脂质体RNAiMAX介导siRNA转染沉默胰岛素瘤NIT-1细胞血管紧张素Ⅱ1型受体基因的实验研究
siRNA转染的方法
siRNA转染的方法A．siRNA转染的方法哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面：转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时的细胞密度、转染时的操作顺序、细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间B．Lipofectamin2000 转染试剂选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。
Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作，可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染，也可应用于DNA/siRNA的共转染操作；是一种新型的高效siRNA转染试剂。
Lipofectamin2000的应用领域：1、原代培养细胞和转化细胞株的基因转染2、siRNA高通量转染试验3、DNA转染；DNA和siRNA的共转染4、核酸（siRNA、DNA、RNA）的体内导入试验5、贴壁细胞和悬浮细胞转染Lipofectamin2000 的特点：1、不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作2、在含血清培养基中也能表现高转染效率3、细胞毒性低；适用细胞广泛4、即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染5、基于脂质的转染试剂，确保没有RNAse活性6、可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入C. Lipofectamin2000适用的细胞类型Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如：HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。
阳离子脂质体递送STAT3 siRNA抑制黑色素肿瘤细胞探究
阳离子脂质体递送STAT3 siRNA抑制黑色素肿瘤细胞探究邹瑞;彭正松【摘要】利用阳离子脂质体作为载体,用其搭载鱼精蛋白与STAT3 siRNA复合物,通过一系列实验证实该复合体系可显著抑制STAT3基因在黑色素瘤细胞B16中的表达,促进肿瘤细胞的凋亡.首先对载体材料进行了一系列表征测定,检测了不同复合比例下载体和siRNA复合物的粒径和电位.利用载体和siRNA的复合物对B16细胞进行转染并测定转染效率,随后对复合材料的毒性进行了检测.此外还进行了细胞凋亡、平板克隆、荧光定量PCR以及Western Blot等一系列实验来进一步确定载体复合物的有效性.实验结果表明,阳离子脂质体搭载复合了鱼精蛋白的STAT3siRNA表现出了良好的靶向治疗性及优秀的递送效率,且复合体系稳定性良好,毒性低.【期刊名称】《西昌学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(033)001【总页数】6页(P28-33)【关键词】阳离子脂质体;鱼精蛋白;siRNA;STAT3【作者】邹瑞;彭正松【作者单位】西华师范大学生命科学学院,四川南充 637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充 637009;西昌学院农业科学学院,四川西昌 615000【正文语种】中文【中图分类】R739.51998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire A 等首次在秀丽隐杆线虫（C.elegans）发现了一个双链RNA能够沉默蠕形秀丽隐杆线虫基因表达，并证明上述现象属于转录后水平的基因沉默[1]，这一现象正式被称为 RNA 干扰（RNAi）。
从 1999年人们发现RNAi 现象[2]的存在到 2001年，RNAi 技术正式应用于哺乳动物细胞基因功能的研究中[3]，短短几年内，RNAi技术得到了飞速发展。
毫无疑问，若RNAi技术能有效应用于临床，这将是基因治疗领域的一大突破。
RNAi 能够抵抗转基因或外源性病毒的侵犯。
在体外设计与靶基因mRNA 同源互补的双链RNA后，将这段双链RNA 导入目的细胞，其能够通过同源互补，从而靶向性地降解该mRNA，达到靶基因沉默的效果。
RNAi对细胞因子信号转导抑制因子1在内皮细胞中表达的沉默作用
