蛋白质分离策略
蛋白质分离方法
摘要：本文介绍了蛋白质分离的一系列方法。浸提，超声波破碎，研磨等原料预处理方法。蛋白质粗提纯中的盐析，透析，超滤等方法。层析法中的离子交换层析，凝胶层析，亲和层析用于蛋白质初提纯。精提纯主要是使用电泳技术，如等电聚焦，DSD-PAGE，毛细管电泳，以及高效液相色谱法。
一、原料的预处理
在对蛋白质分离前，首先要对所要分离的原料进行分析。要根据分离纯化原料不同而采取不同的预处理方法。如果是富蛋白，或者液体原料，如血清，蛋清，蛇毒，蝎毒等，无需进行原料预处理，直接进行蛋白质的粗提取和富集；如果是动物材料，如肉，表皮等，要去掉结缔和脂肪组织；对于植物组织和细菌要将细胞壁进行破壁处理。对原料的预处理不仅要把蛋白质从原来组织中释放出来，而且要保持蛋白质原有的天然状态。为了防止蛋白质变性，溶解蛋白质的溶液一般为蛋白质缓冲溶液，缓冲溶液主要有，NaAc-HAc[1]溶液，PBS-NaCl[2][3]，
NaH
2PO
4
-Na
2
HPO
4
[4]缓冲溶液，Tris-HCI缓冲溶液[5]，缓冲溶液不仅可以保持蛋白质活性，还
可以作为浸提液提取蛋白质。
预处理的主要方法有浸提法，超声破碎法、研磨法、高压挤压法以及酶处理法[6]。
1.1浸提法
浸提是最常用的一种溶解蛋白质的方法，主要原理是利用蛋白质在溶液中具有一定溶解度，溶解于溶液中，达到蛋白质与原料（通常是固体）的分离。浸提液主要有，水，去离子水或超纯水，提取水溶性蛋白质；盐，一般是NaCl，提取盐溶性蛋白质：醇，如乙酸[7]，正
丙醇，提取醇溶蛋白；弱酸，如乙酸[8]，弱酸性缓冲溶液，如PH6.0 NaH
2PO
4
-Na
2
HPO
4
缓冲溶
液，提取弱酸溶性蛋白质；弱碱，主要是碱NaOH[9]或弱碱性缓冲溶液，如PH8.5
KH
2PO
4
-Na
2
HPO
4
[10]，缓冲溶液，提取弱碱溶性蛋白质。其他浸提液，如1.0mol/L盐酸胍与含
有0.02%EDTA的MES溶液浸提鲨鱼软骨[11]。
浸提法简单，方便，但要根据所分离的蛋白质的特点，配制浸提液时要保证蛋白质活性，严格控制浸提液的温度以及酸碱度。
1.2 超声破碎法
超声破碎的原理是利用电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的像小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。生物上主要是使用超声波细胞破碎仪来对细胞进行破碎，特别是对植物细胞[5]
和菌[12]的细胞壁进行破碎。
1.3 破碎法
破碎法主要是将原料破碎，扩大原料表面积，提高蛋白质的溶解效率，原料的破碎也有利于释放出原料中的蛋白质。主要有机械破碎法和研磨法。机械法破碎使用的仪器，匀浆机，营养调理机[5]，高速组织捣碎机[13]。研磨法主要使用研钵进行研磨。机械破碎或研磨破碎时产生一定热量，可能会导致蛋白质变性，因而研磨时需要进行预冷处理，如加入液氮，冰块，冰丙醇[14]，或者原料、溶液预冷处理。为了保持蛋白质活性，可加入蛋白酶抑制剂。顾鹏毅[15]在分离牛脑中的海马组织中的NGF时，使用匀浆机对取出的海马结构破碎时，加入蛋白酶抑制剂，保持蛋白质活性，加入自制的冰，防止温度过高破坏蛋白质活性。
林文芳[16]等研磨0.5g芦苇叶片时加入2.5mL预冷研磨提取液（8mol/L尿素，20mmol/L DDT，2.%NP-40）研磨匀浆后离心。破碎法使用仪器简单，成本低。由于蛋白质易变性，需要严格控制破碎的条件，比如温度，蛋白质提取液的酸碱度等。
1.4酶处理法
酶处理方法就是利用酶使与其他物质结合的目标蛋白质释放出来。。张玉香等在对酵母的甘露糖蛋白进行分离纯化时，利用酶将结合于细胞壁中的甘露糖蛋白释放出来[1]。一般条件下，酸性蛋白、酶、肽在碱性环境中较酸性环境中稳定，反之亦然。在利用酶处理时，要考虑处理的条件，防止酶失效，提高提纯效果。
蓝泽林[17]在提取鸡蛋黄蛋白的时候，40℃酶反应器中加盐酸调节pH到3，加入酸性蛋白酶，反应完后，加入NaOH，调节pH到10，加入碱性蛋白，反应完，取最下层蛋黄蛋白溶液。
