脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞：筛选理想浓度
siRNA转染的方法
siRNA转染的方法A．siRNA转染的方法哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面：转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时的细胞密度、转染时的操作顺序、细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间B．Lipofectamin2000 转染试剂选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。
Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作，可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染，也可应用于DNA/siRNA的共转染操作；是一种新型的高效siRNA转染试剂。
Lipofectamin2000的应用领域：1、原代培养细胞和转化细胞株的基因转染2、siRNA高通量转染试验3、DNA转染；DNA和siRNA的共转染4、核酸（siRNA、DNA、RNA）的体内导入试验5、贴壁细胞和悬浮细胞转染Lipofectamin2000 的特点：1、不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作2、在含血清培养基中也能表现高转染效率3、细胞毒性低；适用细胞广泛4、即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染5、基于脂质的转染试剂，确保没有RNAse活性6、可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入C. Lipofectamin2000适用的细胞类型Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如：HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。
阳离子脂质体递送STAT3 siRNA抑制黑色素肿瘤细胞探究
阳离子脂质体递送STAT3 siRNA抑制黑色素肿瘤细胞探究邹瑞;彭正松【摘要】利用阳离子脂质体作为载体,用其搭载鱼精蛋白与STAT3 siRNA复合物,通过一系列实验证实该复合体系可显著抑制STAT3基因在黑色素瘤细胞B16中的表达,促进肿瘤细胞的凋亡.首先对载体材料进行了一系列表征测定,检测了不同复合比例下载体和siRNA复合物的粒径和电位.利用载体和siRNA的复合物对B16细胞进行转染并测定转染效率,随后对复合材料的毒性进行了检测.此外还进行了细胞凋亡、平板克隆、荧光定量PCR以及Western Blot等一系列实验来进一步确定载体复合物的有效性.实验结果表明,阳离子脂质体搭载复合了鱼精蛋白的STAT3siRNA表现出了良好的靶向治疗性及优秀的递送效率,且复合体系稳定性良好,毒性低.【期刊名称】《西昌学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(033)001【总页数】6页(P28-33)【关键词】阳离子脂质体;鱼精蛋白;siRNA;STAT3【作者】邹瑞;彭正松【作者单位】西华师范大学生命科学学院,四川南充 637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充 637009;西昌学院农业科学学院,四川西昌 615000【正文语种】中文【中图分类】R739.51998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire A 等首次在秀丽隐杆线虫（C.elegans）发现了一个双链RNA能够沉默蠕形秀丽隐杆线虫基因表达，并证明上述现象属于转录后水平的基因沉默[1]，这一现象正式被称为 RNA 干扰（RNAi）。
从 1999年人们发现RNAi 现象[2]的存在到 2001年，RNAi 技术正式应用于哺乳动物细胞基因功能的研究中[3]，短短几年内，RNAi技术得到了飞速发展。
毫无疑问，若RNAi技术能有效应用于临床，这将是基因治疗领域的一大突破。
RNAi 能够抵抗转基因或外源性病毒的侵犯。
在体外设计与靶基因mRNA 同源互补的双链RNA后，将这段双链RNA 导入目的细胞，其能够通过同源互补，从而靶向性地降解该mRNA，达到靶基因沉默的效果。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤脂质体转染是一种常用的基因传递技术，用于将外源的核酸（例如DNA、RNA）转入细胞内。
脂质体是由人工合成的类似于细胞膜的双层脂质膜组成，具有较好的生物相容性和可降解性，因此可以用来包裹并传递外源核酸进入目标细胞内。
本文将详细介绍脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体由两个疏水性脂质尾部和一个亲水性脂质头部组成，形成类似生物细胞膜的双层结构。
这种双层结构使得脂质体可以包裹水溶性的外源核酸，并形成脂质体-核酸复合物。
当复合物与细胞膜接触时，由于脂质体的类似性，这些复合物可以与细胞膜融合，并释放外源核酸进入细胞。
然而，简单地将脂质体-核酸复合物添加到细胞培养基中并不能有效地将外源核酸转入细胞内。
