TSQVantage质谱仪测定两种多肽类药物戈舍瑞林和艾塞那肽
艾塞那肽单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法的建立
倪晓燕，杜贤宇，周乐春，程婷，储成风，沈毅，王荣海，宋礼华
艾塞那肽（exenatide）是 Exendin-4 的人工合成品，是 首获批准应用于 2 型糖尿病的胰高血糖素样肽 1 受体激动 剂（glucagon-like peptide-1 receptor agonist，GLP-1RA）[1-2]。 注射给药后，通过模拟胰岛素抑制胰高血糖素的分泌，减慢 胃排空和减少食欲从而达到控制血糖的效果[3-10]。研究资料 表 明 ， 艾 塞 那 肽 的 测 定 方 法 目 前 主 要 有 高 效 液 相 法 [11] 和 ELISA 试剂盒法。其中高效液相法主要用于艾塞那肽制剂 的含量、纯度等检测；ELISA 方法灵敏度高，样品适用性 广，可用于艾塞那肽血药浓度测定，但进口试剂盒价格十分 昂贵，且难以获得，国产的试剂盒对样品的处理要求较高、 不易获得稳定的检测结果。鉴于艾塞那肽的临床应用价值和 未来的广泛使用，建立一种灵敏、适用性强的艾塞那肽含量 检测方法具有十分重要的意义。
本文成功制备了艾塞那肽的单克隆抗体（McAb），并建 立了检测血样中艾塞那肽含量的 ELISA 检测方法，成功用 于艾塞那肽制剂的临床前药学研究。
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 动物及细胞 6 ~ 8 周龄雌 Balb/c 小鼠和 6 周龄 SD 大鼠均由安徽安科生物工程（集团）股份有限公司动 物实验中心提供；SP2/0 骨髓瘤细胞由安徽省医学研究所 赠送。 1.1.2 试剂 艾塞那肽注射液（0.25 mg/ml）购自美国 Baxter Pharmaceutical Solutions LLC 公司；艾塞那肽由安徽 安科生物工程（集团）股份有限公司生产；HAT 培养液、 HT 培养液购自北京索莱宝科技有限公司；弗氏佐剂购自美 国 Sigma 公司；辣根过氧化物酶（HRP）购自上海国源生 物技术有限公司；牛血清白蛋白购自美国 Amresco 公司； PierceTM Unstained Protein MW Marker 购自美国 Thermo Scientific 公司；吐温 20、硫酸、辛酸、硫酸铵、TMB 等 均为国产分析纯试剂。 1.2 方法 1.2.1 艾塞那肽单克隆抗体制备 1.2.1.1 细胞株制备 取艾塞那肽与等体积的弗氏完全佐 剂充分混匀乳化，分别免疫各雌鼠，每只 0.5 mg，7 d 给药 1 次；42 d 从雌鼠的尾部取血，间接 ELISA 法[12]测血清 滴度，将滴度最高的雌鼠用艾塞那肽免疫，每只 1 mg，3 d 后取该雌鼠的脾细胞制成细胞悬液，将得到的脾细胞悬液与
HPLC法测定注射用艾塞那肽中主药的含量
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ＨＰＬＣ法测定注射用艾塞那肽中主药的含量
作者：石琳董庆光王春雨刘斌孔维陈妍
来源：《中国当代医药》2009年第08期
[摘要]目的：建立测定注射用艾塞那肽中主药含量的高效液相色谱法。
方法：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C3，流动相A相为20mmool/L磷酸二氢钾(磷酸调pH至3.0)，B相为乙腈，梯度洗脱，流速为1.2ml/min，检测波长为210nm，进样量为100μl。
结果：艾塞那肽的线性范围为5～50μg/ml(r=0.999 9)，平均加样回收率为100％(RSD=0.70％)。
有关物质总量为
3.33％。
结论：本方法简便、快速、准确，适用于该制剂的质量控制。
[关键词]高效液相色谱法；艾塞那肽；含量测定
[中图分类号]R927.2
[文献标识码]B
[文章编号]1674-4721(2009)04(b)-122-02。
HPLC法测定注射用艾塞那肽中主药的含量