1.5离心
离心是分离液体和固体物质的一种非常有效的方法。在分离蛋白质时，若蛋白质溶于溶液中，则离心后取其上清液；若蛋白质沉淀下来，则离心后取其沉淀。由于蛋白质高温时变性或分解，离心时，溶液的温度会随着离心而升高，因而可选用带制冷系统的离心机，如冷冻离心机。实验室分离蛋白质一般使用转速20000rpm以下的高速冷冻离心机。
二、蛋白质的粗提取和富集。
蛋白质在溶液中具有一定溶解性，而溶解的蛋白质会因为中性盐如硫酸钠，硫酸铵浓度增大而沉淀下来，这种沉淀是可逆的，由此发展了盐析法沉淀富集蛋白质；蛋白质也会在酸碱，如三氟乙酸（tca），丙酮，等条件下变性沉淀，依此原理发展了TCA沉淀法以及丙酮沉淀法。而收集这些蛋白质沉淀，一般使用透析和超滤，以及离心法。
2.1 盐析
盐析，是利用蛋白质在某些盐，如(NH
4)
2
SO
4
中可变性沉淀，除盐后又复性溶解的原理进
行蛋白质与糖醛等有机物的分离。盐析主要是通过一定饱和度的(NH
4)
2
SO
·
溶液是原料中的蛋
白质析出，离心分离得到沉淀蛋白。如詹玲[3]分离大豆糖蛋白时，探索了硫酸铵饱和度分别为30%，40%,，50%，60%，70%，80%，90%时的蛋白质提取效果，最终确定70%时是最佳的盐析浓度。还可以通过配置不同浓度的硫酸铵饱和溶液粗分离不同饱和度下开始沉淀的蛋白质。
2.2透析和超滤
盐析后，用Tris等缓冲溶液将盐析得到的沉淀蛋白质溶解，然后溶液装入透析袋中进行除盐处理，除去蛋白质中的盐。透析袋可以允许小分子透过透析袋进入透析介质中，而不允许蛋白质等大分子通过，因而无机小分子不断被稀释，而蛋白质大分子确仍保留在透析袋中。张冬梅[5]分离地鳖虫纤溶活性蛋白时，盐析、离心得到沉淀蛋白，Tris-HCl缓冲溶液溶解后，使用透析袋透析除盐。蛋白质装于透析袋中（不超过透析袋1/3体积），用纯净水做透析介质，用氯化钡检测透析是否完全。开始每隔3h换一次水，直至用氯化钡溶解到透析介质中不出现沉淀，结束透析。
盐析与透析结合提取蛋白质的方法，原料易得便宜，操作容易，而且可以防止蛋白质变性，避免引入其他污染物。缺点是，盐析和透析时间相对较长，而且只能处理量比较大的蛋白质，少量蛋白质的提取操作比较困难。
盐析缓冲溶液溶解后的蛋白质也可以使用超滤的方法提取蛋白质。超滤(Ultra Filtration，简称UF)以超滤膜作为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力，将不同分子量的溶质进行选择性分离。超滤过程一般是在常温低压下进行的，对分离热敏性、保味性和易发生化学变化的物质最为适用。
超滤是一种广泛应用于分离纯化溶液中胶体和大分子蛋白质的分离技术。超滤能截留蛋白质、多糖等相对分子质量大于1000Da的大分子及胶体，形成浓缩液，达到蛋白质分离及浓缩的目的。虽然，超滤也只能处理大量的蛋白质，但与透析相比，超滤所需的时间比透析少，效率高于透析。只是，超滤需要特殊仪器，如超滤杯，成本较高，而且操作较为繁琐。
万顺刚[18]提取鸡蛋中蛋黄ACE抑制肽时，使用的是双工位平板膜超滤设备，滤膜选择截留分子量为10kDa和3.5kDa的滤膜。杨娟[19]用自制微型膜分离器分离鸡蛋中卵黄免疫球蛋白，滤膜选择100-kDa PES膜。张希春[20]等分离蚯蚓的两种抗菌肽时，使用超滤杯系统进行过滤分离。
超滤和透析这些膜分离技术也存在一些不足，例如膜易污染等缺陷，在进行超滤，透析
之前，原料要经过一定的预处理，如絮凝、重力沉降、机械过滤、微滤等[17]。
2.3丙酮沉淀法和三氟乙酸/丙酮沉淀法
对于少量，不易得的蛋白质样品，如生物体液等，用盐析法沉淀会导致蛋白质的丢失，无法有效获得所需蛋白质。可以利用蛋白质在丙酮，或者三氟乙酸（TCA）中变性沉淀这一方法将蛋白质沉淀下来，而这种变性是不可逆的。
TCA与蛋白质之间主要有以下几个方面的作用:①在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐.