RNAi对细胞因子信号转导抑制因子1在内皮细胞中表达的沉默作用丁浩;苏海;吴延庆;李菊香;洪葵;万磊;夏子荣;颜素娟;罗伟;程晓曙;吴清华【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2009(013)024【摘要】背景:利用RNAi技术引发细胞因子信号转导抑制因子1沉默可促进神经内分泌肿瘤细胞的凋亡,然而对于内皮细胞是否有类似的作用,目前尚不清楚.目的:实验拟验证内皮细胞中是否有细胞因子信号转导抑制因子1表达,并在所设计的siRNA中,筛选出1对对细胞因子信号转导抑制因子1沉默效率最高的siRNA.设计、时间及地点:随机对照,体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在南昌大学医学院第二附属医院所属的江西省分子医学重点实验室完成.材料:人脐静脉内皮细胞由南京凯基生物公司提供.方法:设计并化学合成4对靶向细胞因子信号转导抑制因子1的siRNA:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4.培养人脐静脉内皮细胞,利用RT-PCR检测人脐静脉内皮细胞是否有细胞信号转导抑制因子1表达.将带有荧光标记的阴性对照siRNA配制成25,50,75,100 nmol/L的4组,利用脂质体转染细胞,并在荧光倒置显微镜下观察转染效率,对比得出有最佳转染效率的浓度.然后,实验根据不同的处理因素分成8组:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4和阳性对照组、阴性对照组、转染试剂组、空白对照组4个对照组.将均为有最佳转染效率浓度的各组siRNA转染细胞,48 h后提取RNA.主要观察指标:利用RT-PCR测定细胞因子信号转导抑制因子1 mRNA的相对表达水平.结果:人脐静脉内皮细胞高表达细胞因子信号转导抑制因子1.siRNA在50 nmol/L时有较高的转染效率.4对siRNA干扰后,细胞因子信号转导抑制因子1 mRNA的表达水平与阴性对照、转染试剂组和空白对照组相比明显下调(P＜0.05),与阳性对照组相比显著下调(P＜0.01),其中siRNA-3的沉默效率最高(P＜0.05),阴性对照、转染试剂组和空白对照组与阳性对照组相比明显下调(P＜0.05),阴性对照、转染试剂组和空白对照组之间差异无显著性意义(P＞0.05).结论:内皮细胞中存在细胞因子信号转导抑制因子1表达.RNAi抑制细胞因子信号转导抑制因子1在内皮细胞中的表达,实验筛选出1对沉默效率最高的siRNA.【总页数】5页(P4668-4672)【作者】丁浩;苏海;吴延庆;李菊香;洪葵;万磊;夏子荣;颜素娟;罗伟;程晓曙;吴清华【作者单位】南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006;南昌大学医学院第二附属医院心内科,江西省南昌市,330006【正文语种】中文【中图分类】R349.54【相关文献】1.细胞因子信号转导抑制因子3激酶抑制区对STAT3磷酸化的抑制作用 [J], 王丽;马辉;焦倩;王媛媛;张智超;杨蓬勃;陈新林;李昭荣;吕海侠2.细胞因子信号转导抑制因子-1在脓毒症小鼠肝脏和脾脏中表达的研究 [J], 赵锋;潘雯;梁艳冰;唐皓;陈志斌;林妙霞;杨晓燕;周伟雄;马中富3.细胞因子信号转导抑制因子1沉默对人恶性黑色素瘤细胞增殖和干扰素-γ敏感性的影响 [J], 涂志全;杭华;段力;温宏升4.慢病毒介导RNAi沉默IL-1 Ⅰ型受体在大鼠骨关节炎MAPK信号转导中的作用[J], 周斌;俞永林;杨丰建;任惠民5.细胞因子信号转导抑制因子1在肝脏炎症性疾病发生发展中的作用机制 [J], 吴霞;朱晓宁;张玉蓉;尹玥;彭孟云;郑丁;汪静因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
靶向沉默转化生长因子β1表达的短发夹 RNA的筛选
靶向沉默转化生长因子β1表达的短发夹 RNA的筛选李敏;李新强;付琳琳;吴余;王虹;唐小燕;付素珍【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2015(000)001【摘要】目的：筛选可靶向沉默转化生长因子β1（TGF－β1）表达的短发夹RNA（shRNA）。
方法：设计和制备靶向沉默TGF－β1的5条shRNA，并构建靶向沉默TGF－β1的p－Genesil－shRNA真核表达重组质粒及含无关shRNA的 p－Genesil－1－shRNA－vect对照质粒，酶切和测序方法进行鉴定。
