凝胶限量法检查参芎葡萄糖注射液细菌内毒素的研究
细菌内毒素测定技术—细菌内毒素检查方法
知识点：光度测定法
四、结果判断 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释
倍数后小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定；若 大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容 器，如微孔板中的孔。
技能点：凝胶限度试验操作规程
检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法，按下表制 备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供 试品溶液来制备溶液A 和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
3、如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内 毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
4、若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规 定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不 符合规定。
知识点：光度测定法
一、方法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度 变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终 点浊度法和动态浊度法。 显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产 生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素 含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色 法。
试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品 符合规定；否则判定供试品不符合规定。
技能点：凝胶限度试验操作规程
4、阳性对照结果出现阴性，可能是由于内毒素工作品效价标 示不准确或效价衰退或失败；稀释内毒素没有使用旋涡混合器或 稀释操作不当；鲎试剂效价标示不准确或效价衰退或失效；反应 试管放入水浴保温前试管中内容物没有摇匀造成。阴性对照出现 阳性结果可能是由于鲎试剂或者水污染，试验器具污染，试验过 程操作不当污染造成。
A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液。 B：供试品阳性对照。（为确证不存在干扰作用） C：标准内毒素系列。（为确证本次试验的操作和环境都符合要求。）D：阴性对照。
药典三部版通则细菌内毒素检查法
药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
细菌内毒素检查法SOP(陈魏制作)
细菌内毒素检查—凝胶法标准操作程序1.简述本操作程序主要参照BP 2003 Appendix XIV C. Test for bacterial endotoxins中MethodA.Gel-clot method: limit test和Method B. Gel-clot method: semi-quantitative test以及《中国药典2010版附录ⅹⅡE细菌内毒素检查法》中凝胶法，结合实验室自身条件编写而成。
2.安全注意事项由于细菌内毒素对人体有毒害作用，且鲎试剂对人的危害作用尚不明确。
因此实验过程中一定要做好防护措施。
3.检验目的检验供试品中的的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。
4.检验原理本操作程序通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量检测内毒素。
5.供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的pH 值在6.0～8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH 值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
6.供试品细菌内毒素的限值(L)药典有明确规定的按照药典规定值，如无规定需经计算得出，具体计算方法见各药典。
7.供试品最大有效稀释倍数(MVD)和最小有效稀释浓度的确定(MVC)最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数( 1→MVD )，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
用以下公式来确定MVD，MVD=cL /λ。
式中L 为供试品的细菌内毒素限值；c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU / ml 表示时，则c为1ml / ml ，当L 以EU / mg 或EU / U 表示时，c的单位需为mg / ml 或U / ml。