HPLC法测定注射用艾塞那肽中主药的含量石琳;董庆光;王春雨;刘斌;孔维;陈妍【期刊名称】《中国当代医药》【年(卷),期】2009(016)008【摘要】目的:建立测定注射用艾塞那肽中主药含量的高效液相色谱法.方法:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C3,流动相A相为20 mmol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH 至3.0),B相为乙腈,梯度洗脱,流速为1.2 ml/min,检测波长为210 nm,进样量为100μl.结果:艾塞那肽的线性范围为5～50 μg/ml(r=0.999 9),平均加样回收率为100%(RSD=0.70%),有关物质总量为3.33%.结论:本方法简便、快速、准确,适用于该制剂的质量控制.【总页数】2页(P122-123)【作者】石琳;董庆光;王春雨;刘斌;孔维;陈妍【作者单位】吉林大学生命科学学院,吉林长春,130012;吉林大学生命科学学院,吉林长春,130012;长春生物制品研究所,吉林长春,130062;吉林大学生命科学学院,吉林长春,130012;吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室,吉林长春,130012;吉林大学生命科学学院,吉林长春,130012;吉林大学生命科学学院,吉林长春,130012【正文语种】中文【中图分类】R927.2【相关文献】1.高效液相色谱法测定注射用二乙基二硫代氨基甲酸钠中主药的含量 [J], 王海凤;王东凯;庄润2.紫外分光光度法测定注射用甲磺酸萘莫司他中主药含量 [J], 刘健3.HPLC法测定吉西他滨肉豆蔻酸酯脂质体中主药的含量 [J], 罗芳; 李岩; 郭晓茹; 汪阿鹏; 夏桂民4.HPLC法测定吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中主药的含量 [J], 李岩;郭晓茹;冯文凯;刘明亮;王丹;夏桂民5.HPLC测定注射用盐酸雷莫司琼中主药和有关物质的含量 [J], 周燕;刘建芳;王国勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于不同体质量指数的2型糖尿病患者采用艾塞那肽治疗的临床效果
基于不同体质量指数的2型糖尿病患者采用艾塞那肽治疗的临床效果目的探討不同体质量指数的2型糖尿病患者采用艾塞那肽治疗的临床效果。
方法将在该院接受治疗的60例2型糖尿病患者作为此次的研究对象，依据不同的体质量指数（BMI）将其分为甲组和乙组，甲组（19 kg/m2≤BMI0.05）。
结论对于超重或肥胖患者而言，艾塞那肽具有更好的治疗效果，在临床治疗中值得借鉴应用。
标签：不同体质量；2型糖尿病；艾塞那肽；临床疗效糖尿病是由于体内胰岛素分泌失调或者是胰岛素作用障碍所导致的以高血糖为主要特征的一种代谢性疾病，在临床上比较常见，在临床上表现为“三多一少”，对患者的身体健康产生严重的影响，由于糖尿病常常伴有诸多并发症，严重时甚至会直接威胁到患者的生命健康，因此在临床治疗上应该引起重视[1-3]。
该研究着重探讨了不同体质量指数的2型糖尿病患者采用艾塞那肽治疗的临床效果，将该院收治的60例患者作为研究对象，其中38例乙组2型糖尿病患者在接受艾塞那肽治疗后取得了比较积极的结果，现报道如下。
1 资料与方法1.1 一般资料选取在该院接受治疗的60例2型糖尿病患者作为研究对象，所有患者均符合世界卫生组织关于糖尿病的诊断标准，按照不同的BMI将患者分为甲组和乙组，甲组（19 kg/m2≤BMI0.05）；具有可比性。
1.2 治疗方法所有患者均接受常规的降糖治疗，在此基础上再实施艾塞那肽治疗，并且在整个实验过程中所有患者不再服用其他影响血糖、血脂的药物。
在每天早餐和晚餐之前约1 h进行艾塞那肽皮下注射，初始剂量为5 μg/次，治疗1月之后依据患者的身体状况和治疗状况将用药剂量增加至10 μg/次。
在治疗期间做好患者治疗前后BMI、血压以及HbA1c、FPG、2hPG、TG等指标的测量工作。
对于患者出现的不良反应给予及时的对症处理[4]。
1.3 观察指标观察并记录患者治疗前后FPG、2hPG、HbA1c、TG、TC、SBP、DBP以及BMI、体重等指标的变化情况与用药不良反应发生情况。
LC-MS分析埃塞那肽的肽图
华西药学杂志W C J ・P S 2009,24(5)ζ544～545作者简介:付金香,河北沧州,正攻读微生物与生化药学的硕士学位。
Email:fujinxiang1314@ 3通讯作者(Corres pondent author ),Email:yikong668@s ohu .comLC -MS 分析艾塞那肽的肽图付金香,霍建丽,田 垒,刘玉雪,孔 毅3(中国药科大学生命科学与技术学院生物制药教研室,江苏南京210009)摘要:目的 用液质联用技术(LC -M S )分析艾塞那肽的肽图。