为了提高转染效率，常常需要使用电穿孔或钙磷共沉淀等方法，以增加细胞膜的通透性。
操作步骤：1.准备工作：-完整的脂质体转染试剂盒。
-DNA或RNA溶液。
-靶细胞。
-无菌操作条件下的实验室。
2.重组脂质体的合成：-按照试剂盒说明将脂质体复合物合成。
-使用无菌的工具和试剂。
3.核酸引物的制备：-将外源DNA或RNA与引物混合，使其形成核酸复合物。
4.细胞处理：-将培养皿中的细胞进行冲洗，去除培养基。
-将适量的细胞培养基添加到培养皿中，以保证细胞的正常生长。
5.导入核酸：-将所制备的核酸复合物滴加到细胞培养基中。
-将细胞培养皿置于无菌环境中，以便细胞吸收和利用核酸。
6.细胞培养：-按照细胞类型和所使用的培养基，将细胞置于恰当的培养条件下，并进行培养。
-根据需求添加所需要的生长因子和抗生素。
7.观察和分析：-在一定的培养时间后，观察细胞是否发生了显著的变化。
- 使用适当的实验方法（如PCR、Western blot等）检测外源基因的表达。
-观察并记录实验结果。
以上是脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体转染是目前常用的基因传递技术之一，可以用于研究基因功能、疾病治疗等领域。
随着技术的不断发展，转染效率和特异性将逐渐提高，为研究和治疗带来更多的机会和挑战。
【2017年整理】体内实验研究的常见问题及解答
体内实验研究的常见问题及解答问：进行体内研究前需要注意什么？答：为体内研究设计的实验需要考虑：动物模型的选择、给药途径、剂量以及重复给药的频率。
选择siRNA 的用量和浓度时应该考虑以下因素：靶器官的特性和研究物的大小。
问：进行小鼠的体内研究需要多少量的siRNA？答：siRNA体内研究领域相对较新，很少有已经确定的实验程序，因而很难确切地说实验需要多少量的siRNA。
我们推荐您通过文献检索参考其他类似的体内研究需要的siRNA的量。
小鼠全身给药需要100uL 浓度为10－500uM的siRNA。
有研究表明在大剂量给药时，一些毒性在20 mg/kg/day (416 mM)以上才能观测到。
问：锐博合成的siRNA能用于体内研究吗？答：我们已经对合成的siRNA进行处理，使其能应用于动物研究。
问：在体内研究中，最好的给药途径是什么？答：寡核苷酸可以通过大剂量给药或使用ALZET微小泵持续给药。
大剂量给药时要慎重，因为已有研究表明：一些毒性与寡核苷酸反义链的浓度有关，快速给药时可能会导致动物下肢瘫痪或致死，所以给药时要注意观察。
很多已发表的论文实验是通过尾静脉给药的。
任何给药方式都需要优化，以确保最佳的导入方式和动物的健康。
剂量/浓度计算的常见问题及解答问：定量RNA的公式是什么？答：研究者可以用Beer法则定量RNA：吸光度（260nm）=(摩尔消光系数)*(浓度)*(路径长度,cm)。
为了便于理解，等式变为：浓度＝（吸光度,260nm）/[(摩尔消光系数)*(路径长度,cm)]。
当使用一个标准的10mm 比色皿时，在公式中路径长度这个变量等于1。
问：我需要浓度为20uM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？答：锐博为您提供的siRNA是nmol数量级的冻干粉。
样品浓度的计算如下：（siRNA的量，nmol）/（重悬体积，uL）＝样品浓度，umol/L。
在解答前应先统一单位，确保单位可以抵消。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种:1。
磷酸钙共沉淀将氯化钙,RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量,因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子.将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平(50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染.4。
机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪(biolistic particl e）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5。
阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体.这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同.使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA—阳离子脂质体复合物。
内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用
