阪崎肠杆菌的测定共20页文档
应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌
１ 。从培养液中各取 １ Ｌ ２ｈ 直接用试剂盒法提取各 ｍ
菌基因组 Ｄ Ａ Ｎ ，进行 Ｌｍ ａ ｐ和 Ｐ Ｒ试验。 Ｃ １ ． 模板 Ｄ Ａ的制备 ．２ ３ Ｎ 按 照 Ｄ Ａ试剂盒 的说 明进行 ，提取 的 Ｄ Ａ Ｎ Ｎ ， 溶解于 １０ｚ ０／ Ｌ的洗脱缓 冲液 中，并储存在 一 ０℃ ２ 备用。 １ ． 模板 Ｄ Ａ含量的确定 ．３ ３ Ｎ 根据测定模板 Ｄ Ａ稀释 １ｓ Ｎ Ｏ倍后的 Ｏ ２ ０ Ｄ ６ 读 数， 计算 Ｄ Ａ含量为 ２１ ×１“ｇ ／ 。 Ｎ ． ５ ０ ｆ／ Ｌ ｘ １． Ａ Ｐ ．４ ３ Ｌ Ｍ 引物设计 根据 Ｇ ｎｂｎ ｅｅａｋ中的阪崎肠 杆菌基 因序列 ，进 行 比对 ，确定阪崎肠杆菌 （ Ｔ Ｃ ９４ ） Ｇ ｎ ａｋ Ａ Ｃ ２５ ４ 在 ｅＢ ｎ
Ｅ Ｌ ３ 、Ｃ Ｃ ４ ８ ８ Ｄ ９３ Ｍ Ｃ ４２ ；大肠 艾 希 氏菌 （ ． ｏ） Ｅ ｃｌ ： ｉ Ｃ ＭＣ １２；沙门氏菌 （ ｍ ｎｌ） ＭＣ ４ ０５ Ｇ Ｃ１２９ ｓ ｏｅａ：Ｃ Ｃ ７ ０ 、 ｌ ａ ｌ
源性达到 ９％。用 ２ 株食源性 致病菌证 实 ９ ５ 该引物特异性强。Ｌ Ｍ 扩增 ２ ｍｎ Ａ Ｐ ０ ｉ，其灵敏度为 ４ × ０ ｆ／ ｂ ， ． １２ｇ ｔ ｅ ３ ｕ 结果表明，Ｌ Ｍ Ａ Ｐ方法检测阪崎肠杆 菌，灵敏度高、特异性强、耗 时短 、方法简便。 关键词 环介导等温扩增 ；Ｌ Ｍ ；检测 ；阪崎肠杆菌 Ａ Ｐ
Ｌ ＡＭＰ ｗａ ｏ ｉｖ ． ｈ ｏｉ ｗ￣ ｒｄ ｃｓｗｅｅ ｄｇ ｓｅ ｔ ｅ ｔ ｃｉｎ ｅ ｚｍｅ ｗｈｃ ｈ ｈ ｏｅｉａ ｘ ｅ ｔｄ ｓｐ ｓ ｉｅ Ｔ ｅ ｐ ｓｔ ｐ ｏ ｕ ｔ ｔ ｉ ｒ ｉｅｔｄ ｗｉ ｒｓｒ ｔ ｎ ｙ ， ｈ ｉ ｏ ｉｈ ｔｅ ｔｅ ｒｔ ｌ ｅ ｐ ｃｅ ｃ
KJ06 阪崎肠杆菌普通PCR法.