通过脂质体介导分别将p－Genesil－1－shRNA－vect质粒和各重组表达质粒转染入高糖或AngⅡ环境激活的HKC细胞（分别命名为p－Genesil－1－vect细胞及p－Genesil－shRNA 1～5细胞），Western blot方法检测沉默TGF－β1表达的效果。
结果：酶切和测序结果显示，5种重组质粒均可切出与预计相符的目的片段，所有shRNA编码序列与设计一致。
与HKC细胞相比，高糖或AngⅡ刺激的HKC 细胞和p－Genesil－1－vect细胞中TGF－β1表达均增高（F＝74．188，P＜0．001），而后二者之间TGF－β1表达差异无统计学意义（P＞0．05）。
与高糖或AngⅡ刺激的p－Genesil－1－vect细胞相比，高糖或AngⅡ刺激的各组p－Genesil－shRNA细胞中TGF－β1表达均降低（F＝139．695，P＜0．001）。
结论：筛选出1条可靶向沉默TGF－β1表达的shRNA。
%Aim:To screen the short hairpin RNA ( shRNA) targeting TGF-β1.Methods: Covering the cDNA full- length of TGF-β1 gene, 5 pairs of shRNA targeting TGF-β1 mRNA were designed and obtained .The eukaryotic expression recombinant plasmid(p-Genesil-shRNA 1,2,3,4 and 5) targeting TGF-β1 and unrelatedshRNA (p-Genesil-1-shRNA-vect) were constructed .The plasmids were identified by enzyme digestion and gene sequencing respectively .The above mentioned eukaryotic expression recombinant plasmids were transfected into HKC cells which had been activated by high glucose or AngⅡvia liposomes, then named p-Genesil-1-vect cells, p-Genesil-shRNA 1,2,3,4 and 5 cells.The shRNA targeting TGF-β1 was screened through detecting the changes of expression of TGF-β1 by Westernblot .Results:The re-sults of enzyme digestion showed that the length of digestion fragments was consistent with expected length respectively .The results of gene sequencing showed that , compared with designed sequences , gene coding sequences of shRNA were exactly consistent.The results of Western blot showed that: compared with HKC cells, the expression of TGF-β1 in HKC cells stimulated by high glucose or AngⅡand p-Genesil-1-vect cells was significantly increased (F=74.188,P<0.001).How-ever, the expression of TGF-β1 in HKC cells stimulated by high glucose or AngⅡand p-Genesil-1-vect cells had no signifi-cant difference(P>0.05).Compared with p-Genesil-1-vect cells stimulated by high glucose or AngⅡ, the expression of TGF-β1 in p-Genesil-shRNA cells were significantly depressed (F=139.695,P<0.001).Conclusion:One pair of shR-NA which could efficiently silence TGF-β1 expression has been screened .