葡萄酵素在天然发酵过程中体外抗氧化性能的变化_蒋增良

本 研 究 采 用 Folin-Ciocalteau 法 测 定 总 酚 含 量， 该反应是在恒温下伴随有磷钨酸和磷钼酸参 与的复杂还原反应。 吸光度越高，总酚含量越高。 发酵过程中葡萄酵素总酚含量变化结果如图 2 所示。
由图 2 可知，随着发酵时间的延长，葡萄酵素 发酵液中总酚含量呈逐渐上升趋势，发酵 56 d 总 酚含量由发酵前的 1.460 mg/mL 增加到 1.739 mg/ mL。 发 酵 56 d 后 比 未 发 酵 时 增 加 了 19.1%，Chu 等 [16] 的 研 究 表 明 ， 总 酚 含 量 的 增 加 与 微 生 物 把 复杂的大分子酚类物质转化成小分子酚类物质 有关。
7.4 配制），1 mL 936 μmol/L NADH （用 0.1 mol/L
的 PBS，pH 7.4 配制）和 1 mL 300 μmol/L NBT（用
0.1 mol/L 的 PBS，pH 7.4 配制）。 在环境温度下，反
应 5 min。 以去离子水为参比溶液。 在 560 nm 波长
处测定吸光度。
单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司；立
式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 葡萄酵素的制备 用无菌水在无菌条件下
轻轻冲洗除去葡萄表面沙子和灰尘， 在无菌操作
台中自然晾干。 红糖用紫外杀菌 45 min。 葡萄与红
糖按质量比 1∶1 加入到已灭菌的玻璃瓶中，封口，
放在暗处，常温下发酵 56 d。 为了避免潜在的菌体
微生物酵素是以 1 种或多种新鲜蔬菜、 水果 等为原料，经多种有益菌发酵而产生的，含有丰富 的维生素、酶、矿物质和次生代谢产物等营养成分 的功能性微生物发酵产品，具有抗衰老，抗菌，消 炎，净化血液，增强机体免疫能力等多种保健功 能[7]。 微生物酵素呈现出来的抗氧化性能部分可能 来自发酵过程，机理尚不清楚，目前对其抗氧化性 的研究还较少， 阐明微生物酵素发酵过程中抗氧
葡萄酵素在发酵过程中还原力的变化如图 4 所示。 葡萄酵素的还原力在发酵过程中一直呈上 升趋势， 说明葡萄酵素在发酵过程中抗氧化成分 在 不 断 增 加 。 在 第 56 天 后 ， 还 原 力 达 到 0.367， 与未发酵之前相比，提高了 17.2%。
517 nm 波长处测定吸光度。
DPPH 自由基清除能力 （%）=[（A0-（A1-A2））/
A0]×100
（1）
式中，A0— ——空白对照液的吸光 度 ；A1— ——样
品测定管的吸光度；A2— ——样品本底管的吸光度。
1.2.4 还 原 力 测 定[10] 30 μL 样 品 加 入 到 2.5 mL
2 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 310058 3 浙江理工大学理学院 杭州 310018
4 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室 杭州 310023 5 浙江树人大学生物与环境工程学院 杭州 310015）
摘要 研究葡萄酵素在天然发酵过程中体外抗氧化能力的变化。 以还原力、DPPH 自由基清除能力、超氧自由基 清除能力、 羟基自由基清除能力和 ABTS 自由基清除能力为指标， 多体系地考察发酵过程中抗氧化性能的变 化，并进行相关性分析。 试验结果表明，发酵过程中总酚含量从 1.460 mg/mL 升高到 1.739 mg/mL，发酵前、后增 加 了 19.1%，还 原 力 、DPPH 自 由 基 清 除 能 力 、羟 基 自 由 基 清 除 能 力 和 ABTS 自 由 基 清 除 能 力 呈 逐 渐 上 升 趋 势 ， 发酵前、后分别提高了 17.2%，12.5%，7.0%和 17.2%，超氧自由基清除能力呈先升高后略微降低再升高的 趋 势 ， 发酵前、后提高了 12.8%；还原力、DPPH 自由基清除能力、超氧 自 由 基 清 除 能 力 、羟 基 自 由 基 清 除 能 力 和 ABTS 自由基清除能力与总酚含量均具有显著的正相关性，相关系数分别为 0.959，0.869，0.926，0，920，0.953，P＜0.01。 葡萄酵素在发酵过程中展现良好的抗氧化性能，抗氧化性能总体呈现上升趋势，与酚类物质变化相关性较大。
收稿日期： 2013-10-17 基金项目： 浙江省重点科技攻关项目（2006C12068）；浙 江
省农产品化学与生物加工技术重点实验室开 放 基 金 （2012KF1204 ） 作者简介： 蒋增良，男，1987 年出生，硕士生 通讯作者： 毛建卫
化性能的变化规律很有必要。 本文以葡萄为原料， 研究天然发酵过程中还原力、DPPH 自由基、 羟基 自由基、 超氧自由基和 ABTS 自由基清除能力的 变化，以及上述变化与总酚含量的相关性，以期为 进一步阐明微生物酵素产品的保健功能机理和综 合性开发提供理论基础和技术依据。
剂， 反应 3 min， 最后加入 3 mL 20%的碳酸钠溶
液，25 °C 恒温水浴振荡 2 h， 在 760 nm 波长处测
定吸光度，以去离子水为参比溶液。 总酚含量以没
食子酸等价物表示， 按照标准曲线线性方程 y=0.