药典三部(版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法之老阳三干创作本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌发生的细菌内毒素, 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法.细菌内毒素检查包括两种方法, 即凝胶法和光度测定法, 后者包括浊度法和显色基质法.供试品检测时, 可使用其中任何一种方法进行试验.当测定结果有争议时, 除另有规定外, 以凝胶限度试验结果为准.本试验把持过程应防止内毒素的污染.细菌内毒素的量用内毒素单元（EU）暗示, 1EU与1个内毒素国际单元（IU）相当.细菌内毒素国家标准品系自年夜肠埃希菌提取精制而成, 用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价, 干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价, 用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准, 其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）, 且对内毒素试验无干扰作用.试验所用的器皿需经处置, 以去除可能存在的外源性内毒素.耐热器皿经常使用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除, 也可采纳其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法.若使用塑料器皿, 如微孔板和与微量加样器配套的吸头等, 应选用标明无内毒素而且对试验无干扰的器具.供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液.需要时, 可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值, 一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜, 可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值.酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制.缓冲液必需经过验证不含内毒素和干扰因子.内毒素限值简直定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中 L为供试品的细菌内毒素限值, 一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单元）暗示；K为人每千克体重每小时最年夜可接受的内毒素剂量, 以EU/（kg·h）暗示, 注射剂K=5 EU/（kg·h）, 放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h）, 鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最年夜供试品剂量, 以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）暗示, 人均体重按60kg计算, 人体概况积按1.62㎡计算.注射时间若缺乏1小时, 按1小时计算.供试品每平方米体概况积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）.按人用剂量计算限值时, 如遇特殊情况, 可根据生产和临床用药实际情况做需要调整, 但需说明理由.确定最年夜有效稀释倍数（MVD）最年夜有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最年夜倍数（1→MVD）, 在不超越此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测.用以下公式来确定MVD：MVD=cL/λ式中 L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度, 当L以EU/mg或EU/U暗示时, c 的单元需为mg/ml或U/ml, 当L以EU/ml暗示时, 则c即是1.0ml/ml.如需计算在MVD时的供试品浓度, 即最小有效稀释浓度, 可使用公式c=λ/L；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）, 或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度.方法1 凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素发生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法.鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下, 使鲎试剂发生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度, 用EU/ml标示.当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时, 应进行鲎试剂灵敏度复核试验.