血凝血抑实验操作方法
浅谈血凝和血凝抑制试验操作要点
2020.3作者简介:王宁(1978.1-),女,辽宁省建平县人,大学本科,高级兽医师,主要从事临床兽医及实验室诊断技术工作。
浅谈血凝和血凝抑制试验操作要点王宁(辽宁省建平县动物疫病预防控制中心122400)摘要:血凝和血凝抑制(HA-HI )试验是目前禽流感监测普遍采用的试验方法,用来鉴定流感病毒分离株,检测禽血清中的感染抗体或免疫抗体,为免疫效果评估和疫情监测提供科学依据。
本文就HA-HI 试验操作提出几点建议,供化验室工作人员参考。
关键词:血凝;血凝抑制;试验;操作血凝试验(HA)是根据禽流感病毒的血凝素能与鸡红细胞发生凝集现象的特点而建立,而这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制,即红细胞凝集抑制试验(HI)。
1操作要点1.1血清处理与保存采血样一般以静脉血为主,采集后要及时分离血清,保证血清清透无溶血。
血清样品要尽早检测或置4℃冰箱保存5d,超过一周需置—20℃冷冻保存,切忌反复冻融[1]。
1.2稀释液配制HA-HI 试验缓冲液为0.01mol/L,pH=7.2的PBS,PBS 尽量现用现配,高压灭菌后使用,一经使用保存期不要超过3周。
pH 要在高压后调节,若在高压前调到7.2,高压后会有所改变。
1.31%红细胞悬液制备1%红细胞悬液要现用现配,采血鸡要求至少3只SPF 成年公鸡。
洗涤鸡红细胞离心转速为1000~2000rpm,离心10min (检测禽流感抗体时1000rpm,检测鸡新城疫抗体时2000rpm)。
洗脱好的红细胞原液4℃保存备用,配制红细胞悬液时应吸取试管底部的红细胞进行稀释,若吸取上层红细胞可能会导致悬液浓度偏低。
使用前一定要摇匀,防止红细胞下沉,保证每一孔中加入的浓度准确一致。
1.4试剂的使用与保存冻干的病毒抗原应按照说明书要求溶解并保存,可以无菌操作将其分装成小包装,以避免反复冻融,并有效减少细菌污染。
1.5HA 试验HA 试验测定抗原效价,做3个重复即可。
室温(20~25℃)静置40min 后观察结果。
病毒血凝与血凝抑制实验报告
病毒血凝与血凝抑制实验报告一、实验目的病毒血凝与血凝抑制实验是一种常用的病毒学检测方法，旨在检测病毒的血凝活性以及血清中特异性抗体的存在和滴度。
本次实验的主要目的是：1、熟悉病毒血凝与血凝抑制实验的基本原理和操作流程。
2、掌握检测病毒血凝活性的方法，并确定病毒的血凝效价。
3、运用血凝抑制实验检测血清中特异性抗体的水平，为疾病的诊断和防控提供依据。
二、实验原理1、病毒血凝现象许多病毒表面具有血凝素，能够与红细胞表面的受体结合，使红细胞发生凝集。
这种现象称为病毒血凝现象。
不同的病毒血凝素与红细胞结合的特异性不同，因此可用于病毒的鉴定和分类。
2、血凝抑制实验当血清中存在特异性抗体时，抗体能够与病毒表面的血凝素结合，从而阻断病毒与红细胞的结合，抑制血凝现象的发生。
通过系列稀释血清，以能完全抑制血凝现象的最高血清稀释度作为抗体的血凝抑制效价。
三、实验材料与设备1、实验材料病毒悬液：本次实验使用的是_____病毒悬液。
红细胞：选用新鲜的鸡红细胞或豚鼠红细胞。
标准阳性血清和阴性血清。
待检血清。
2、实验设备微量移液器。
96 孔 V 型微量反应板。
离心机。
恒温箱。
四、实验步骤1、病毒血凝效价的测定用 PBS 缓冲液将病毒悬液进行 2 倍系列稀释，从 1:2 至 1:256，共11 个稀释度，每个稀释度设 2-3 个重复孔。
在 96 孔 V 型微量反应板中，每孔加入25μL 稀释好的病毒液。
向每孔中加入25μL 1%的红细胞悬液，轻轻振荡反应板，使病毒液和红细胞充分混合。
将反应板置于 37℃恒温箱中孵育 30-60 分钟，观察血凝现象。
以出现“＋＋”凝集的最高稀释度作为病毒的血凝效价。
2、血凝抑制实验对待检血清进行 2 倍系列稀释，从 1:2 至 1:256，共 11 个稀释度。
在 96 孔 V 型微量反应板中，每孔加入25μL 稀释好的待检血清。
向每孔中加入25μL 4 个血凝单位的病毒悬液，轻轻振荡反应板，混合均匀，置 37℃恒温箱中孵育 30 分钟。
简述间接血凝抑制试验的过程及应用
简述间接血凝抑制试验的过程及应用间接血凝抑制试验是一种常用的实验方法，用于检测血液中的抗凝物质，如抗凝酶等。
本文将对间接血凝抑制试验的过程及应用进行简述。
间接血凝抑制试验的过程如下：1. 准备血样：从被测者的静脉采集一定量的血液样本，将其置于离心管中，离心分离血清。
血清是不含红细胞的液体部分，其中含有被测物质。
2. 制备凝血体系：将一定量的凝血酶、凝血因子等添加到试管中，形成一种正常的凝血体系。
3. 添加血清：将被测的血清样本加入到凝血体系中，使被测物质和凝血体系发生作用。