②作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀.③随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显。
龙峰[21]探讨了TCA与丙酮沉淀脑脊液对双向电泳的影响时发现，TCA/丙酮处理后的脑脊液的蛋白质点数为342个，而单丙酮处理后的蛋白质点数为276个。因而TCA/丙酮处理脑脊液样品略优于单丙酮处理。
三、蛋白质初提纯
蛋白质粗提纯主要是将沉淀分离得到的蛋白质进一步进行浓缩，将不同蛋白质分离开来，并对蛋白质进行除盐等处理。
3.1 离子交换柱层析
蛋白质具有等电点（pI,isoelectric point），在等电点pl这一pH值处，蛋白质所带静电荷为零；溶液pH值高于等电点，带负电荷，低于pH，带正电荷。不同蛋白质等电点不同，基于蛋白质这一特点，可以使用离子交换层析对分离不同蛋白质。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
离子交换剂主要有以下三种：
1.纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱（DESE-纤维素）。
2.交联葡聚糖离子交换剂：常用的Sephadex离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25，A-50和QAE- Sephadex A-25，A-50；阳离子交换剂有CM-Sephadex C-25，C-50和Sephadex C-25，C-50。阴离子交换剂用英文字头A，
阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex型号。
3.琼脂糖离子离交换剂：是将DESE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B上形成，DEAE-Sephades（阴离子）和CM-Sepharose（阳离子），具有硬度大，性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。
以下是离子交换树脂在蛋白质分离中的应用。
表1离子交换树脂纯化蛋白质
由上表可以看出，离子交换层析洗脱液可以是NaCl的浓度梯度洗脱，也可以使用Tris 缓冲溶液进行洗脱。而纤维素，葡聚糖，琼脂糖三种离子交换剂都较为广泛使用。
离子交换层析，作为蛋白质的初提纯技术，使用方便，仪器简单，易操作，成本较低，使用的离子交换剂为生物型凝胶，不会对蛋白质造成污染，有利于保持蛋白质活性，因而广泛用于凝胶层析，电泳的上游分离技术。但离子交换层析，交换剂填柱子，平衡操作时间较长，洗脱时间长，要防止洗脱时间过长导致蛋白质降解。
3.2 凝胶过滤色谱层析
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又被称为凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。凝胶柱主要是由凝胶珠装填到而成，每个凝胶珠都是类似于“筛子”，具有一定孔径筛孔。小于平均孔径小分子蛋白质可以穿过珠子内部，这样造成小分子蛋白的走过的路径变长，而且珠子内部的阻力大，所以洗脱时间长。而大分子蛋白质直接从孔隙间流过，直接被洗脱出来。因而不同分子量的蛋白质得以分离开来。
凝胶珠材料主要是葡聚糖，常见有两大类，商品名为商品名分别为Sephadex 和Sephacryl。Sephadex 的主要型号是G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。下表为Sephadex系列分离柱的有关参数及其应用：
表2 Sephadex系列分离柱的有关参数及其应用
Sephacryl 是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl 的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex 的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。
⑴除盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，在相同条件下洗脱，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。
下表是凝胶层析在蛋白质中的一些应用。
表3 凝胶色谱在蛋白质中的应用
由上表可以看出，凝胶层析所用的洗脱液一般为弱碱性缓冲溶液，较常使用的的是型号为G-50,G-75，分离要求较高的时候使用分离范围更大的G-200。结合离子交换层析，不难看出，凝胶层析可以用于分离离子交换层析后得到的更纯蛋白质，如，大豆，鸡蛋黄，血清等的蛋白质提取。而蜈蚣的抗肿瘤蛋白的提取更是使用了凝胶-层析-凝胶的提取方式对蛋白质进行提纯。