根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）, 将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解, 在旋涡混合器上混匀15分钟, 然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液, 每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒.取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支.其中16管分别加入0.1ml分歧浓度的内毒素标准溶液, 每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对比.将试管中溶液轻轻混匀后, 封闭管口, 垂直放入37℃±1℃的恒温器中, 保温60分钟±2分钟.将试管从恒温器中轻轻取出, 缓缓倒转180°, 若管内形成凝胶, 而且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性.保温和拿取试管过程中应防止收到振动, 造成假阴性结果.当最年夜浓度2λ管均为阳性, 最低浓度0.25λ管均为阴性, 阴性对比管为阴性, 试验方为有效.按下式计算反应终点浓度的几何平均值, 即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）.λc=antilg（∑X/n）式中 X为反应终点浓度的对数值（lg）.反应终点浓度是指系列递加的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；n为每个浓度的平行管数.当λc在0.5～2λ（包括0.5λ和2λ）时, 方可用于细菌内毒素检查, 并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度.干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D, 使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超越最年夜有效稀释倍数（MVD）的溶液, 按鲎试剂灵敏度复核试验项下把持.表1 凝胶法干扰试验溶液的制备注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对比系列；D为阴性对比.只有当溶液A和阴性对比溶液D的所有平行管都为阴性, 而且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时, 试验方为有效.当系列浓度B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时, 认为供试品在该浓度下无干扰作用.其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用.若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰, 应将供试品溶液进行不超越MVD的进一步稀释, 再重复干扰试验.可通过对供试品进行更年夜倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处置等）排除干扰.为确保所选择的处置方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性, 要使用预先添加了标准内毒素再经过处置的供试品溶液进行干扰试验.当进行新药的内毒素检查试验前, 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时, 须进行干扰试验.当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变动时, 须重新进行干扰试验.检查法⑴凝胶限度试验按表2制备溶液A、B、C和D.使用稀释倍数不超越MVD而且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B.按鲎试剂灵敏度复核试验项下把持.表2 凝胶限度试验溶液的制备编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/检查用水2D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对比；C为阳性对比；D为阴性对比.结果判断保温60分钟±2分钟后观察结果.若阴性对比溶液D的平行管均为阴性, 供试品阳性对比溶液B的平行管均为阳性, 阳性对比溶液C的平行管均为阳性, 试验有效.若溶液A的两个平行管均为阴性, 判定供试品符合规定.若溶液A的两个平行管均为阳性, 判定供试品不符合规定.若溶液A的两个平行管中的一管为阳性, 另一管为阴性, 需进行复试.复试时溶液A需做4支平行管, 若所有平行管均为阴性, 判定供试品符合规定, 否则判定供试品不符合规定.若供试品的稀释倍数小于MVD而溶液A呈现不符合规按时, 需将供试品稀释至MVD重新实验, 再对结果进行判断.⑵凝胶半定量试验本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量.按表3制备溶液A、B、C和D.按鲎试剂灵敏度复核试验项下把持.结果判断若阴性对比溶液D的平行管均为阴性, 供试品阳性对比溶液B的平行管均为阳性, 系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5～2λ, 试验有效.系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以λ, 为每个系列的反应终点浓度.