【总页数】5页(P61-64,65)【作者】李敏;李新强;付琳琳;吴余;王虹;唐小燕;付素珍【作者单位】新乡医学院第一附属医院儿内科卫辉453100;新乡医学院病理学教研室新乡453003;新乡医学院病理学教研室新乡453003;新乡医学院病理学教研室新乡453003;新乡医学院病理学教研室新乡453003;新乡医学院第一附属医院儿内科卫辉453100;新乡医学院第一附属医院儿内科卫辉453100【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.靶向沉默大鼠星形胶质细胞VEGF表达siRNA的筛选 [J], 邓志宽;吴静;程赛宇;赵士福;李黔宁2.STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞的沉默作用 [J], 王朝阳;崔春晖;姚晓军;黄宗海3.转化生长因子β1短发夹RNA对白蛋白致人肾小管上皮细胞细胞因子过表达的抑制作用 [J], 段绍斌;刘伏友;陈愔音;刘芳;李莹;凌光辉;肖力;刘虹;彭佑铭4.慢病毒载体靶向沉默原代大鼠海马神经元黏着斑激酶表达siRNA的筛选 [J], 张金平;唐荣华;吴军;刘红星;焦莉;许峰;康慧聪;朱遂强;薛峥5.靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选 [J], 曲华伟;张阳德;陈玉祥;何剪太因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
脂质体介导TGF-β1 shRNA转染的方法
脂质体介导TGF-β1 shRNA转染的方法王守立;姚辉华;董亮;邓敏;顾永平;孙茂民【期刊名称】《苏州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2008(028)002【摘要】目的探讨脂质体介导的转化生长因子β1(TCF-β1)短发夹RNA(shRNA)在人肿瘤细胞株的转入效率,为研究TGF-β1信号转导在肿瘤微环境中的作用机制提供方法依据.方法化学合成TGF-β1小干扰RNA(siRNA),与脂质体转染介质混合制备转染复合物(Lip-shRNA),处理细胞24h后用流式细胞术(FCM)及人工计数法测定RD细胞的转入率;免疫荧光技术检测细胞TGF-β1蛋白表达水平.结果荧光显微镜观察硫代磷酸化修饰的寡核苷酸转入4h后,shRNA主要定位在细胞浆,8h后细胞核中有较多的shRNA;FCM测得转入细胞转入率与Lip-shRNA复合物呈剂量依赖关系,人工测得shRNA的转入率与转入复合物在低剂量呈剂量依赖关系,但在高剂量时增高不明显.转人6d后各组细胞TGF-β1蛋白表达量较转入3d时明显减少,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论脂质体介导的TGF-β1shRNA 在常见肿瘤细胞株中的转入效率与寡核苷酸的稳定性、Lip-shRNA复合物剂量、转入时间密切相关,该转染技术可以作为RNA干扰手段研究TGF-β1信号转导的病理学机制.【总页数】5页(P222-225,封2)【作者】王守立;姚辉华;董亮;邓敏;顾永平;孙茂民【作者单位】苏州大学医学部病理学教研室,江苏,苏州,215123;苏州大学附属第二医院,普外科,江苏,苏州,215004;苏州大学医学部病理学教研室,江苏,苏州,215123;苏州大学医学部病理学教研室,江苏,苏州,215123;苏州大学医学部病理学教研室,江苏,苏州,215123;苏州大学医学部人体解剖学教研室,江苏,苏州,215123【正文语种】中文【中图分类】R730.264【相关文献】1.低频超声联合微泡增强脂质体介导Rac1-shRNA质粒转染前列腺癌细胞及对其生物学行为的影响 [J], 林艳端;胡兵;申锷2.脂质体介导TGF-β1质粒DNA转染家兔角膜上皮细胞的实验研究 [J], 黄琼;胡燕华;姜发纲;陈宏3.脂质体介导转染N2a细胞的优化方法 [J], 赵云鹤;王若楠;杨桂姣;陆利;4.脂质体介导转染犬肾上皮细胞的方法改进与优化 [J], 柴百惠;绳秀珍;唐小千;邢婧;战文斌5.脂质体介导TGF-β_1质粒DNA转染家兔角膜上皮细胞的实验研究 [J], 黄琼;胡燕华;姜发纲;陈宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
质粒介导的RNAi沉默 mdr1基因增强白血病耐药细胞HT9对姜黄素的敏感性
质粒介导的RNAi沉默 mdr1基因增强白血病耐药细胞HT9对姜黄素的敏感性李旭艳;邵淑丽;张伟伟;恽东泽;付博;张珍珠【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2014(000)001【摘要】通过pSilencer 2．1质粒介导的RNAi技术沉默急性早幼粒白血病耐药HT9细胞的耐药基因mdr1表达，可提高耐药细胞对姜黄素的敏感性。