阳性结果：282bp PCR扩增产物
4.结果分析
阳性：阴性和空白对照均未出现预期大小的扩增条 带；阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条 带，怀疑存在阪崎肠杆菌。 阴性：阴性、空白对照及待测样品均未出现预期大 小的扩增条带；阳性对照出现预期大小的扩增条带。 无效试验：阳性对照未出现预期大小的扩增条带。 污染可能：阴性对照和空白对照出现预期大小的扩 增条带。
试剂 仪器设备 方法步骤及注意事项 结果分析 确认试验
1.试剂
增菌： • 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（MLST） 即：在一升LST中增加氯化钠29.22克；高 压后添加万古霉素10mg/L。 • 脑心浸液（BHI） DNA提取：试剂盒
PCR试剂： 10×PCR buffer、Taq酶、dNTP、ddH2O、 引物、阳性、阴性对照DNA。 电泳： 琼脂糖（分析纯）、溴化乙锭、电泳缓冲 液、加样缓冲液、分子量标记：100 bp DNA ladder。
5.确认试验
PCR阳性结果需做确认试验。 取留存的BHI增菌液接种于VRBGA及显色培 养基，参照标准第一部分挑取可疑菌落进行 鉴定。
6.检验程序
样品100 g加入900 mL MLST中 44°Байду номын сангаас 22 h～24 h
0.2mL MLST增菌液加到5 mL BHI中 36℃1℃ 水浴4h PCR 检测 阴性 阳性
SN/T 1632.1-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检测方法
第2部分
奶粉中阪崎肠杆菌的PCR检测方法
增菌液的选择
采用经试验评估的美国杜邦公司BAX系 统相关增菌方法：用改良月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤（MLST）对奶粉中阪崎肠 杆菌进行选择性增菌，再用脑心浸液 （BHI）对阪崎肠杆菌在短时间内进行快 速增殖，以供PCR检测。
阪崎肠杆菌
发生在
小肠结肠炎 成人菌血症
成年人
局部感染
3 致病机制
动物实验表明阪崎肠杆菌致病机制可能与侵入 及肠毒素作用有关。
Pagotto
3.1 实验一
108CFU/鼠
经口注射
经腹腔注射
2株死
乳鼠全死，4株产肠毒素
Tonwsand
3.2 实验二
大肠埃希菌注射小鼠
原因： 阪崎肠杆菌增强 阪崎肠杆菌注射 了肠道与血脑屏 障通透性
阪崎肠杆菌的致病机制
引言
新闻： 2002 年Dennison 从1 名64 岁的外周 血管患者的伤口上分离到阪崎肠杆菌。 2002年Ongradi 等报道了阪崎肠杆菌 引起匈牙利1 名26 岁女患者阴道感染
一、简介
二、易感染人群
三、 致病机理
四、控制方法
1、阪崎肠杆菌的简介
1.1 细菌简介：
(1).宿主部位：人和动 物肠道内 (2).0.6~1.1μm×1.2 ~3.0μm (3).菌落形态：不同琼 脂其菌落形态不同 (4).细菌特点：革兰氏 阴性无芽孢杆菌
从其他部位提取到
3.3 破坏细胞过程
1
粘附
2
侵入与诱 导凋亡
3
免疫逃避
3.3.1 粘附 弥散性粘附
最大粘附 所在时期
粘附性
细胞表面局部 定植菌群粘附
生长对 数期后 期
混合型
3.3.2 侵入和诱导凋亡
前期
①细菌结合 中期
①PI3-激酶和APKC被激活, ② 表达的未激活 PI3-激酶和APKC抑制其侵入 HBMEC
1) 科学地喂养适 宜的母乳代用品 2）提出警示 3）用开水冲调配 方食品 4）剩余的液体调 配食品→冰箱保存 5）食用前加热。
食品中阪崎肠杆菌的鉴定计数
品种名称：阪崎肠杆菌显色培养基阪崎肠杆菌显色培养基用途：供婴儿奶粉以及其它食品中阪崎肠杆菌的鉴定和计数。
阪崎肠杆菌显色培养基使用原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源;胆盐抑制革兰氏阳性菌，氯化钠可维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;硫代硫酸钠和柠檬酸铁铵用于检测硫化氢的产生;显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-ɑ-D葡萄糖苷与阪崎肠杆菌中的α-葡萄糖苷酶发生反应，水解底物，释放出5-溴-4-氯-3-吲哚基显色基团，在淡黄色平板上产生绿-蓝绿色的菌落。
阪崎肠杆菌显色培养基配方(每升)：蛋白胨 11g牛肉膏粉 5g氯化钠 5g柠檬酸铁铵 1g硫代硫酸钠 1g胆盐 1.5g5-溴-4-氯-3-吲哚-ɑ-D 葡萄糖苷 0.1g琼脂 15g最终pH 7.3±0.2阪崎肠杆菌显色培养基使用方法:1. 取瓶内干粉39.6克，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min;冷却至50℃，摇匀倒平板。
在室温可保存一天或在冰箱里贮存数天(避光，4℃)。
2. 取样品333克按MPN三管法分别取100克、10克和1克分装在各三个2000ml、250ml和100ml的三角瓶中，在三角瓶中已装有经45℃预热的9/10(样品为1/10)的无菌蒸馏水或缓冲蛋白胨水，摇匀，在36℃培养18-22小时(SN和FDA方法)。
3. 各取10ml上述悬浮液加到装有90mlEE肉汤(022160)/mLST-Vm(022212)的150mL的三角瓶中，在36℃/44℃增菌培养18-22小时。