方法 用胰蛋白酶切RP -HP LC 肽图法测定艾塞那肽肽图,用ESI -LC /M S 技术分析肽段的精确相对分子量。
结果 根据肽段的色谱保留时间、相对分子质量归属出肽图中各肽段所在的色谱峰。
结论 LC -MS 是验证和分析蛋白质结构的高效准确方法。
关键词:肽图谱分析;艾塞那肽;胰蛋白酶切RP -HP LC 肽图法;液相色谱-质谱联用中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1006-0103(2009)05-0544-02Pepti de mapp i n g ana lysis of Exena ti de by LC -M S spectrom etryF U J in -xiang,HUO J ian -li,TI A N Lei,L IU Yu -xue,K ONG Yi3(D epart m ent of B iophar m acy,School of L ife Science and Technology,China Phar m aceutical U niversity,N anjing,J iangsu,210009P .R.China )Abstract:O BJECT I VE To analyze the pep tide mapp ing of Exenatide by LC /MS .M ETHOD S The pep tide mapp ing was analyzed by tryp sin digesti on and RP -HP LC analysis .The relative molecular weight of the pep tide frag ments was measured by ESI -LC /M S .RESUL TS The pep tide frag ments of Exenatide in the pep tide mapp ing were assigned by analyzing the retain ti m e and relative molec 2ular weight .CO NCL US I O N The study p r oves that LC -M S is a good method t o analyze pep tide mapp ing of p r otein with the advan 2tage of sensitivity,high s peed and accuracy .Key words:Pep tide mapp ing analysis;Exenatide;Tryp sin digesti on and RP -HP LC analysis;LC -MS CLC nu m ber:R917 D ocu m en t code :A Arti cle I D :1006-0103(2009)05-0544-02 肽图谱(pep tide mapp ing )分析是通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后,鉴定蛋白质一级结构完整性和准确性的方法[1]。
应用TSQ Vantage_重四极杆质谱仪分析21种p受体激动剂
应用TSQ Vantage_重四极杆质谱仪分析21种p受体激动剂作者：暂无来源：《中国食品》 2013年第9期文马乐叶芳挺 Thermo Fisher Scientific, Shanghai, China背景“瘦肉精”是β受体激动剂类化合物的俗称，饲料中添加“瘦肉精”可喂出瘦肉率较高的“健美猪”，但对人体毒副作用巨大，中国在2002年明令禁止“瘦肉精”使用于养殖业。
国内外的相关科学研究表明，食用含有‘瘦肉精’的肉会对人体产生危害，常见有恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，特别是对心脏病、高血压患者危害更大。
长期食用则有可能导致染色体畸变，会诱发恶性肿瘤，至于究竟摄入多大量，如何导致恶性肿瘤，有关病例研究国内外尚无定论。
但是，近几年，各地“瘦肉精”致人中毒甚至死亡的案例时有发生。
目前β受体激动剂的检测方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫法、液质联用法等，其中液质联用检测β受体激动剂准确、快速、灵敏度高。