内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用夏珍;李菊香;丁浩;孙国芳;洪葵;吴延庆;程晓曙【摘要】目的:探讨内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用.方法:在体外原代培养出生1～3 d大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定.设计并化学合成3对靶向bim的siRNA,用脂质体法将siRNA转染心肌细胞,筛选沉默效率最高的siRNA.实验分组:(1)空白对照组;(2)缺氧组;(3)缺氧+脂质体组;(4)缺氧+阴性对照siRNA组;(5)缺氧+Bim-siRNA组.MTT法观察细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞内钙离子浓度变化情况;Western blotting检测内质网应激标志分子caspase-12和三磷酸肌醇(IP3)的表达情况.结果:免疫组化鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功.在荧光显微镜下,转染了阴性对照siRNA组的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;Western blotting 结果显示,Bim-siRNA转染均能有效降低Bim蛋白的表达,其中第2对沉默效率最高,达到86.73%.缺氧损伤导致心肌细胞活性明显下降(P<0.05),转染Bim-siRNA后细胞活性较阴性对照组升高.缺氧细胞凋亡率较对照组明显增加(P<0.01),细胞内钙离子浓度明显增高,而沉默bim 的表达能降低细胞凋亡率和细胞内钙离子浓度.缺氧导致内质网应激标志分子caspase-12和IP3表达较空白对照组明显上调(均P<0.05),而抑制Bim表达后caspase-12和IP3表达明显降低.结论:沉默bim的表达能有效抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的作用,内质网应激标志分子caspase-12和IP3可能参与了Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡的过程.这有望为临床心肌缺血缺氧损伤的治疗提供新思路.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2013(029)012【总页数】7页(P2121-2127)【关键词】Bim蛋白;siRNA;内质网应激;缺氧;细胞凋亡【作者】夏珍;李菊香;丁浩;孙国芳;洪葵;吴延庆;程晓曙【作者单位】南昌大学第二附属医院心内科,江西省分子医学重点实验室,江西,南昌,330006;南昌大学第二附属医院心内科,江西省分子医学重点实验室,江西,南昌,330006;南昌大学第二附属医院心内科,江西省分子医学重点实验室,江西,南昌,330006;南昌大学第二附属医院心内科,江西省分子医学重点实验室,江西,南昌,330006;南昌大学第二附属医院心内科,江西省分子医学重点实验室,江西,南昌,330006;南昌大学第二附属医院心内科,江西省分子医学重点实验室,江西,南昌,330006;南昌大学第二附属医院心内科,江西省分子医学重点实验室,江西,南昌,330006【正文语种】中文【中图分类】R363唯BH3蛋白Bim(Bcl-2-interacting mediator of cell death)是Bcl-2家族中BH3-only亚家族的成员，仅有1个BH3同源结构域，是一种重要的凋亡调节蛋白。
PGC-1α通过上调SIRT3表达发挥心肌保护作用
PGC-1α通过上调SIRT3表达发挥心肌保护作用游嘉;岳中宝;陈少锐;李卓明;刘培庆【摘要】[目的]探讨第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶成员3(SIRT3)在过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(PGC-1α)的调控下发挥改善心肌肥大和心肌能量代谢的作用.[方法]建立血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心肌肥大模型;利用质粒转染诱导PGC-1α基因过表达、siRNA干扰敲低SIRT3表达;Western blot检测PGC-1α、SIRT3及心肌肥大标志蛋白肌球蛋白重链β(β-MHC)的水平.TMRE染色法测定线粒体膜电位;测定ATP含量;DHE染色法测定活性氧水平;qRT-PCR法检测线粒体编码基因、能量代谢相关基因的表达水平.[结果]过表达PGC-1α能够显著提高SIRT3的蛋白表达水平和酶活性(P＜0.05).过表达PGC-1α抑制Ang Ⅱ诱导的β-MHC上调(P＜0.05),增加ATP水平(P＜0.05),促进线粒体编码基因的转录水平(P ＜0.05),降低细胞内活性氧(P＜0.05),上调脂肪酸氧化磷酸化代谢相关基因的表达(P＜ 0.05).SIRT3干扰可逆转PGC-1α的心肌保护作用(P＜0.05).[结论]PGC-1α通过上调SIRT3发挥调控心肌肥大、线粒体功能、活性氧清除、能量代谢等方面的作用.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2016(037)003【总页数】8页(P343-350)【关键词】PGC-1α;SIRT3;心肌肥大;能量代谢;活性氧;线粒体功能【作者】游嘉;岳中宝;陈少锐;李卓明;刘培庆【作者单位】中山大学药学院药理毒理实验室//新药成药性评估与评价国家地方联合工程实验室,广东广州510006;中山大学药学院药理毒理实验室//新药成药性评估与评价国家地方联合工程实验室,广东广州510006;中山大学药学院药理毒理实验室//新药成药性评估与评价国家地方联合工程实验室,广东广州510006;中山大学药学院药理毒理实验室//新药成药性评估与评价国家地方联合工程实验室,广东广州510006;中山大学药学院药理毒理实验室//新药成药性评估与评价国家地方联合工程实验室,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】R966心脏作为高耗能器官，其正常功能的维持依赖于心肌细胞对能量底物的合理利用以及通过线粒体氧化磷酸化途径合成ATP的能力。