通过设计合成靶向mdr1基因的shRNA干扰片段，定向克隆到pSilencer 2．1-U6 neo质粒中，成功构建沉默mdr1基因特异表达的shRNA表达载体，电转染HT9细胞后筛选阳性克隆扩大培养。
采用实时荧光定量PCR、Western blot检测细胞mdr1基因表达情况，流式细胞术检测P-糖蛋白外排泵功能，MTT法和流式细胞技术检测细胞对药物敏感性和细胞周期分布。
结果显示，构建的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1转染HT9细胞后，HT9/pU6/shRNA细胞mdr1 mRNA表达降低了78．84％（P＜0．01），P-糖蛋白的表达量降低了48．27％（P＜0．05），细胞内Rho123相对荧光强度由10．8％±0.58％升高至73．56％±1．37％；转染细胞对姜黄素敏感性明显增强，IC50由（24．10±0．83）μmol/L降至（5．10±0.14）μmol/L；耐药相对逆转率为84．74％±1．86％，与HT9细胞相比，经姜黄素处理的稳定转染细胞HT9/pU6/shRNA细胞周期阻滞在S、G2/M期。
说明质粒介导的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1能够稳定、持久地抑制mdr1基因表达，能有效增强HT9细胞对姜黄素的敏感性。
【总页数】4页(P22-25)【作者】李旭艳;邵淑丽;张伟伟;恽东泽;付博;张珍珠【作者单位】齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔 161006【正文语种】中文【中图分类】R961【相关文献】1.MDR1基因沉默增强三尖杉酯碱诱导的HT9细胞凋亡 [J], 张伟伟;邵淑丽;张珍珠;付博2.α-干扰素增强耐药性白血病K562/ADM细胞及其白血病干细胞对阿霉素的敏感性 [J], 高丽丽;易娟;陈静;魏虎来3.siRNA介导的LPXN沉默可抑制SHI-1细胞增殖及增强SHI-1细胞药物的敏感性 [J], 朱国华;戴海萍;段元勋;余泽霖4.shRNA介导的RNAi载体构建及对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制 [J], 秦维超;张有顺;周新;胡礼仪5.肿瘤细胞特异启动子hTERT介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR的研究 [J], 林燕真;程通;张雅丽;李瑞银;杨连威;温兰玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
脂质体介导转化生长因子-β1治疗缺血性脑损伤的实验研究
脂质体介导转化生长因子-β1治疗缺血性脑损伤的实验研究刘相名;郑华光;张忠;万伟庆;张岩;赵继宗【期刊名称】《中国卒中杂志》【年(卷),期】2010(005)008【摘要】目的在缺血性脑损伤发生后,用脂质体介导外源性基因转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对其进行治疗,并对其作用机制进行初步研究.方法将大鼠一侧大脑中动脉栓塞1h以制作局灶性脑缺血模型,随机分为治疗组和对照组各18只.将含报告基因LacZ的质粒和脂质体的复合体注入对照组大鼠的脑脊液中,治疗组注射含TGF-β1的质粒和脂质体的复合体.5d后做行为试验,取动物脑组织,通过免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western blot等方法来鉴定外源基因是否表达;检测脑梗死体积和凋亡细胞数;用半定量RT-PCR比较治疗组和对照组缺血脑组织中caspase-3表达的差异.结果由脂质体介导的LacZ基因和TGF-β1基因均在缺血脑组织中表达;和对照组相比,治疗组动物的神经功能有明显改善(P<0.01);治疗组的脑梗死体积和凋亡阳性细胞数均显著小于对照组(P<0.01);治疗组缺血脑组织中caspase-3 mRNA的表达显著低于对照组.结论缺血性脑损伤发生后,脂质体介导的外源基因可在缺血脑组织中有效表达.脂质体介导TGF-β1对缺血性脑损伤具有明显的治疗作用,其作用机制可能是通过抑制caspase-3的活性而减少神经细胞的凋亡,从而改善由缺血性损伤而致的神经功能障碍.