本文采用 Thermo scientific TSQ Vantage三重四极杆质谱系统，建立了同时定量猪尿及禽肉中21种β受体激动剂的液质联用法.该方法具有简便、快速、特异性强且灵敏度高等特点，适合检测机构客户的应用。
实验部分：仪器与试剂：甲醇（色谱纯，美国Fisher），水为超纯去离子水，甲酸（分析纯）仪器：TSQ Vantage三重四极杆质谱仪搭配HESI II ESI 离子源，Accela 600超高压液相色谱仪1、基质样品处理：A、猪尿样品：提取：取样品5ml于50ml离心管中，以5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9-10，加异丙醇：甲基叔丁基醚（60∶40）10ml充分震荡，4000r/min离心5min，将上清液转移至鸡心瓶中，重复提取一次，合并上清液，旋转蒸发近干，以0.1%甲酸水溶液1ml溶解残渣，备用。
净化：MCX固相萃取小柱先以1ml甲醇，1ml水活化。
样品提取液过柱，用1ml 0.1%甲酸水溶液和1ml甲醇淋洗，空气抽干2min，5%氨水甲醇溶液3ml洗脱，收集洗脱液，氮气流吹干，1ml 0.1%甲酸水溶液溶解，0.22um滤膜过滤后进样测定。
艾塞那肽联合二甲双胍治疗2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的疗效观察
艾塞那肽联合二甲双胍治疗2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的疗效观察郑淑莺;薛芳;周晓慧;牛延德【期刊名称】《浙江医学》【年(卷),期】2016(038)010【总页数】3页(P745-747)【作者】郑淑莺;薛芳;周晓慧;牛延德【作者单位】313000 湖州市中心医院内分泌科;313000 湖州市中心医院内分泌科;313000 湖州市中心医院内分泌科;313000 湖州市中心医院超声科【正文语种】中文随着社会经济生活水平的提高，2型糖尿病（T2DM）的发病率逐年增长。
我国近年的流行病学研究显示，糖尿病的发病率达11.6%[1]。
同时，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）也以惊人的速度增长[2]，T2DM患者中合并NAFLD的比率达34%～74%。
伴有肥胖的T2DM患者NAFLD更是几乎普遍存在[3]。
因此，对于合并NAFLD的T2DM患者，在有效降底血糖的同时，能改善脂肪肝以及控制体重的降糖药物是治疗的首选。
近年肠促胰素与T2DM病理生理机制间的重要作用已被广泛认识，艾塞那肽是首个上市的肠促胰素类似物降糖药。
本研究旨在比较艾塞那肽和吡格列酮分别联合二甲双胍治疗T2DM合并NAFLD患者的临床疗效,以期为临床治疗提供参考。
1.1 一般资料选取2012年6月至2015年7月在我院门诊及住院的T2DM合并NAFLD患者58例，近期仅单药使用二甲双胍1 000～2 000mg 2个月以上，糖化血红蛋白未达标（HbA1C≥7.0%）。
所有患者符合以下条件：（1）糖尿病符合1999年WHO糖尿病诊断标准，排除1型糖尿病、妊娠糖尿病、其他特殊类型糖尿病；（2）NAFLD符合2010年中华医学会肝脏病学分会《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[4]；（3）排除有严重心脑血管疾病，心功能不全、严重肝功能受损（转氨酶指标达正常上限3倍以上），肾功能不全以及伴随其他严重疾病的患者；（4）近2周内未使用任何护肝降酶药物；（5）育龄人群近期无妊娠需求；（6）排除有使用艾塞那肽或吡格列酮禁忌的患者。
高效液相色谱-质谱联用法分析降糖中药制剂中含有的西药成分
高效液相色谱-质谱联用法分析降糖中药制剂中含有的西药成分束昇阳;陈志远【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2010(019)013【摘要】目的:应用高效液相色谱-质谱(LC-MS)技术分析中药降糖制剂中可能存在的西药成分.方法:采用高效液相色谱-质谱法对降糖中药制剂进行全扫描和SIR定量分析,对临床常用降糖药中含有西药成分的进行筛选.色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18(150mm×4.6 mm,5 μm);保护柱:Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵-冰醋酸(70:30:0.02);柱温:3O℃.流速:0.2 mL·min-1.