筛选介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的最佳试剂
筛选介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的最佳试剂王玉洁;吴韶菊;吴芹【摘要】背景:理想的细胞转染试剂应具有高效安全的特点.目的:筛选能够高效介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的最佳转染试剂.方法:应用Lipofectamine RNAiMAX,Lipofectamine 2000和DharmaFECT1转染试剂介导FAM-siRNA和多药耐药基因MDR1siRNA转染原代肝癌细胞,分别于转染6和48 h后应用流式细胞仪和实时荧光定量PCR检测转染效率,然后用MTT法检测3种转染试剂处理原代肝癌细胞24 h后的细胞毒性.结果与结论:对于Lipofectamine RNAiMAX,Lipofectamine 2000和DharmaFECT1转染试剂介导的FAM-siRNA 和MDR1siRNA转染,流式细胞仪和实时荧光定量PCR仪检测出RNAiMAX转染效率最高(P < 0.05),分别为70.3%和71.5%.MTT法检测结果表明RNAiMAX对原代肝癌细胞没有表现出细胞毒性.结果提示,由于RNAiMAX介导的FAM-siRNA 和MDR1 siRNA转染的效率最高,并且对细胞的毒性最小,所以RNAiMAX是最适合介导化学合成siRNA转染原代肝癌细胞的转染试剂.%BACKGROUND: The ideal transfection agent should efficient and low-toxic.OBJECTIVE: To screen transfection agent which efficiently transfect chemosynthesis siRNA to primary liver cancer cells.METHODS: FAM-siRNA and MDR1 siRNA was transfected to primary liver cancer cells by LipofectamineRNAiMAX,Lipofectamine 2000 and DharmaFECT1. The transfection efficiency was evaluated by flow cytometer and real time-PCR at 6 and 48 hours after transfection. Moreover, the cytotoxicity of transfection agents in primary liver cancer cells was tested by MTT method.RESULTS AND CONCLUSIONS: The results of flow cytometer and real time-PCR indicatedthat, the transfection efficiency of siRNA tranfection to primary liver cancer cells mediated by RNAiMAX was highest (P ＜ 0.05), which was 70.3％ and 71.5%,respectively. The cytotoxicity of RNAiMAX in primary liver cancer cells did not show in MTT detection (P ＜ 0.05). RNAiMAX was suitable to transfect siRNA to primary liver cancer cells because the efficiency of siRNA tranfection to primary liver cancer cells mediated by RNAiMAX was the highest and the cytotoxicity of RNAiMAX in primary liver cancer cells was the lowest.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)002【总页数】4页(P245-248)【关键词】原代肝癌细胞;siRNA;转染;Lipofectamine RNAiMAX;Lipofectamine 2000;DharmaFECT1;组织工程【作者】王玉洁;吴韶菊;吴芹【作者单位】临沂师范学院生命科学学院,山东省临沂市,276005;临沂师范学院生命科学学院,山东省临沂市,276005;临沂市第四人民医院精神科,山东省临沂市,276005【正文语种】中文【中图分类】R3180 引言RNA干扰(siRNA)是含19～21个核苷酸的小分子RNA片段，介导双链RNA进入细胞内，特异性识别并降解其同源基因，达到诱导靶基因表达抑制或沉默，并且siRNA成为研究基因在肝癌发生和发展中功能的重要工具[1-2]。
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