4. 观察凝血时间：在试管中观察凝血时间的变化，如果被测物质具有抑制凝血的作用，那么凝血时间会延长；反之，如果被测物质没有抑制凝血的作用，那么凝血时间不会发生明显变化。
5. 数据分析：根据观察到的凝血时间变化，可以判断血液中是否存在抗凝物质。
如果凝血时间延长，说明血液中存在抗凝物质，反之则说明血液中不存在抗凝物质。
间接血凝抑制试验的应用非常广泛，主要用于以下方面：1. 诊断血栓病：血栓病是一种由于血液凝固功能异常导致的疾病，间接血凝抑制试验可以帮助医生判断患者血液中是否存在抗凝物质，从而辅助诊断血栓病。
2. 评估抗凝治疗效果：在一些需要进行抗凝治疗的疾病中，如心脏瓣膜病、深静脉血栓等，间接血凝抑制试验可以用来评估抗凝治疗的效果，指导治疗方案的选择和调整。
3. 研究抗凝物质：间接血凝抑制试验可用于研究抗凝物质的特性、作用机制等，对于深入了解血液凝固系统的功能和调控机制具有重要意义。
4. 评估血液样本质量：间接血凝抑制试验可以用来评估血液样本的质量，如果血液样本中存在抗凝物质，那么可能会影响到实验结果的准确性。
5. 指导临床用药：间接血凝抑制试验可以帮助医生评估患者是否适合使用抗凝药物，并根据试验结果调整药物的用量和疗程。
间接血凝抑制试验是一种常用的实验方法，可以用于检测血液中的抗凝物质，如抗凝酶等。
该试验的过程包括准备血样、制备凝血体系、添加血清、观察凝血时间和数据分析。
鸡新城疫血凝和血凝抑制试验作业指导书
鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验作业指导书1、血凝试验1.1 材料与试剂1.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、96孔V 形血凝反应板。
1.1.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS)配制方法参见附录A。
1.1.3 1%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。
1.1.4标准新城疫病毒抗原、购入的标准新城疫病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。
若不符，应重复检测并到相关实验室验证。
2、血凝试验操作程序2.1 血凝试验操作程序如下：2.1.1 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔-12孔每孔加0.025mLPBS；2.1.2 吸取0.25mL病毒悬液加入第1孔中，吹打3次-5次充分混匀；2.1.3 从第1孔中吸取0..25mL混匀后的病毒液加到第2孔，混匀后吸取0.025mL加入到第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取0..25mL弃之，设第12孔为PBS对照；2.1.4 每孔再加入0.25mLPBS。
2.1.5 每孔均加入0.25mL体积分数为1%鸡红细胞悬液；2.1.6 振荡混匀反应混合液，室温20℃-25℃下静置40min 后观察结果，若环境温度太高，放4℃静置60min,PBS对照孔的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。
2.2 结果判定2.2.1 在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝聚。
以完全血凝的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。
完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1一个血凝单位（HAU）。
2.2.2 如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用SPF鸡胚用初代分离尿囊液继续传两代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性。
2.2.3 对于血凝试验呈阳性的样品应采用新城疫标准阳性血清进一步进行血凝抑制试验。
3、血凝抑制试验3.1 材料与试剂3.1.1 器材同1.1.1.3.1.2 试剂同1.1.2.3.1.3 标准抗NDV血凝抑制抗体（血清）。
禽流感血凝和血凝抑制试验操作
禽流感血凝和血凝抑制试验操作鲁卫红/甘肃省临夏州动物疫病预防控制中心 731100摘 要：当前，血凝和血凝抑制试验是检验与监测禽流感最常用的方法.随着养殖户科学养殖意识的逐渐增强，越来越重视实验检测技术在养殖业中的运用。
其中，血凝和血凝抑制技术是养鸡业中最常用的免疫实验检测技术之一。
该项技术主要运用于鸡新城疫和禽流感病毒日常检测和专项监测，其目的在于明确鸡的免疫状态，从而科学合理地控制、预防传染病。