结果:所测定的中药降糖药中含有一种西药组分,为苯乙双胍,峰保留时间在2.6 min,其浓度与峰面积呈良好的线性关系.结论:本方法可用于中药降糖药中西药成分的分析.【总页数】2页(P29-30)【作者】束昇阳;陈志远【作者单位】江苏省中医院,江苏,南京,210029;江苏省中医院,江苏,南京,210029【正文语种】中文【中图分类】R927.2【相关文献】1.超高效液相色谱-质谱/质谱联用法快速测定苦碟子注射液中两种倍半萜内酯类成分的含量＊2.反相高效液相色谱法检测降糖类中药制剂及中药保健品中双胍类及磺酰脲类成分3.液相色谱-质谱联用法检测某些降糖中药制剂中的磺酰脲类化学药4.超高效液相色谱-串联质谱联用法同时检测降糖类和减肥类保健品中20种非法添加的化学降糖药物5.超高效液相色谱-质谱联用法与气相色谱-质谱联用法分析水性印油印记的主要成分因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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图1 戈舍瑞林结构式
图2 艾塞那肽结构式
实验部分
2.1仪器与试剂
TSQ Vantage串联质谱仪(赛默飞世尔科技 Thermo
表1)；流速：0.20mL/min；进样体积：10 µL。
戈舍瑞林质谱条件： ESI正离子模式。
喷雾电压：4.0KV; 鞘气：25 arb；辅助气：10 arb；毛细管温度：380˚C；碰撞气：氩气(1.5 mtorr)。
采用选择反应监测(SRM)扫描模式，戈舍瑞林的SRM参数见表3。
艾塞那肽色谱条件：Thermo Hypersil Gold C18柱(100×2.1mm，3 µm)，柱温35 ˚C；流动相A: 0.2%甲酸水溶液，流动相B：甲醇，采用梯度洗脱(洗脱程序见表2)；流速：0.20mL/min；进样体积：10 µL。
艾塞那肽质谱条件： ESI正离子模式。
喷雾电压：4.5KV; 鞘气：35 arb；辅助气：10 arb；毛细管温度：350˚C；碰撞气：氩气(1.5 mtorr)。
采用选择反应监测(SRM)扫描模式，艾塞那肽的SRM参数见表3。
结果与讨论
3.1 LC-MS/MS方法优化及灵敏度考察
经优化流动相和质谱参数，采用ESI正离子模式检测，经各质谱参数优化后，两种多肽类药物戈舍瑞林和艾塞那肽均有很高的灵敏度，定量限分别为2pg/mL和20pg/ mL。
碰撞能量优化结果见图3(a)和图3(b)。
在该实验条件下所得典型LC-MS/MS色谱图见图4(a)-图4(d)。
3.2 方法的线性和重复性考察
戈舍瑞林：将浓度为1mg/mL的混合标准溶液逐级稀释成1000，200，100，20，10，5，2 pg/mL系列标准溶液，分别进样分析。
以分析物子离子色谱峰面积对质量浓度作标准曲线，所得线性方程及线性系数见图5(a)。
2 pg/mL 图3(a)
戈舍瑞林碰撞能量优化图3(b)
艾塞那肽碰撞能量优化
用文献
Application Notes
结论
本文通过TSQ Vantage 质谱仪建立的两种多肽类化合物戈舍瑞林和艾塞那肽的高效液相色谱－电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测方法。
该方法灵敏度高，定量限分别达到了2pg/mL 和20pg/mL ，标准曲线线性良好，重复性满足要求。
除了考察标准溶液，实验中我们还以犬血浆基质预处理后添加样品(2ng/mL)为分析对象，分别考察了分辨率分别为FMWH=0.7和FMWH=0.2时的性噪比和选择性。
结果表明，分析戈舍瑞林时，FMWH=0.2时样品的性噪比S/N 提高2.3倍，选择性增强；分析艾塞那肽时，FMWH=0.2时样品的性噪比S/N 提高了5倍，同时在复杂基质中极大地改善了色谱上的分离度。
结果表明，TSQ Vantage 具有的高选择性离子检测模式可以极大地改善在复杂基质中样品的选择性和性噪比，尤其在血浆和组织这
样复杂的生物样本中优势更为明显。
样品连续进样三次，RSD 为7.36%，重复性满足要求。
艾塞那肽：将浓度为1mg/mL 的混合标准溶液逐级稀释成2000，1000，200，100，50，20pg/mL 系列标准溶液，分别进样分析。
以分析物子离子色谱峰面积对质量浓度作标准曲线，所得线性方程及线性系数见图5(b)。
2 0pg/mL 样品连续进样三次，RSD 为9.17%
，重复性满足要求。
图5(a)
戈舍瑞林标准曲线
图5(b)艾塞那肽标准曲线。