【总页数】7页(P639-645)【作者】刘相名;郑华光;张忠;万伟庆;张岩;赵继宗【作者单位】100050,北京市,首都医科大学附属天坛医院神经外科;首都医科大学附属天坛医院神经内科;100050,北京市,首都医科大学附属天坛医院神经外科;100050,北京市,首都医科大学附属天坛医院神经外科;100050,北京市,首都医科大学附属天坛医院神经外科;100050,北京市,首都医科大学附属天坛医院神经外科【正文语种】中文【相关文献】1.缺血性脑损伤后大鼠脑中脂质体介导外源基因的表达 [J], 刘相名;惠国桢;苗宏生;孙兵;栗超跃;杨立业;郭礼和2.纳米脂质体介导p53治疗鼻咽癌的实验研究 [J], 刘海;秦学玲;鲜均明;周光耀;梁传余3.经导管动脉注入脂质体介导的p53基因治疗肝癌的实验研究 [J], 朱光宇;李国昭;卢勤;滕皋军;魏晓莹;郭金和;余辉;邓钢;何仕诚;方文4.脂质体介导外源性基因TGF-β1治疗缺血性脑损伤的临床效果观察 [J], 樊友道;周金菊5.脂质体介导转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化 [J], 郭常安;阎作勤;姚振均;霍建中;陈峥嵘因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
慢病毒介导的靶向沉默胰岛素样生长因子1型受体的siRNA对人子宫内膜癌细胞迁移和侵袭能力的影响
慢病毒介导的靶向沉默胰岛素样生长因子1型受体的siRNA 对人子宫内膜癌细胞迁移和侵袭能力的影响万璟n;李小毛;舒珊荣;张宇【摘要】AIM: To invesligale the down — regulation of insulin — like growth factor Lgpe 1 receplor(IGF — 1R) on the migration and invasion abilities of human endomelrial cancer cell HEC — 1B. METHODS; The siRNAs Large-Ling IGF — 1R gene were synLhesized, cloned inLo a lenLivirus expression vecLor and LransfecLed inLo endomeLrial cancer HECrn— 1B cells (HEC — 1B — KD group) . The conLrol cells ( wiLhouL virus LransfecLion, HEC — 1B — CON group) and negaLive virus LransfecLion conLrol cells ( HEC — 1B — NC group) were also seL up. The gene silencing effecL of siRNA LargeLing IGFrn— 1R was deLermined by real — Lime PCR and WesLern bloLLing aL mRNA and proLeinlevels,respeclively. The proliferaLion rate was deLecLed by colony formaLion assay. The cell migraLion and invasion abiliLies were deLermined by Transwell experi-menL. The mRNA levels of maLrix metalloproLeinase ( MMP) — 2 and MMP — 9 were measured by real —Lime PCR. RESULTS; The mRNA and protein levels of IGF — 1R in HEC —1B — KD cells were significanLly reduced by 81% and 91.5% , respectively (P<0. 05). In anchorage — dependenL growLh by colony formaLion assay, HEC — 1B — KD cells showed much less colonies Lhan HEC — 1B — CON cells and HEC — 1B — NC cells. Compared wiLh Lhe conLrol cells, knockdown of IGF — 1R in HEC — 1B cells resulted in significanL reductionof cell moLiliLy. Down — regulaLion of IGF — 1R in HECrn— 1B cells also significanLly reduced Lhe invasion poLenLial ( P < 0. 