凝胶色谱常用于分离蛋白质的精分离，可以分离分子质量差值大于200的蛋白质。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂。但成本较高，条件苛刻，层析样品要先过滤里面的固体杂质，否则容易堵塞凝胶柱，使得柱子失效。
3.1.3亲和层析
亲和层析（affinity chromatography AC）是蛋白质纯化的一种重要的方法，它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量。只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来达到千倍以上的纯化并保持较高的活性，目前亲和层析技术被广泛的应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。
亲和层析分离蛋白质的原理是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。分离原理如下图：
图1 层析分离原理
亲和层析在蛋白质中的应用主要分为生物特异亲和层析和人工配体亲和层析[32]。
1生物特异亲和层析
生物特异亲和层析用于蛋白质分离的主要有：免疫亲和层析（IAFC）和凝集素亲和层系（LAFC）。
免疫亲和层析是利用抗体与其相应抗原的作用具有高度的特异性和高度结合力的特点，用适当的方法将抗原或抗体结合到层析载体上，便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。单克隆抗体技术的出现极大地推动了免疫亲和层析技术的发展。只要得到特定单抗，利用其作为配体，通过亲和层析，即可从复杂的混合物中分离，纯化特定抗原成份。McEl hiney 等固定单链抗体在载体上，用免疫亲和层析的方法从水中浓缩了蓝细菌分泌的微藻素，回收率达到94 %[33].
凝集素是一类糖结合蛋白，最先是由植物中分离到的，它可与蛋白的寡糖部分特异结合。不同的凝集素能够特异地结合某种寡糖或者糖肽，因而可以借助于凝集素亲和层析对一些寡糖或糖肽进行结构分析，且具有特异、敏感、快速的特点，使得凝集素成为糖链结构分析的一种常用工具[34-37].更重要的是，该技术可用于分离糖基化的蛋白，对于几乎所有膜蛋白，这项技术都是极其有用的。目前，可用的凝集素有数百种之多，常用于亲和层析的凝集素主要有麦胚凝集素（WGA）和伴刀豆凝集素A （Con A）。麦胚凝集素特异结合β-N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸，伴刀豆凝集素A特异结合a- 甘露糖，a- 葡萄糖和a-N-乙酰葡萄糖胺。另
一种较为常用的是对乙酰氨基葡萄糖专一的曼陀罗凝集素，可用于多巴胺D2受体的提纯[38]。
生物特异亲和层析具有很高的选择性，以及因为所用的配体为生物分子，可以很好地保持蛋白质的活性，但是配体有效固定到载体中却是很困难，不具有通用性，因而其载体和配体只能在极窄的领域使用。
2人工配体亲和层析
人工配体亲和层析也称为通用配体亲和层析,是指利用一些人工配体对不同的蛋白质有亲和性的特点,通过亲和层析来纯化这些蛋白质的方法。主要包括金属螯合亲和层析和染料配体亲和层析等。
金属螯合亲和层析也称固相化金属离子亲和层析，该方法是利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。这些氨基酸残基包括组氨酸.色氨酸.赖氨酸等。目前采用的固定金属离子螯合剂主要有亚氨基二乙酸（I DA）和次氨基三乙酸（TA）两种。它们都可以有效地与Ni2+，Zn2+,Cu2+和Co2+等二价金属离子发生螯合作用,从而将这些金属离子固定在载体上。刘尚义[39]等用Ni-NTA琼脂糖凝胶提取猕猴血清中的重组人内皮素。
金属螯合亲和层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和通用性强等特点。由于该方法几乎对蛋白质本身的生物活性没有依赖，所以，除了可以在常规的非变性条件下进行纯化外还特别适合分离纯化变性蛋白，尤其是带6个组氨酸标签的重组蛋白。广泛应用于大肠杆菌表达包涵体蛋白质的分离及纯化，是分离纯化生物工程蛋白质产品最有效的工具之一。但是，金属螯合亲和层析在保持蛋白质活性稍差一些，而且金属离子可能会污染蛋白质，对于金属蛋白，分离后的鉴定有一定干扰。而且，金属螯合亲和层析载体大都采用琼脂糖而琼脂糖颗粒表面较为粗糙，容易产生一些非特异性吸附现象。尤其在分离小量蛋白或含疏水性蛋白较多时，非特异性吸附出现尤为普遍。而且也不适应快速分离蛋白，大大影响了金属螯合层析的分离效果。
染料配体亲和层析所用的染料主要有两类一类是Cibacron 另一类是Procion 这些染料结构中都有三嗪环，环上有 1 ～2 个可被取代的氯原子。三嗪环可与羟基反应偶联到载体上，在它们之间形成醚键。染料的结构类似于某些酶类的底物，如Ci bacron Blue F3GA 与NAD的分子结构类似，它是许多酶和蛋白质的极有效的吸附剂，是纯化脱氢酶、激酶、血清蛋白、干扰素、多种血浆蛋白等极好的配体[40].