如果检验的是经稀释的供试品, 则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数, 即获得每一系列内毒素浓度c.若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值, 判定供试品符合规定.每一系列内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式cE=antilg（∑c/2）].若试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性, 应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品, 则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）.若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时, 则判定供试品不符合规定.当供试品溶液的所有平行管均为阳性, 可记为内毒素的浓度年夜于或即是最年夜的稀释倍数乘以λ.表3 凝胶半定量试验溶液的制备注：A为不超越MVD而且通过干扰试验的供试品溶液.从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍, 最后的稀释倍数不得超越MVD.B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对比）.C为鲎试剂标示灵敏度的对比系列.D为阴性对比.方法2 光度测定法光度测定法分为浊度法和显色基质法.浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变动而测定内毒素含量的方法.根据检测原理, 可分为终点浊度法和静态浊度法.终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法.静态浊度法是检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的吸光度或透光率所需的反应时间, 或是检测浊度增加速度的方法.显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中发生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的几多而测定内毒素含量的方法.根据检测原理, 分为终点显色法和静态显色法.终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法.静态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间, 或检测值增加速度的方法.光度测定试验需在特定的仪器中进行, 温度一般为37℃±1℃.供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等, 参照所用仪器和试剂的有关说明进行.为保证浊度和显色试验的有效性, 应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验.标准曲线的可靠性试验当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时, 需进行标准曲线的可靠性试验.用标准内毒素制成溶液, 制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得年夜于10倍）, 最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限.每一稀释步伐的混匀时间同凝胶法, 每一浓度至少做3支平行管.同时要求做2支阴性对比, 当阴性对比的吸光度或透光率小于标准曲线最低点的检测值或反应时间年夜于标准曲线最低点的反应时间, 将全部数据进行线性回归分析.根据线性回归分析, 标准曲线的相关系数（r）的绝对值应年夜于或即是0.980, 试验方为有效.否则须重新试验.干扰试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm）, 作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度.按表4制备溶液A、B、C和D.表4 光度测定法干扰试验溶液的制备注：A为稀释倍数不超越MVD的供试品溶液.B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的, 且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液.C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的, 用于制备标准曲线的标准内毒素溶液.D为阴性对比.按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量ct和cs, 再按下式计算该试验条件下的回收率（R）.R=(csct)/λm×100%当内毒素的回收率在50%～200%, 则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用.当内毒素的回收率不在指定的范围内, 须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素, 偏重复干扰试验来验证处置的有效性.