为提高血凝和血凝抑制试验操作的精准性和规范性,笔者结合自身多年的工作经验，总结了该项试验的操作要点。
关键词：禽流感；血凝；血凝抑制；试验操作1 实验操作准备要点1.1 标本处理和保存 血凝和血凝抑制试验主要以静脉血为主。
要使实验室诊断得出正确结果，采集静脉血后需要及时做血清分离，保证血清清透无溶血。
通常是分离后及时检测，如果不能及时检测，待检血清在4℃冷藏环境中保存不超过5d，如果待检时间超过一周，需要保存在-20℃冷冻环境中，检测时取出自然融化，避免血清反复冻融影响效价。
1.2 稀释液配置 血凝和血凝抑制试验中所用的PBS稀释液必须遵循“现配现用”的原则，严格控制PBS液的PH值确保PH7.0～7.2。
1.3 1%红细胞悬液制备 需要选取3～5只常规实验证明体内无禽流感病毒抗体的健康公鸡，最大限度的避免公鸡红细胞发生自凝现象。
翅下静脉血采集到加有抗凝剂的试管中并上下颠倒混匀，待采集样本在离心操做中缓慢加入PBS液混合，按2000r/min的离心5min，反复三次离心即可，每次离心结束后都吸出上层溶液和白细胞膜弃去，制成红细胞泥加入阿氏保护液，4℃冷藏保存备用，不超过5d。
整个制备过程中避免用力太大引发红细胞破裂出现溶血现象，临用时用PBS液制成1％红细胞悬液，每次实验结束后剩余的1％红细胞悬液应弃去，切勿保留至下次再用。
注意：最终配置好的悬液静放后出现了红色上清液，是出现了溶血现象，此时的红细胞悬液不可用。
血凝和血凝抑制实验
3、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul
4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分 钟
5、结果判定
医学课件ppt
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血凝效价测定
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结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释 倍数为该抗原的血凝价（1:128）？？？ 。
25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一 个血凝单位。
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血凝抑制试验
1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32）
2、在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水；
3、在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第 10孔，最后弃25ul；
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注意事项
• 1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢， 以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡 红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄 色，之后直至清亮为清洗干净）。
• • 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸
取干净。
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1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而 稍向孔底集中，即75％凝集；
3、 ＋＋：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块， 即50％凝集；
4、 ＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四 周稍有凝集块，即25％凝集；
5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即 无凝集。
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hi 血凝抑制试验原理
hi 血凝抑制试验原理血凝抑制试验是一种用于检测血浆中抗凝物质浓度的实验方法，也被称为“HI”试验。
它是通过观察血浆对于血小板聚集的抑制作用来评估抗凝物质的功能。
本文将详细介绍hi血凝抑制试验的原理和应用。