与其它人工配体亲和层析技术相比,普通的染料亲和层析也存在着非特异性吸附,选择性不够高的缺点.
总之，亲和层析具有特异性好，选择性高的特点，是一种很好的分离提纯蛋白质的工具。但亲和色谱也具有局限性，如生物特异亲和层析的配体如何偶联到柱子上，还有偶联后遇到各式的蛋白质，如何保证蛋白质的活性；人工配体亲和层析中存在的微量染料和金属会不会对机体造成损害。这些都制约了亲和层析的发展。
3.2密度梯度离心法
密度梯度离心法，可以分离像蛋白质这样沉降系数接近的物质。这种方法使用一种密度能形成梯度（在离心管中，其密度从上到下连续增高）又不会使所分离的生物活性物质凝聚或失活的溶剂系统，离心后各物质颗粒能按其各自的比重平衡在相应的溶剂密度中形成区带。常用的密度梯度溶剂是蔗糖或氯化铯（CsCl）溶液。用蔗糖时，先将蔗糖溶液制成密度梯度溶液，再在其顶端加样品。离心后，如欲收集所分离的组分，可在离心管的下端刺一小洞，然后分部收集。如用CsCl这种密度大又扩散迅速的溶剂系统时，可将样品均匀地混合于溶剂中。离心达到平衡后， CsCl溶液形成密度梯度，样品中各组分也在相应密度处形成区带。
四、蛋白质精提纯
4.1 电泳
溶液中带电的分子能够在电场中进行迁移，这种现象叫做电泳（electrophoresis）。由于溶解的蛋白质带净电荷，而不同蛋白质有不同的电荷密度（电荷与质量的比率），会按照不同的速率向相应的电极进行迁移，所以理论上溶液中的蛋白质化合物可以通过电泳分离。但是，由于外界因素的影响，很难在溶液中做标准电泳，而且当电场消失时，电泳形成的窄蛋白质区带很容易扩散变宽而导致蛋白质的重新混合。在使用固定相基质电泳时，结束后分离的蛋白质就会被固定住，所以在很窄小的管子（如毛细管电泳）或像纸或凝胶这样的稳定基质进行电泳就可以将这些影响降到最低。
4.1.1等电聚焦
蛋白质具有等电点，等电点处蛋白质净电荷为零。等电聚焦就是依据蛋白质所带电荷来对蛋白质进行分离。其原理是：蛋白质在pH梯度中电泳时，蛋白质会移到pH值等于它的等电点的位置，此时蛋白质净电荷为零。蛋白质在向等电点移动过程中电荷量密度会逐步降低。达到等电点时，蛋白质电荷密度为零并停止运动。IPG胶是等电聚焦最常使用电泳胶，已经成为蛋白质组学标准之一。IPG凝胶在加电场前就已经建立好了pH梯度，并且在进行长时间的电泳后仍然可以保持稳定。既简化了等电聚焦的使用方法，又确保电泳结果的可重复性。
等电聚焦电泳根据等电点分离等电点不同的蛋白质，是蛋白质电泳的一大发展方向，但很少单独使用。原因主要有，1，蛋白质的多种多样，未知蛋白质的等电点跨度很大，IPG
胶的分辨率很难全部离开来；2即使用PH梯度很小的IPG凝胶分离那一pH区间的蛋白质，由于相近甚至相等的等电点的蛋白质的存在，蛋白质出现交叉甚至混合。因而等电聚焦电泳主要是用于和其他按分子量大小分离的电泳联用，如联用最多的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)电泳，以及毛细管电泳。现在等电聚焦电泳还发展出了毛细管等电聚焦电泳，液相等电聚焦电泳等技术。
4.1.3 SDS-PAGE （十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）
十二烷基硫酸钠（SDS）是一种常见的阴离子表面活性剂，数十个乃至上百个SDS包裹着一个蛋白质，而且是按照大概1.4gSDS/1g[24]蛋白质比例包裹蛋白质。由于SDS的本身带有负电荷，而且SDS的数量远大于蛋白质，因而在SDS-蛋白质复合物中蛋白质所带的电荷数可以忽略不计，达到掩盖蛋白质电荷的目的。这样导致两种结果保证按照蛋白质的分子量进行分离。首先，所有SDS-蛋白复合物的电荷密度都基本相同；其次是蛋白质之间质量上的相对差异还同样存在于SDS-蛋白质复合物中。SDS-PAGE电泳前，加入溴酚蓝作为指示剂，当溴酚蓝指示剂移动到底部边缘的时候，电泳结束。
对于前期分离效果较好，需分离蛋白质种类不多的样品，可以单独使用SDS-PAGE电泳进行电泳分离。如分离福寿螺蛋白质[24]，红毛藻蛋白[4]，甜荞蛋白[27]等。SDS-PAGE电泳时可以同时跑已知分子量的蛋白质化合物作为参比，测未知蛋白质的分子量。如测冰核活性细菌中冰核活性蛋白质的分子量[41]。
SDS-PAGE技术分离蛋白质已经相当成熟，现代分离趋于简单，自动化，因而广泛使用。但由于蛋白质的多种多样SDS-PAGE电泳不可能分离的了全部的蛋白质，如膜蛋白，组蛋白，染色质蛋白，核糖体蛋白等就要利用其它方法进行分离。
4.1.4双向凝胶电泳
双向电泳其实是等电聚焦电泳和SDS-PAGE联用的方法。等电聚焦为第一向，SDS-PAGE 为第二向。等电聚焦先将蛋白质按照其等电点不同分离开来，SDS-PAGE将同一等电点的蛋白质按照其分子量大小分离开来，直观表现为胶上面的一个个蛋白质点。由于双向凝胶电泳具有一定的重现性，因而电泳后的经染色的凝胶可以用于寻找差异蛋白质。如用于寻找镉诱导下的褐云玛瑙螺肝脏的差异蛋白质[42]。
双向凝胶电泳是蛋白质组学的一大支撑工具，因为它能够在一次实验中分离绝大部分的蛋白质，并且易于自动化操作。而且对于感兴趣的蛋白质可以直接从胶上切下来，作进一步的分析。
4.1.5 高效毛细管电泳（CE）
毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。分离蛋白质时，毛细管中是否填充凝胶皆可，但有凝胶存在有利于蛋白质或者肽段的分离，这又叫毛细管凝胶电泳。毛细管可以有效消除热量，因而可以使用高强度电场，不仅可以实现快速分离，而且还能够实时监测。但是由于毛细管的直径很小，需要的上样量也很少。因而毛细管电泳一般用于分离相对简单的多肽混合物，如蛋白酶解后的产物。毛细管可以和固相分离系统，如HPLC，联用，可以用于分离更复杂的蛋白质和多肽样品。
4.2 反相液相色谱
反向液相色谱分离蛋白质或多肽时是依据它们与固定相的可逆结合，然后梯度洗脱组分达到分离的目的。反向液相色谱是利用了蛋白质和多肽的疏水性来进行分离的，由此，反相色谱中包含了疏水性基团，如C4-C18的烷基链。尽管分离原理基于疏水性，但是分离结果来看，还是与分子量有关，因为在柱上的滞留能力是随着分子质量的增加而增加。分离时，先破坏弱的疏水作用，然后逐步增加缓冲溶液中的有机溶剂来完成梯度洗脱。在多种色谱中，反向液相色谱分辨率最高（一个峰中可容纳100个组分。）它被广泛应用于胰酶消化后肽段的分离。HPLC可以直接与电喷雾离子化质谱相连接从而实现肽段分离以及LC-MS，LC-MS/MS 分析的全自动化。因而可以应用于双向电泳的下游分析。
五、展望