05 ) . Down —regulaLion of IGF — 1R subsLanLially reduced the expression of MMP -2 and MMP -9 compared wiLh Lhe conLrol cells. CONCLUSION; Knockdown of IGF - 1R reduces Lhe migraLion and invasion abiliLies of human endomelrial cancer cells in vitro accompanied wiLh a decrease in MMPrn—2 and MMP - 9 expression.%目的:探讨慢病毒介导的靶向沉默胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)的siRNA对人子宫内膜癌细胞迁移和侵袭功能的影响和可能机制.方法:针对IGF-1R基因设计siRNA,筛选出最有效的siRNA进行慢病毒包装扩增.转染人子宫内膜癌HEC-1B细胞后分别用real-time PCR和Western blotting 方法验证其沉默效率,平板克隆法检测其克隆形成情况,Transwell小室方法检测细胞迁移和侵袭情况,real-time PCR检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9 mRNA水平的变化.结果:筛选有效siRNA转染子宫内膜癌HEC-1B细胞后,IGF-1R 的mRNA水平下降81%,蛋白表达水平下降91.5%.沉默IGF-1R 基因后,HEC-1B 细胞克隆形成能力下降,迁移和侵袭能力下降,与对照组和转染阴性组相比有显著差异(P<0.05);MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平下降(P<0.05).结论:在人子宫内膜癌HEC-1B细胞中下调IGF-1R水平能降低MMP-2和MMP-9 mRNA表达,抑制细胞迁移和侵袭能力.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)008【总页数】6页(P1352-1357)【关键词】子宫内膜肿瘤;胰岛素样生长因子1型受体;迁移;侵袭【作者】万璟n;李小毛;舒珊荣;张宇【作者单位】中山大学附属第三医院妇科,广东,广州,510630;中山大学附属第三医院妇科,广东,广州,510630;广州华侨医院妇产科,广东,广州,510632;中山大学附属第三医院妇科,广东,广州,510630【正文语种】中文【中图分类】R363子宫内膜癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，近年来国内外发病率均有上升趋势。
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脂质体RNAiMAX介导siRNA转染沉默胰岛素瘤NIT-1细胞血管紧张素Ⅱ1型受体基因的实验研究
莫丽雯;卢德成;李海滨
【摘要】目的:探讨脂质体RNAiMAX能否介导小干扰RNA(siRNA)转染入胰岛素瘤NIT-1细胞并实现血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)的基因沉默,同时评价其细胞毒性.方法:针对AT1R,设计合成3对siRNA序列,转染NIT-1细胞,荧光显微镜下观察RNAiMAX能否介导荧光分子Cy3标记的siRNA转入细胞内,以及不同siRNA浓度对转染效率的影响;Real-time PCR检测AT1R mRNA的相对表达量,计算基因沉默效率并探讨不同干扰序列及干扰时间对其影响;流式细胞仪检测si-AT1R组、脂质体组和空白组的凋亡率.结果:荧光显微镜观察发现,在一定范围内,5个浓度siRNA 转染时,细胞荧光强度均达90％以上,以40 nmol/L的荧光强度最高;AT1R的3对序列(si-AT1R-1、si AT1R-2、si AT1R-3)转染24 h沉默效率分别为86.07％、92.20％、74.67％,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),以si-AT1R-2的沉默效率最高,检测其24 h、48 h、72h的沉默效率,显示24 h的沉默效率最高;各组细胞凋亡率比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论:脂质体RNAiMAX可以介导siRNA转入NIT-1细胞中并实现AT1R基因的沉默,40 nmol/L si-AT1R-2转染24 h可达到理想的沉默效果;此方法对细胞基本无毒性作用.