0917x + 0.0208，R2 = 0.9996 来测定总酚含量。 其
中：y 为吸光度；x 为样品质量浓度（GAE，μg/mL）。
1.2.3 DPPH 清 除 能 力 [9] 40 μL 样 品 加 入 到 4
mL 0.1 mmol/L DPPH-甲 醇 溶 液 中 ， 再 加 入 450
μL 50 mmol/L Tris-HCl buffer （7.4），25 °C 温 度
下恒温水浴 30 min。 以去离子水为参比溶液。 在
30 °C 温度下反应 5 min。 以去离子水为参比溶液。
在 734 nm 波长处测定吸光度。
ABTS 自 由 基 清 除 能 力/% =[（A0 -（A1 -A2））/
A0]×100
（4）
式中，A0— ——空白对照液的吸光度 ；A1— ——样
品测定管的吸光度；A2— ——样品本底管的吸光度。
2 结果与分析
磷 酸 缓 冲 液 （0.2 mol/L，pH 6.6），然 后 加 入 2.5 mL
10 g/L 铁氰化钾，50 °C 反应 30 min，再加入 0.1 g/
mL 三 氯 乙 酸 2.5 mL， 在 3 000 r/min 下 离 心 10
min，立即取 2.5 mL 上清液，加入 2.5 mL 去离子水
ABTS（用 5 mmol/L 的 PBS，pH 7.4 配制），加 入 过
硫酸钾使最终浓度为 2.45 mmol/L，在室温条件下
黑暗放置 12~16 h。 使用前把 ABTS 自由基用 PBS
稀释成在 734 nm 波长处吸光度为 0.7±0.02。
取 10 μL 样品加入到 5 mL 上述稀释液中，在
和 0.5 mL 1 g/L 三氯化铁。 以去离子水为参比溶
液，在 700 nm 波长处测定吸光度。 吸光度越高，还
原力越强。
1.2.5 超 氧 自 由 基 清 除 能 力[11] 50 μL 样 品 加 入
到 950 μL 磷酸缓冲液（0.1 mol/L pH 7.4），然后加
入 1 mL 120 μmol/L PMS（用 0.1 mol/L 的 PBS，pH
第 14 卷 第 10 期
葡萄酵素在天然发酵过程中体外抗氧化性能的变化
31
中发酵液中有机酸的浓度增加[14]。 发酵液具有一 定的缓冲作用， 菌体的生长和代谢产生的大量二 氧 化 碳 （CO2） 在 水 溶 液 中 不 稳 定 ， 产 生 碳 酸 氢 根 离 子 （HCO3-）， 它可以从有机酸上结合 1 个氢离子 （H+）， 从 而 防 止 氢 离 子 浓 度 的 进 一 步 升 高 ， 使 发 酵 液有一定的缓冲能力[15]。 2.2 葡萄酵素发酵过程中总酚含量的变化
2.1 葡萄酵素发酵过程中 pH 值的变化 发 酵 过 程 中 葡 萄 酵 素 pH 值 随 发 酵 时 间 变
化，结果如图 1 所示。 由图 1 可知，葡萄酵素的 pH 值在前 8 d 内快
速从 5.39 下降到 4.70， 之后只有小幅度的下降， 并趋于缓和， 说明葡萄酵素初期发酵快速，8 d 后 进入慢发酵阶段。 pH 值的下降是由于在发酵过程
关键词 葡萄酵素； 抗氧化能力； 总酚含量； 发酵过程 文章编号 1009-7848（2014）10-0029-06
人类的动脉硬化、炎症、糖尿病、癌症等多种 疾病和衰老等被证实与活性氧和自由基 有 关 。 [1-3] 由于机体中过量的自由基会引起蛋白质变性、 DNA 损 伤 、细 胞 死 亡 乃 至 机 体 的 病 变 ， [4-5] 因 此 国 内外的很多研究都在寻找富含天然抗氧化性成分 的食品来防治自由基引起的疾病[6]。
37 °C 温度下恒温水浴 1 h。 以去离子水为参比溶
液。 在 562 nm 波长处测定吸光度。
羟 基 自 由 基 清 除 能 力/% =[（A0 -（A1 -A2））/
A0]×100
（3）
式中，A0— ——空白对照液的吸光度 ；A1— ——样
品测定管的吸光度；A2— ——样品本底管的吸光度。 1.2.7 ABTS 自 由 基 清 除 能 力 [13] 用 7 mmol / L
污染，制备过程中所有操作都在无菌条件下进行。
在发酵过程中，每隔 8 d 取样，样品经高速离心机
10 000 r/min 离心 10 min 后，用于测定。
1.2.2 总酚含量测定[8] 100 μL 样品加入到 45.9
mL 去 离 子 水 ， 再 加 入 1 mL Folin-Ciocalteau 试
2.3 葡萄酵素发酵过程中 DPPH 自由基清除能 力的变化
DPPH 自由基是 1 个以氮为中心的脂溶性的 自由基，相对于其他方法，它被广泛运用于评价短 时间内的抗氧化活性[17]。 葡萄酵素在发酵过程中 DPPH 自由基清除能力的变化如图 3 所示。