蛋白质分离技术已经成熟，近年来质谱等检测技术的发展，提高了蛋白质分析能力。因而对蛋白质性质的研究更加深入，也就对蛋白质的分离提出更高要求，如提取不稳定蛋白质等。分离与分析之间的相辅相成的发展不断地推动蛋白质组学的发展。
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蛋白质的盐析与透析
蛋白质的盐析与透析 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液。 四、实验步骤 （一）蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出； 取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。 （二）蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。 附：胶棉半透膜的制备 市售5%的胶棉液，加入干燥的150mL锥形瓶中，将锥形瓶横斜不断转动，使瓶的内壁和瓶口都均匀沾有胶棉液。倒出多余的胶棉液，然后倒置约1min使乙醚、乙醇不断蒸发，直到干燥。逐步剥离瓶口的薄膜，沿瓶壁薄膜夹缝注入蒸馏水，使薄膜逐步跟瓶壁胶离，轻轻取出，浸入蒸馏水中备用。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
蛋白质分离纯化的步骤
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
蛋白质分离技术
蛋白质分离纯化的条件 蛋白质是一类结构复杂的生物大分子，在细胞和抽提液中蛋白质的性状也不尽相同， 离开天然环境，蛋白质分子变得极不稳定，因此从正常生物材料中提取各种蛋白质均需要特定的条件。 (一)缓冲液缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持 一定pH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。各种缓冲液原则上都可用于蛋白质的分离纯化，但具体选择何种缓冲液要视分离纯化的目的物性质及所采用的纯化技术而定，例如缓冲液中的无机成分(磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐等)可以与酶或底物反应,从而影响酶的活性；大多数动物细胞在37℃生理状态下的pH值是7.0-7.5之间，因此应选择相应的缓冲液；对凝胶过滤方法，大多数缓冲液均可适用；离子交换层析中的阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选Tris缓冲液，阳离子交换层析，阴离子缓冲液首选磷酸缓冲液。在选择缓冲液时， 最好对pka相近的一些缓冲液进行比较试验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发 生不良的相互作用，影响蛋白质的分析分离。 (二)盐、金属离子和整合剂大多数蛋白质如球蛋白，在稀盐溶液中才能溶解，因此应采用含盐(氯化纳)缓冲液。通常用0.1-0.2mol/L NaCI或KCl来模拟生理状态下的离子强度。某些金属离子特别是二价金属如Ca2+、Mg2++等往往是酶的组成部分，失去金属离子其活性会大大下降,如果这些确是我们所需要保护的，则应避免其与缓冲液中的成分形成复合物。但有些蛋白质含疏基,而这些疏基是活性所必须的，为减少金属离子对活性的影响，可以在 缓冲液中加入特异金属离子的螯合剂(Chelate)除去这些金属离子，如Zn2+的螯合剂为邻二氮杂菲；Ca2+的螯合剂为乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)；重金属及其它金属离子为 乙二胺四乙酸(EDTA)。
蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法
蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法 文章出处：朱敏 蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法 有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol左右,过多不仅耗费有机溶剂,而且可能导致沉淀不好.沉淀的条件一经确定,就必须严格控制,才能得到重复性结果.有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示.故操作条件比盐析法严格。 许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。某些第3组分的存在可以改变两相的比例和组成。有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。 疏水层析是近年发展的新方法。它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。此法能分离其它一些方法不易纯化的蛋白质。 利用分子形状和大小不同的分离方法 蛋白质形状有细长的如纤维，有密实的如圆球，形状很不相同。蛋白质的分子量从6000左右开始，有各种大小，大的可以大到几百万。利用这些差别，有几种方法可用来分离蛋白质。 凝胶层析 属最常用的蛋白质分离方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。所指凝胶从广义上说是一类具有三维空间多孔网状结构的物质，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。把适当的凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，于柱内加入欲分离的混合物，然后用大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物质的分子大小和形状不同，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。
蛋白质的分离纯化和表征
蛋白质的分离纯化和表征 第一节蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。 第二节蛋白质分子的大小与形状