【期刊名称】《广西医科大学学报》
【年(卷),期】2016(033)005
【总页数】4页(P770-773)
【关键词】NIT-1细胞;RNA干扰;血管紧张素Ⅱ 1型受体;基因沉默
【作者】莫丽雯;卢德成;李海滨
【作者单位】广西医科大学第一附属医院内分泌科南宁 530021;广西医科大学第
一附属医院内分泌科南宁 530021;中国人民解放军第303医院南宁 530021
【正文语种】中文
【中图分类】R587.1
根据国际糖尿病联盟(IDF)与中华医学会糖尿病学分会发布的资料，截至2013年，全球糖尿病患者人数已达3.82亿，预计到2035年这个数据会增加到5.92亿[1]，糖尿病作为慢性疾病严重影响人类的健康，因此对糖尿病的防治显得至关重要。
大量研究表明，胰岛β细胞异常可能是糖尿病发生发展的中心环节[2]，新诊断的2
型糖尿病患者胰岛β细胞功能只有正常人的50%，其后β细胞功能以每年4%～5%的速度下降[3]。
因此，探讨胰岛β细胞损伤的机制及保护策略一直是糖尿病领域
研究的热点和难点。
循证医学证实使用肾素—血管紧张素系统(RAS)阻断剂可以降低新发2型糖尿病的风险[4]，但具体机制目前仍不明确。
本课题组前期研究证实
在体内外高糖、非高糖环境下诱导胰岛细胞凋亡，可激活胰岛局部RAS，上调血
管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)的表达，此作用可被AT1R阻滞剂(ARB)阻断，从而减少胰岛细胞凋亡率。
因此，研究AT1R 在保护胰岛β细胞功能中的作用需要一种
有效抑制AT1R基因表达的方法。
利用阳离子脂质体RNAiMAX转染siRNA沉默靶基因是目前广泛应用的分子生物学手段，其细胞毒性低、稳定性好，比传统的脂质体 Lipo2000具有更显著的基因沉默效果[5]。
因此，本文选择RNAiMAX 进行
胰岛素瘤NIT-1细胞 si-AT1R转染，并观察不同转染条件对转染效率和AT1R基
因沉默效果的影响，为进一步探讨ARB类药物对胰岛β细胞保护机制提供实验基础。
研究发现胰岛局部存在独立的RAS，肾素、血管紧张素原、血管紧张素I、血管紧张素转化酶、血管紧张素Ⅱ和血管紧张素受体均在小鼠胰岛β细胞中表达[6]。
研
究证实糖尿病小鼠胰岛细胞AT1R表达水平明显升高，胰岛β细胞AT1R表达对
胰岛功能可能有重要影响[7～9]。
因此，本课题组需要寻求一种RNA干扰(RNAi)技术抑制离体胰岛β细胞AT1R表达，为后续研究建立一个可靠的模型。
RNAi能够通过双链RNA诱发基因沉默，是抑制基因表达的有力工具[10]，并有望成为治
疗疾病的实用手段[11～13]。
脂质体RNAiMAX是一种专用于转染siRNA的阳离子脂质体转染试剂，与传统的Lipo2000比具有低细胞毒性，更高的转染效率和更显著的基因沉默效果[6]。
因此，本组选择它进行转染，并观察不同转染条件对于转染效率和沉默效率的影响。
在保证转染时间和转染试剂充足的情况下，转染效率主要与siRNA的量有关，经过查
阅大量文献，参考试剂说明书，本组观察了5个浓度siRNA转染 24 h后各转染
组的转染效率。
另外，siRNA转染入细胞内后，会被细胞内的RNA酶降解，所以siRNA发挥基因沉默效应与转染时间有关，因此我们观察了达到最高转染效率的
浓度的siRNA分别转染24 h、48 h、72 h后各转染组细胞的AT1R基因沉默效果。
本实验结果显示，RNAiMAX介导的转染无明显的细胞毒性作用，各转染组在转
染24 h时均有较多的siRNA转染入细胞内，40 nmol/L的siRNA浓度可达到较
高的转染效率；各转染组在转染后24 h即表现为显著的AT1R mRNA水平抑制
现象，而这种抑制作用至少可以持续到72 h，40 nmol/L si-AT1R-2转染NIT-1
细胞在24 h可达到最佳基因沉默效率(92.20%)。
综上，本研究利用RNAiMAX转染试剂，观察了不同条件下siRNA转染入小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞的转染效率及AT1R基因的沉默效率，明确了脂质体
RNAiMAX可以介导siRNA转染入小鼠胰岛素瘤NIT-1细胞中并实现AT1R基因的沉默，为进一步探讨ARB类药物对胰岛β细胞保护机制提供实验依据。