一、原理概述血液在正常情况下应保持一定的流动性，而不应过于凝结。
凝血是一种正常的生理反应，可以防止出血，但如果血液凝结过于剧烈，就会导致血栓形成，从而引发心脑血管疾病等严重后果。
为了维持血液的正常流动性，人体内存在一系列的抗凝机制，例如血小板抗凝剂、凝血酶抑制剂等。
而hi血凝抑制试验就是用于检测这些抗凝物质的浓度和功能。
二、试验步骤hi血凝抑制试验主要包括以下步骤：1. 准备血浆样本：收集新鲜的抗凝血浆样本，避免凝固和溶解物的存在，以确保准确的试验结果。
2. 预处理血浆：将血浆样本进行离心分离，得到上清液，去除红细胞和凝固因子。
3. 加入抗凝剂：将已经预处理好的血浆样本分成若干组，每组加入不同浓度的抗凝剂。
4. 加入血小板悬液：在每组样本中加入一定浓度的血小板悬液，使其与抗凝剂充分混合。
5. 观察血小板聚集情况：将各组样本置于显微镜下观察，记录血小板聚集的程度。
聚集程度越低，说明抗凝物质的浓度越高，功能越好。
三、结果解读hi血凝抑制试验的结果通过观察血小板的聚集程度来进行解读。
一般情况下，正常血浆中的抗凝物质浓度较高，能够有效地抑制血小板的聚集，因此血小板聚集程度较低。
而当抗凝物质的浓度降低或功能异常时，血小板的聚集程度将增加。
通过对不同浓度抗凝剂处理后的血浆样本进行观察，可以得到抗凝物质的浓度和功能信息。
四、应用价值hi血凝抑制试验在临床上有着广泛的应用价值。
首先，它可以用于评估血液的凝血功能，了解抗凝物质的浓度和功能是否正常。
其次，对于一些凝血相关疾病的诊断和治疗也具有重要意义。
例如，在肝功能不全的患者中，抗凝物质的合成和功能可能受到影响，通过hi 血凝抑制试验可以及时发现异常情况并做出相应处理。
血凝血抑试验
血凝试验(HA)定义：某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HA)血凝抑制试验(HI)定义：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HI) 。
原理：特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。
用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。
因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。
病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。
如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。
阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH 值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用1%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。
2.2 洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。
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血凝血抑实验操作方法
血凝血抑实验是用于检测血液中凝血系统的功能活性以及血管壁退行性变的一
种实验方法。
以下是一般的血凝血抑实验的操作方法：
1. 准备实验材料：新鲜的血液样本（采集静脉全血，使用无抗凝剂采血管），离心管，血小板计数管，玻璃片，25ml量瓶，10ml吸管，实验药物（如凝血因子和抗凝剂），计时器等。
2. 静脉全血采血：无菌条件下，采用无抗凝剂采血管从肘静脉采集血液样本。
要确保血液样本无抗凝剂，否则可能会影响实验结果。
3. 离心采血管：将静脉全血样本转移到离心管中，进行离心，用离心管分离血浆和红细胞。
4. 准备血浆：将离心后的上清液（血浆）转移到另一个离心管中，避免污染。
5. 凝血时间测定：取一份血浆加入25ml量瓶中，并在37水浴中预热。
同时，另取一份新鲜全血作为对照。
用吸管将凝血药物垂直加入含血浆的25ml量瓶中，计时器计时，观察血浆的凝固时间。
6. 凝固酶测定：将凝血酶加入血浆中，搅拌均匀后，记录酶加入后的凝固时间。
7. 抗凝物质测定：分别加入抗凝物质（如肝素）到血浆中，搅拌均匀后，记录凝固时间。
8. 结果分析：根据实验结果，可判断凝血系统的功能活性以及抗凝系统的功能活性。
较长的凝血时间可能暗示凝血系统功能较差，而较短的凝血时间可能暗示凝血系统功能较好。
需要注意的是，血凝血抑实验是一种较为复杂的实验，需要在严格的实验条件下进行，并且实验药物的使用应遵循安全操作规范。
此外，实验结果需要结合临床病史和其他检查结果进行综合判断。