外菌的菌种，有利于酶的分离，回收率高

6.产酶微生物诱变育种步骤的主要方法和步骤

主要方法：物理、化学或生物诱变方法

诱变育种步骤：出发菌株的选择、处理菌悬液的制备、诱变处理、中间培养、分离和筛选7.简要说明微生物产酶（生产）的主要发酵方式

（1）固体发酵法：利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷壳，豆饼等，加水拌成半固体状态，供微生物生长和产酶用。分为浅盘法、转桶法、厚层通气法等

（2）液体发酵：以液体为培养基，进行微生物的生产繁殖和产酶。分为液体表层发酵法和

液体深层发酵法

（3）固定化细胞发酵

优点：①固定化细胞的密度大，反应器生产强度大；②发酵稳定性好，可以连续使用较长时间，易于连续化，自动化生产；③可在高稀释率的条件下连续发酵（D＞μm）,提高设备利用率；④发酵液含菌体较少，利于产品分离。

8.哪些因素影响微生物发酵产酶？如何提高微生物产酶量?

培养基营养物质：碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶促进剂、微量元素以及发酵条件：pH值、温度、溶解氧、泡沫、湿度均影响微生物发酵产酶。提高微生物产酶量的方法主要有：通过条件控制提高产酶量，如添加诱导物、降低阻遏物浓度；通过基因突变提高产酶量，如使诱导型转变为组成型、使阻遏型转变为去阻遏型；其他方法，如添加表面活性剂、使用其他产酶促进剂

9.什么是组成型突变，什么是抗分解代谢物阻遏突变？

组成型突变：与酶的合成有关的调节基因的一种突变。即原来酶的合成量受调节基因调节的诱导酶或阻遏酶，由于调节基因发生变异，酶的合成变为组成型（不管生长条件如何，酶的合成量总是恒定的）的一种现象。

分解代谢物效应（阻遏）指细胞内同时有两种分解底物存在时，利用快的那种底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。抗分解代谢物阻遏突变是指产生的突变解除了分解代谢物阻遏。

10.酶生物合成的模式有哪些？阐述理想的酶合成模式。

酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。同步合成型：酶合成与细胞合成生长同步。当细胞进入对数生长期，酶大量产生；细胞进入平衡期后酶合成停止。其生物合成可被诱导，不受分解代谢产物和尾产物阻遏，对应的mRNA不稳定。延续合成型：酶合成伴随着细胞生长开始，但在细胞进入平衡期后，酶还可延续合成较长的一段时间。可诱导，不受尾产物阻遏和降解代谢产物阻遏，其对应mRNA 相对稳定。中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而进入细胞平衡期之后合成终止。受尾产物阻遏，其对应的mRNA不稳定。滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期之后酶才开始回成并大量积累。可能受分解代谢产物阻遏，阻遏解除后，酶合成开始。其对应的mRNA稳定性高。其中最理想的合成模式是延续合成型。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术，选育得到优良的菌株，并通过工艺条件的优化控制，使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。

11.什么是固定化酶，它们用于生产有哪些优点

固定化酶：水溶性酶通过物理和化学的方法，使之与不溶性载体结合形成的一种不再溶解的酶。

优点：①极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；

②可以再较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化；

③酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化；

④在绝大多数情况下提高了酶的稳定性；

⑤较能适应于多酶反应；

⑥酶的使用效率提高，产物得率提高，产品品质有保障，成本低

12.酶的固定化方法主要有哪些？作简单阐述

将酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的酶，叫固定化酶。制备固定化酶的方法很多，有包埋法，吸附法，共价键结合法，以及交联法等

1.包埋法：将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。操作简单，可制得较高活力的固定化酶。

2.吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法。常用的吸附剂有活性炭，氧化铝，硅藻土，多孔陶瓷，多孔玻璃，硅胶，羧基磷灰石等.操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体价廉易得，可反复使用。但酶与载体结合不太牢固易脱落

3.共价键结合法：酶蛋白侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。酶与载体牢固，制得的固定化酶稳定性好。但制备过程中反应条件较为强烈，难以控制，易使酶变性失活，且制作手续繁琐。

4.交联法：利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间、或酶与惰性蛋白间进行交联反应以制得固定化酶的方法。常用的试剂有戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。制备的固定化酶结合牢固，可长时使用.但由于交联反应较激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失较大

13.结合实验阐述一种固定化菌体的方法和步骤。

以酵母细胞的固定化为例，本实验固定化的方法是把细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，滴进氯化钙溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球。细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。通过包埋法，对酵母活细胞进行固定。并对麦芽汁进行发酵实验。

操作步骤①调取活化培养24h的酵母斜面菌种一环，接种于10ml麦芽汁试管中，25℃摇瓶培养48h。

②取酵母菌体悬浮液10mL，悬浮在10mL4%海藻酸钠溶液（冷却到约50度不太烫手）中混合均匀。

③用灭过菌的注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴入到50mL氯化钙溶液中，浸泡30~120min 使之形成凝胶珠。

④待凝胶珠在溶液中泡30min 后，滤出凝胶珠得到固定化细胞。转到200ml 三角瓶中，用无菌水洗涤3次，胶珠转入用75%乙醇消毒过的可乐瓶中注入约2/3 体积的无菌麦芽汁，密闭在25℃下发酵7-9 天，注意适当放气勿使其爆炸。

14.什么是酶的分子修饰，修饰的目的有哪些？

各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。

意义：①提高酶的活力②增强酶的稳定性③降低或消除酶的抗原性④研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响

15. 什么是酶的体外定向进化，什么是DNA改组（DNA shuffling）

所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。

DNA改组（DNA shuffling）又称有性PCR DNA或DNA重排，是运用随机突变技术，对某种感兴趣的蛋门质或核酸进行快速的改造，并定向选择所需性质的生物分子的方法。16.酶的非水相催化有何优点，它们的主要类型有哪些？

优点：①提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续生物转化

②水解酶能催化合成反应，如脂的合成和肽的合成.

③可以控制由水引起的副反应

④酶不溶于有机介质，易于回收再利用

⑤酶的固定化简单，可以只沉积在载体表面

⑥从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易

⑦酶的热稳定比水高，而且没有微生物污染

类型：

⑴有机介质中的酶催化：有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。

⑵气相介质中的酶催化：酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。

⑶超临界介质中的酶催化：酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。

⑷离子液介质中的酶催化：酶在离子液中进行的催化作用。离子液是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。17.水在酶的非水相催化中有什么作用？

水的作用：⑴必需水与低水系统。严格的说，酶在绝对无水的条件下，是不可能具有催化活力的。酶的催化功能与它的空间结构紧密相关，破坏其空间构象，酶便失去其催化功能。维持酶蛋白空间构象的主要作用力是氢键，疏水作用和范德华力。在水溶液中，水分子直接或间接地通过这些化学键来维持酶分子催化活力所必需的构象，而且水在酶的稳定性及动力学性态的决定上起着重要的作用。含水量与酶的稳定性有关。酶在脱水条件下异常稳定。⑵必需水对酶活性影响，不是所有水溶液中的水分子都与酶催化活性有关。实际上只有必需水才重要。在水合过程中酶蛋白结构没有明显的变化。必须水量也决定于有机溶剂。

18.按结构区分常见的酶反应器类型有哪些？简述它们的特点。

用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。按结构区分：

⑴拌罐式反应器：反应比较完全，反应条件容易调节控制。

⑵鼓泡式反应器：鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高，适合于有气体参与的反应。

⑶填充床式反应器：密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。

⑷流化床式反应器：流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。

⑸膜反应器：清洗比较困难