4. 用划线或涂布法把混匀的肉汤接种到阪崎肠杆菌显色琼脂平板上，35-37℃培养18-24小时。
5. 可使用MicrogenTMGN-ID或API20E或生化管试验，对疑似阪崎肠杆菌菌落进行生化鉴定。
阪崎肠杆菌显色培养基质量控制：阪崎肠杆菌显色培养基倾注平皿后呈淡黄色，下列菌株接种后36±1℃培养18-24小时生长情况如下表：质控菌株接种量 (cfu/平板) 生长情况菌落色泽阪崎肠杆菌ATCC51329 30 – 300 良好绿-蓝绿色普通变型杆菌HK7132 30 – 300 良好灰黑色粘质沙雷伯氏菌HK7121 5000 不长-粪肠球菌ATCC29212 5000 不长-贮存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。
阪崎肠杆菌污染途径
• 检验流程: ①接种缓冲蛋白胨水 : • ②mLST增菌24h • ③接种DFI培养基,37℃，培养 24h • ④接种API20NE
1.3 分离方法 DFI显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上阪崎肠杆菌的菌落特征 显色培养基上
蓝绿色菌落
1.3 分离方法
E. sakazakii 的API 20E结果 结果
• 样品修复培养（前增菌）： 样品修复培养（前增菌）：无菌称取100g乳粉加 ）： 入500ml预热45℃BP中，混匀，经36℃±1℃培 养18-24h。 • 样品肠道增菌培养 样品肠道增菌培养：移取10ml 加入90mlEE肉 汤中，于36℃±1℃培养18-24h。 • 样品分离培养：取EE增菌肉汤培养物1环，分别 样品分离培养： 划线接种EMB、MacConKey、 SorbitolMacConKey琼脂平板各1块，置 36℃±1℃培养18-24h。观察3种平板上的菌落 形态及不同的生物学特性反应及其差异比较。
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
更快的检测方法? 更快的检测方法
• PCR • Q-PCR
DFI培养基存在的问题 培养基存在的问题
荧光PCR结果 结果 荧光
1.4其他肠杆菌属的检验 其他肠杆菌属的检验
• E-M-S法 • 所需培养基： • EMB • MacConKey • SorbitolMacConKey
1.3 分离方法 美国FDA 法 – 2002年 美国 年
• 对加拿大法进行了修改:
– 从10毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（EE）。 毫升接种到90毫升肠杆菌增菌肉汤 毫升接种到 毫升肠杆菌增菌肉汤（ ）。 孵育过夜而不是直接涂布 平板. 在36oC孵育过夜而不是直接涂布 VRBG 平板 孵育过夜 – 可疑菌落接种 可疑菌落接种TSA 并在 oC 培养 48-72 hours. 并在25 – 只有产黄色色素的菌落进行 API 20E system实验 实验. 实验
66食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）
A.1.1.1 成分 蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 磷酸二氢钾 蒸馏水
pH 7.2 A.1.1.2 制法
加热搅拌至溶解,调节 pH，121 ℃高压灭菌 15 min。
10.0g 5.0 g 9.0 g 1.5 g 1 000 mL
A.7 L-精氨酸双水解酶培养基
A.7.1 成分
L-精氨酸盐酸盐（L-arginine monohydrochloride）
5.0 g
酵母浸膏 葡萄糖 溴甲酚紫
3.0 g 1.0 g 0.015 g
蒸馏水
1 000 mL
pH 6.8±0.2 A.7.2 制法
将各成分加热溶解，必要时调节 pH。每管分装 5 mL。121 ℃高压 15 min。
A.8.4 实验方法
挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h， 观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。
8
A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基
GB 4789.40—2010
A.9.1 成分
柠檬酸钠
2.0 g
氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢铵
I
GB 4789.40—2010
食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
1 范围
本标准规定了食品中阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）的检验方法。 本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：25 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，44 ℃±0.5 ℃。 2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 2.3 恒温水浴箱：44 ℃±0.5 ℃。 2.4 天平：感量 0.1 g。 2.5 均质器。 2.6 振荡器。 2.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌锥形瓶：容量 100 mL、200 mL、2000 mL。 2.9 无菌培养皿：直径 90 mm。 2.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 2.11 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：见附录 A 中 A.1。 3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin
奶粉中的健康杀手——克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测标准解读
奶粉中的健康杀手——克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检测标准解读！克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）是由Iversen等人于2008年建议创立的隶属于肠杆菌科的一个新属，该属是寄生在人和动物肠道内的一种有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌的发展经历了4个时期：１起初该菌因其产生黄色素，被认为是肠杆菌属中阴沟肠杆菌的生物变形种──黄色阴沟肠杆菌；２1989年，Farmer通过DNA杂交、生化反应、黄色素产生及抗生素敏感性等实验，发现该菌与阴沟肠杆菌有所不同，为此更名为“阪崎肠杆菌”；３2008年，Iversen等人通过荧光扩增片段长度多态性、自动核糖体分型、16SrRNA基因测序、DNA-DNA杂交和表型阵列等多种分子生物学技术研究，将该菌由种（阪崎肠杆菌）扩大为属（克罗诺杆菌属），这个新属包括6个种；４2012年，Joseph等利用16SrRNA基因序列分析和多位点测序技术对克罗诺杆菌属进行分类研究，提出将克罗诺杆菌属分为7个种。
克罗诺杆菌属是一种重要的食源性条件致病菌，可通过污染婴幼儿配方奶粉等食品导致新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。
其名字“克罗诺”（Cronos）来源于希腊神话，克罗诺是希腊神话中十二个泰坦巨神之一，传说他的每个孩子一出生就被他一口吃掉，其行为表现和该菌的致病特性很吻合，因此“Cronobacterspp.”被译成“克罗诺杆菌属”。
该菌作为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，对其相关产品的检测及监管尤为重要，常用的检测方法有：另外，2016年12月23日卫计委发布了新标准GB 4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》，将于2017年6月23日实施，并将代替GB 4789.40-2010、SN/T 1632.1-2013。
该标准与GB 4789.40-2010相比，主要变化有：1.修改了标准名称标准名称中“阪崎肠杆菌检验”改为“克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验”。
阪崎肠杆菌
• 婴幼儿脑膜炎：未足月出生的新生儿占75％。主要变现为 发热、面色苍白，有抽搐或颤抖，张力亢进，囱门隆出， 无颈项强直。合并有菌血症者占5／8，坏死性小肠结肠炎 占2／8，死亡率高达75％。阪崎肠杆菌引起的脑膜炎常引 起脑梗塞、脑脓肿、囊肿形成和脑室炎等并发症,并且可 引起神经系统后遗症或迅速死亡。 。 • 新生儿菌血症:低热，寒战，白细胞偏低，血液培养分离 可得到阪崎肠杆菌 ，多数症状较轻，如出现严重的脓毒 血症，死亡率可达36％。 • 新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC):多发生于未足月出生体重 较轻的婴幼儿 。 • 成人感染 ：阪崎肠杆菌引起成人菌血症或局部感染。
所致疾病
阪崎肠杆菌可以对任何年龄段的人群引起疾 病，但主要是婴幼儿，特别是1岁以下和出生28 天以内的婴儿，早产儿、低体重儿或免疫缺陷的 婴幼为他们主要依靠奶粉喂养， 比其他婴幼儿更容易感染。感染主要引起脑膜炎、 脓血症、坏死性小肠结肠炎,阪崎肠杆菌引起的脑 膜炎常引起脑梗塞、脑脓肿、囊肿形成和脑室炎 等并发症,并且可引起神经系统后遗症或迅速死亡。
生物学性状
• 形态特征:革兰阴性粗短杆菌细胞大小为 ( 0.6~1.1 )×( 1.2~3.0 )µm，有周身菌毛,无芽胞,有动力 。 • 培养:兼性厌氧,营养要求不高,能在营养琼脂、血平板、麦 康凯等多种培养基上生长。在TSA和BHI生长为 1.5~2.5mm的黄色菌落 ，在VRBG能产生紫红色菌落，而 在TSA上加xα-GLC将出现绿色菌落，氧化酶阴性，触酶 反应阳性。 • 抵抗力：耐高温、干燥、渗透压 阪崎肠杆菌比其他肠杆 菌耐高温。耐酸性并对清洁剂和杀菌剂有较强抵抗力 。 •
我国对阪崎肠杆菌方面的管理规定
• 《关于对进口乳制品进行阪崎肠杆菌检测的通知》(国质 检食函[2005]690号)； • 《关于加强进口乳制品检验检疫监督管理工作的通知》 国质检食函[2007]298号）； • 《婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则》(2006、2008 版)