一、根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。 若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。 例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。 解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。 按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。 由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。 二、渗透压法测定相对分子质量 三、沉降分析法测定相对分子质量
基本原理： （一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。 （二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。
蛋白质的盐析与透析
蛋白质的分离纯化 一、实验目的 1.了解蛋白质的分离纯化方法 2.掌握蛋白质的盐析及透析方法 二、实验原理 在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。 蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，宜在低温下进行。 三、实验材料和试剂 10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液，双缩脲试剂 四、实验步骤 （一）蛋白质盐析 取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出； 取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。 （二）蛋白质的透析 注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。 经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。 再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。 每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。 实验报告记录透析完毕所需的时间。
蛋白质纯化的方法选择
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
蛋白质的分离纯化方法(参考资料)
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
蛋白质的分离方法
蛋白质的分离方法 蛋白质的分离方法有哪些？他们各依据蛋白质的什么性质或特点？蛋白质的分离纯化方法 分子大小 透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。 密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。 凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。 溶解度 等电点沉淀和pH控制 盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。 有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。
温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在0~40℃，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。 电荷 电泳（净电荷、分子大小、形状）：区带电泳、聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）、毛细管电泳 离子交换层析 等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。 层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。 吸附： 吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。 特异亲和力：亲和层析 其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC）
分离纯化蛋白质的方法及原理
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
盐析法
盐析法综述 摘要：沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。盐析法是其中的一种，盐析法是在中药水提液中,加入无机盐至一定浓度,或达饱和状态,可使某些成分在水中溶解度降低,从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 关键词:沉淀法；盐析；原理；方法评价；蛋白质盐析 沉淀法 沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法。 有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。、非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。最常用的是铅盐法，可以用于除去杂质，也可用于沉淀有效成分。沉淀法通常是在溶液状态下将不同化学成分的物质混合,在混合液中加人适当的沉淀剂制备前驱体沉淀物,再将沉淀物进行干燥或锻烧,从而制得相应的粉体颗粒。一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 对沉淀形式的要求 （1）沉淀的溶解度要小，以保证被测组分能沉淀完全。 （2）沉淀要纯净，不应带入沉淀剂和其他杂质。 （3）沉淀易于过滤和洗涤，以便于操作和提高沉淀的纯度。 （4）沉淀易于转化为称量形式。 盐析法 胶体的盐析 胶体的盐析是加盐而使胶粒的溶解度降低，形成沉底析出的
蛋白质分离与纯化教学设计课题
蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点