当鲎试剂、供试品的来源、处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变动时, 须重新进行干扰试验.检查法按“光度测定法的干扰试验”中的把持步伐进行检测.使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度.试验必需符合以下三个条件方为有效：⑴系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求；⑵用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后, 计算出的内毒素的回收率要在50%～200%的范围内；⑶阴性对比的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间年夜于标准曲线最低点的反应时间.结果判断若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后, 小于规定的内毒素限值, 判定供试品符合规定.若年夜于或即是规定的内毒素限值, 判定供试品不符合规定.注：本检查法中, “管”的意思包括其他任何反应容器, 如微孔板中的孔.。
细菌内毒素检查法及应用进展
细菌内毒素检查法及应⽤进展临床经验药品注射剂的热原检查时保证药品安全的重要检验项⽬。
家兔法（PT 法）检查热原的⽅法因耗时长、不经济、难以标准化等很多局限性使越来越多品种的热原检查项被细菌内毒素检查法（BET 法）所取代。
BET 是⼀种体外热原实验法，该法因其快速、灵敏、经济、重现性好等优点在国内外得到了⼴泛的应⽤。
因此检测细菌内毒素在药品质量控制、制药⼯艺和临床治疗监测中具有重要意义。
本⽂就细菌内毒素检查法及其应⽤进展作⼀综述。
1细菌内毒素检查法的国内外发展简述BET 最早由美国学者Dr.Levin 和Bang ⾸先建⽴，作为法定的检查⽅法。
1968年Dr.Levin 和Bang 发现阿⽶巴样⾎细胞含有⼀种物质，当和极⼩量的内毒素混合时就变成胶质，这个发现发展⾄今形成了现在的鲎试验法。
最早在1980年被美国药典20版（USPXX ）第⼀次正式收载，随后EP （1987版）BP Ⅷ1990年增补本，JP1991年改正版相续收载了此法。
到USPXXⅣ（2000版）已有580多种注射⽤药品采⽤了此法，仅有30余种药品因⼲扰因素难以排除⽽采⽤传统的热原法。
与国外相⽐，我国在这⽅⾯的研究还存在着较⼤的差距，发展较慢。
最早于1988年卫⽣部颁布《细菌内毒素检查法》和鲎试剂标准，中国药典（1995版）正式收载，规定13个品种使⽤BET 法。
到中国药典（2005版）细菌内毒素检查品种增⾄168种，BET 法正式收载光度测定法。
随着2010版中国药典的颁布和实施，它将被更⼴泛的应⽤于各种药品的质量控制。
2细菌内毒素检查的⽅法2.1鲎试验法鲎试验法⽬前有凝胶法，浊度法（⽐浊法），显⾊基质法(⽐⾊法)2.1.1半定量测定-凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产⽣凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的⽅法，是⼀种限量法，是各国药典细菌内毒素检查的⾸选⽅法。
此法操作简单，经济，不需要专⽤测定设备，结果可靠，重复性好。
其缺陷为特异性不强，精密度、定量性较差，不能直接反映药品中内毒素量值。
中国药典版《细菌内毒素检查法》(2020年整理).pptx
表 3 凝胶半定量试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/配制内毒素的 溶液
稀释用液
稀释倍数
所含内毒素的浓 度
A
无/供试品溶液
检查用水
1
—
平行管数 2
2
—
2
4
—
2
8
B
2λ水
检查用水
1
2
4
—
2
2λ
2
2λ
2
1λ
2
0.5λ
2
8
0.25λ
2
D
无/检查用水
—
—
—
2
注：A 为不超过 MVD 并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数
λc=1g-1(∑X/4)
1
学海无 涯
式中 X 为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减 的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc 在 0.5λ-2λ(包括 0.5λ和 2λ)时，方可用于细菌内毒素检查， 并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验 按表 1 制备溶液 A、B、C 和 D，使用的供试品溶液应为未检 验 出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（ MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏 度复 核试验项下操作。 只有当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶 液 C 和 B 的反应终点浓度的几何平均值（Es 和 Et）。
扰 的供试品溶液来制备溶液 A 和 B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作
。
编号 A
内毒素浓度/配制内毒素的溶液 表 2 凝胶限量试验溶液的制备
无/供试品溶液
平行管数 2
细菌内毒素检测标准
细菌内毒素检测标准一、范围：本试验为《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定的“凝胶法”，系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理，经判定供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。
二、依据：GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法。
第二部分：生物学试验方法。
《中华人民共和国药典》2010年版二部三、器具及试剂：1.器材：（1）锥形瓶（2）三角烧瓶（3）无热原剪刀、镊子（4）恒温培养箱（5）超净工作台（6）恒温水浴箱（7）电热干燥箱（8）旋涡混合器（9）移液器2.试剂：（1）细菌内毒素国家标准品（2）细菌内毒素工作标准品（3）鲎试剂（4）细菌内毒素检查用水四、实验前准备：1.器具处理：试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素。
玻璃器皿置电热干燥箱内1800C干烤至少2h，或2500C干烤至少30min。
塑料器皿置30%双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒检查用水充分冲洗后置600C烘干备用。
2.鲎试剂灵敏度复核实验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度试验。
试验步骤按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”中规定进行。
3.供试品干扰实验：（1）对未知或可疑的供试品初次进行细菌内毒素试验之前应先进行干扰试验，以检验供试品对细菌内毒素试验是否有抑制或增强作用，以及其他影响细菌内毒素试验准确性和敏感性的干扰作用。
当鲎试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺有变化或其他任何影响细菌内毒素试验结果的试验条件改变时，应重新进行干扰实验。
（2）每种产品应取3批并分别使用不少于两个制造商生产的鲎试剂进行干扰实验。
供试液制备按《中国药典（二部）》附录“细菌内毒素检查法”规定进行。
（3）如供试品对细菌内毒素试验有干扰作用，可选用下列适宜方法排除干扰：a)使用更灵敏的鲎试剂对供试品进行更大倍数稀释;b)采用无热原氨基甲烷缓冲液稀释供试液;c)采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液pH值在6.0-8.0范围;d)采用阳离子缓冲（MgSO4或MgCl2）稀释供试液以调节离子浓度。
药典三部(2015版)-通则-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
川芎嗪葡萄糖注射液细菌内毒素检查方法的研究
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警
Ｎ Ｃ
规 格 ９ ０ Ｅ Ａｍｐ 中 国药 品 生 物 制 品 检 定 所 ０ ０ Ｕ． ～，
提供。
ｌ ３ 细 菌 内 毒 素 检 查 用 水 （ Ｅ 水 ） 批 号 ， ＢＴ ：
００ ２ ， 格 ５ 支 。， １３ ９规 ｍ１ 。 由湛 江 海 洋 生 物 制 品检 定 所 提 供。
维普资讯
现 代 中 医药 ２ ０ ０ ２年 第 ４期
６ １
川 芎嗪 葡 萄糖 注射 液细 菌 内毒 素检 查 方 法 的研 究
萧珍 阎 凌霄 姚华 陕 西省 药 品检 验 所 （ １ ０ １ ７０６）
提 要 川 芎嗪 葡萄糖 注 射液 对 细 菌 内毒 素检 查有 抑 制作 用 ， 通过 稀 释 的方 法 可排 除 其 干扰 ， 其最 大 不 干扰 浓 度 为 １ ． ｍｇ ｍｌ 。 试 验 结 果 表 明 本 品可 用 细 菌 内毒 素 检 查 代 替 家 兔 热 原检 查 ２ ６ ． ＇。
１４ 鲎 试 剂 （ ＡＬ） 灵 敏 度 （ ０ ５ Ｕ ． 。 ， ． Ｔ ： ） ． Ｅ ｍｌ 。
２ ２供试 品 细 菌 内毒 素 限 值 （ 的 确 定 按 公 ． Ｌ） 式 Ｌ＝Ｋ Ｍ 计 算 ， 中 Ｋ 为 临床 无 任 何 不 良反 应 ／ 其
的 内 毒 素 阈 剂 量 ，静 脉 注 射 的 药 品 规 定 为 ５ ＵＫ 一 ； 为临 床 人用 最大 剂 量 ， 人 用量 每 公 Ｅ ｇ Ｍ 按 护 士倾 诉 ， 极采 取措 施 ， 积 防止 负性 情 绪 的 继 续 发
展 ， 防 意外 发生 。 以
５ 预 防和 早 期 发 现 病 态 心 理 癌 症 病 人 由于 ．
参芎葡萄糖注射液
溶液的颜色 取本品，与黄色或黄绿色 8 号标准比色液（中国药典 2015 年版四部通则
0901 第一法）比较，不得更深。
有关物质 精密量取本品适量，用流动相定量稀释制成每 1ml 中含盐酸川芎嗪 0.5mg
的溶液，作为供试品溶液；精密量取 1ml，置 200ml 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，
盐酸川芎嗪（C8H12N2·HCl·2H2O）应为标示量的 90.0%～110.0%；含葡萄糖（C6H12O6·H2O）
征应为标示量的 90.0%～110.0%。 【处方】
丹参
100g（丹参素 200mg）
盐酸川芎嗪
1.00g
葡萄糖
50g
求 甘油
其他辅料
10ml 适量
注射用水
适量
制成
1000ml
意 【制法 1】取丹参，加水提取两次，第一次用 8 倍水量，第二次用 6 倍水量，每次
细菌内毒素 取本品，依法检查（中国药典 2015 年版四部通则 1143），每 1ml 中含内毒
素的量应小于 0.50EU。