【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理 （一）利用分子大小 1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题： 如何加快透析过程 （1）加大浓度差，及时更换透析液 （2）利用磁力搅拌器 常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来 （二）利用溶解度差别 4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析
（三）根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是： 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是： 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法
盐析法沉淀蛋白质的原理
盐析法沉淀蛋白质的原理 1 中性盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 ⑴中性盐沉淀蛋白质的基本原理 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
⑵中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵 盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯 度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的 （NH4）2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜，废液不污染环境。 ⑶盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及 原理 This manuscript was revised on November 28, 2020
分离纯化蛋白质的方法及原理 （一）利用分子大小 1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题： 如何加快透析过程 （1）加大浓度差，及时更换透析液 （2）利用磁力搅拌器 常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来 （二）利用溶解度差别 4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析
（三）根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是： 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是： 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法
分离纯化蛋白质的方法及原 理
（2） 利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、 有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。有
蛋白质的盐析
蛋白质的盐析 SANY GROUP system office room 【SANYUA16H-
蛋白质的盐析（验证型） 一、实验目的 了解在工业化生产过程中使用（NH4）2SO4的情况，及（NH4）2SO4使用时的注意事项。 二、实验原理 用高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法称盐析。常用的中性盐有（NH4）2SO4、NaCl 等。高`浓度中性盐能使蛋白质沉淀是因为它具有脱水性，能脱去蛋白质胶粒水膜，又有中和蛋白质胶粒外双电层电荷的作用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度，可适当地将蛋白质分开。如球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀，用盐析法沉淀的蛋白质并未变性，用稀释的方法或透析的方法可使之复溶。 三、器材与试剂 1、发酵溶液 2、10%的三氯醋酸溶液 3、饱和（NH4）2SO4溶液 4、（NH4）2SO4粉末 四、实验步骤 （1）取发酵溶液5ml，加饱和（NH4）2SO4溶液1ml2ml3ml4ml5ml，混匀，静止数分钟，即有白色沉淀析出，应为何物？过滤至清，除去沉淀，滤液备用。取少量沉淀，加H2O看是否复溶？ （2）取滤液0.5ml，加10%的三氯醋酸数滴，有白色沉淀产生，应为何物？然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测，检测时必须在倒入比色皿以后10秒内读取（为什么？）。（在进行检测时应注意将721分光光度计调整到OD600；在测量前应把机器预热半小时左右。在检测时应注意有效的检测范围是T值15%以上到70%以下）。 （3）另外，取滤液2.5ml于小烧杯中，加（NH4）2SO4粉末，随加随搅拌，直至（NH4）2SO4不能溶解为止，有白色沉淀产生，应为何物？然后过滤至清，除去沉淀，过滤备用。 （4）将（1）-（3）做的滤液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。找到没有沉淀的加饱和（NH4）2SO4溶液的点。然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测。并且作出曲线。 （5）对大量的发酵液进行处理，在滤液中加10%三氯醋酸数滴观察有无沉淀产生。 （6）盐析曲线的制作方法：如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。 五、盐析注意事项： 1.盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。 2.盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60℃烘干后再称量，这样更准确。 3.在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。