重金属及有害元素 照铅、镉、砷、汞、铜测定法（中国药典 2015 年版四部通则 2321）
检查，按照本品每日最大使用剂量计算，铅不得过 12μg，镉不得过 3μg，砷不得过 6μg，汞
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2%冰醋
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３ ４． ９
因此 ，其规 范 化 的用 药标 准 有待 进 一 步深 化研 中医药大学学报 ，２０ ，２ （Ｊ １ ５ １６ ０ ９ ５２ ８ — ８ ． 究 ，这样 莪术 油才能更科学 、更 规范 、更有效地 ［】 宋 利琼 ， 昌菊 ． ８ 张 莪术油联合干扰素对小 鼠宫颈癌 实 现其 抗肿 瘤 的作 用 。鉴 于莪术 油 临床 上 的确 端粒酶活性 和细胞凋亡 的影 响『１ Ｊ．上海 中医药杂
Ｌ ｍｉ ｔ ｏ ＬＩ Ｈｏ ｇ ｎ ｎ ｉ ｔ Ｍｅ ｈ ｄ Ｎ ｎ － ｉ ｇ， Ｃ ＨＥＮ Ｘｉｎ ｇ ｎ ｏ ｇ－ ａ ｇ， Ｌ ｉＴ ｅｆ ｓ ｐｅ ｐ ｅ ｈ ｓ ｉ ｌｏ Ｚｈ ｏ ｉ ｇ ＩＬ ． ｈ ｉ ｔ ｏ ｌ ｏ ｐ ｔ ｆ ａ ｑ ｎ ， ｒ ａ Ｚ ａ ｑｎ ， ２ ０ １ Ｃ ｉａ ｈ ｏ ｉｇ ５ ６ ２ ， ｈｎ
葡 萄糖 注射 液的细菌内毒 素限值 ， 用不 同厂家 的鲎试剂对三个批号 的参芎葡萄糖注射液进行干
扰试验 ， 考察确立其 内毒素的检查方法 。 结果 参芎葡萄糖注射液经 ６ 倍稀释后能消除干扰 ， 可 用标示 灵敏度为 ０２ ｕ ｍ 的鲎试剂检测其 细菌 内毒 素。结论 可用凝胶限量法代替家兔热原 ． Ｅ ，ｌ ５
临 床 ，２ ０ ， １ （ ：２３ ２ ５ ０ ５ ７ ４） ３ — ３ ．
［】 王琰 ， ２ 王慕郁． 姜黄属 常用 中药 的研究进展 【． Ｊ 中国 Ｊ
药学杂志 ，２ ０ ，３ （｝８ — ４ ０ １ ６２ ０ ８ ．
［】 李 国栋 ， ３ 许付 ， 沈爱军． 莪术 油的研 究进展 【】 Ｊ 中国 ．
（ 任 校对 ：吴琴娟 ） 责
・
药物研究 ・
凝胶 限量法 检 查参 芎 葡萄糖 注 射液 细菌 内毒 素 的研 究
林 红宁 陈雄 刚 李 丽
【 要 】 目的 摘
建立凝 胶限量法检查参 芎葡萄糖注射 液细菌 内毒 素的方法 。方法
参照
中国药典中细菌内毒素检查法和细菌内毒素检查法应用指导原则要求进行实验设计 ， 确定参芎
［ ｌｔ ｃ］ ｏ ｊｃｉ Ｓｔ ｐｔｅ ｅ ｍｉｍｅｈ ｄｆｒｅｔ ｇ ｈ ａｔｒ ｌ ｎ ｏｏｉｓ ｆｈ Ａ￣ ｒ ｔ ａ ｂｅｔ ｅ ｅ ｕ ｌｉ ｔ ｔｏ ｓｉ ｅＢ ｃｅｉ ｄｔｘｎ ｅ ｖ ｈｇ ｌ ｏｔ ｎ ｔ ａＥ ｏｔ
Ｓ ｅｘｏｇＧｕｏｅ ｎｅｔ ｎ Ｍｅ ｏ Ｔ ｅ ｘ ｅｉ ｎｓ ｅｅ ｅｉ ｅ ｃｒｉ ｅ ａｔｒ ｌｎ ｏ— ｈ ｎ ｉ ｌｃｓ ｊｃ ｏ． ｔ ｄ ｈ ｐ ｒ ｎ Ｉ ｉ ｈ ｅ ｍｅｔｗ ｒ ｄｓ ｎ ｄ ｃｏｄｎ ｔｔ ｃ ｉ ｄｔ ｇ ａ ｇ ｏ ｈ ｂ ｅ ａｅ
药学杂志 ，２ ０ ，３ （１ ８ ６ ８ ９ ０２ ７１ ０ — ０ ．
ｆ１ 宋爱莉 ，殷玉琨． ４ 莪术 油干预治疗肿 瘤的研究及应
用概况『 ． 中医药大学学报 ， ０ ８ ３ （｝１２ Ｊ 山东 Ｊ ２ ０ ， ２２ ７ —
１ ７４
（ 收稿 日期 ：２ ０ 一ｌ — ） ０ ９ ０１ １
９０ ７
国际 医药卫生导 报 ２ ｌ ０ ０年 第 ｌ ６卷 第 Ｏ 期 ８
Ｉ ＭＨＧＮ，Ａ ｒｌ ０１ ｐｔ ２ ０，Ｖｏ．６ Ｎ ．８ １ ｏ０ １
Ｒｅ ｅ ｒｈｆｒＴ ｓｉｇ Ｂ ｃｅｉｌＥ ｄ ｔｘｎ ｆｔｅＳ ｅ ｘｏ ｇＧｌｃ ｓ ｎ ｅ ｔ ｎ ｗｉ ｅ ｓ ａｃ ｏ ｅ ｔ ａ ｔｒ ｎ ｏｏ ｉｓｏ ｈ ｈ ｎ ｉｎ ｕ ｏ ｅ Ｉｊｃｉ ｔ Ｇ ｌ ｎ ａ ｏ ｈ
切 疗效 和 明显 的抑瘤 的 作用 ，对 莪 术油 及其 活 志 ，２ ０ ，４ （ ：６ — ９ ０ ６ ０ ７） ８ ６ ． ［】 盛 辉 ，苑春莉 ，王 医术 ．莪术 油对肺癌 Ｓ Ｃ Ａ ９ Ｐ — ４细 性 成分 的深人 开发 有着 广 阔的应 用前景 。
胞株 的体外 抑 制 作用 ［ 】 Ｊ ．江 西 中医 学 院学 报 ，
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国际 医药 卫生导报 ２ １ 年 第 １ 卷 第 Ｏ 期 ００ ６ ８
Ｉ Ｇ ＭＨ Ｎ，Ａ ｒ ０ ０ ｏ． Ｎ ．８ ｐ ｉ ２ １ ，Ｖ １ ６ ｏ ｌ １ ０
５ 莪术醇 的研究进展【 ． Ｊ １ 传 统 的抗 肿瘤 中药 ，其 抗肿 瘤 的化 学成 分 、药 【］ 曾建红 ，陈旭 ，潘艳薇 ，等． 中 药 材 ，２ ０ ，３ （ １８ １０ ０ ８ １１ ６ — ７ ． 理 、临床 等方面研究逐步 开展 ，并 证实 了莪术 油
６ 榄香烯抗肿瘤作用机制 是 一种抑 瘤作 用强 、高效 、安 全 的药 物 。但就 ｆ】 周 洪语 ，侯 菊生 ，罗其 中． 的研究进展ｆ ． Ｊ 中国肿瘤 临床 ，２ ０ ，２ （ ９ — ］ ０ ５ ７５ ￣３ ２ 现 在 临床研 究 而 言 ，缺 乏大 样本 的规 范化单 一
用 药或联合 用药 的疗效 标准及 评价标 准 的研 究 ，
法检查 参芎葡萄糖注射液的致热物质 。
【 关键 词 】 参 芎葡萄糖 注射液 ；凝胶 限量法 ；细菌 内毒 素
ＤＯ ：１ ． ６ ／ｍａ ．ｓ ． ０ — ２ ５２ １．８０ １ Ｉ ０３ ０ｃ ｊｉ ｎ１ ７ １４ ．０ ００ ．３ ７ ｓ ０
作 者单 位 ：５ ６ ２ 肇 庆市第 一 人 民医 院 ２０ １