纤维素酶的固定
天然高分子材料壳聚糖固定化纤维素酶的研究
天然高分子材料壳聚糖固定化纤维素酶的研究近年来，纤维素酶技术受到越来越多的关注，因为它可以有效地提高纤维素的利用率，从而使它成为了一种重要的可持续能源。
由于它的高活性和稳定性，纤维素酶是一种理想的生物催化剂，也被很多人用于生物重整和生物水解等方面。
然而，传统的纤维素酶分离与固定化技术存在着许多不足。
因此，开发新的固定化技术以提高纤维素酶的活性和稳定性，具有十分重要的意义。
天然高分子材料壳聚糖是一种新型的固定化剂，能够有效地将纤维素酶固定在材料表面，从而达到固定化纤维素酶的目的。
目前，固定化技术在酶分离中被广泛应用，而天然高分子材料壳聚糖也可以用于实现纤维素酶的固定化。
本研究旨在探究天然高分子材料壳聚糖固定化纤维素酶的研究方法，并研究其影响要素，以便进一步提高其固定化性能。
首先，研究团队采用了现有的解剖学实验和可视化技术来研究壳聚糖固定化纤维素酶的形式和结构。
在实验中，研究人员采用电子显微镜（TEM）技术和扫描电子显微镜（SEM）技术对壳聚糖和纤维素酶的形式和结构进行了详细的观察。
结果表明，壳聚糖能够有效地将纤维素酶固定在材料表面，并形成了良好的纤维素酶-壳聚糖复合体。
研究人员还分别采用X射线衍射仪（XRD）、透射电镜（TEM）和热重-分析仪（TGA）等技术，对壳聚糖固定化纤维素酶的结构和性质进行了进一步的测试。
其次，研究人员对壳聚糖固定化纤维素酶的活性和稳定性进行了实验研究。
研究人员发现，壳聚糖能够有效地提高纤维素酶的活性，壳聚糖固定化纤维素酶的活性高于传统的纤维素酶。
此外，壳聚糖固定化纤维素酶具有优异的热稳定性，而且在一定温度范围内，它们的活性还可以得到很好的稳定性。
最后，研究人员将室温和高温条件下的壳聚糖固定化纤维素酶进行了优化研究。
研究人员发现，当壳聚糖固定化纤维素酶处于低温条件下时，其活性可以达到最大，而当壳聚糖固定化纤维素酶处于高温条件下时，其活性则会有一定的降低。
经过上述实验，研究团队得出结论：天然高分子材料壳聚糖可以有效地将纤维素酶固定在材料表面，并具有良好的热稳定性，在一定温度范围内，纤维素酶的稳定性和活性可以获得很好的稳定性。
纤维素酶—木聚糖酶—漆酶的共固定化
纤维素酶—木聚糖酶—漆酶的共固定化纤维素酶、木聚糖酶和漆酶是植物细胞壁复式结构中重要的3种酶，也是降解该复式结构和合成植物细胞壁相关糖苷键的关键因素。
它们可以帮助植物细胞壁的强度和分解，从而分解产生植物细胞壁的原料。
共固定化技术可以有效的运用于三种类型的酶，利用这种技术可以高效的将三种酶共同固定在一个可随机分离的载体上，使它们能够有效的作用在一个催化体系中，从而使整个催化体系的性能得到提高。
在利用这种技术进行共固定化之前，需要先了解三种酶的特性及其作用。
纤维素酶是一种降解纤维素和半纤维素的酶。
它能够将纤维素类物质分解成糖原和半乳糖，也就是说，它能够将纤维素分解成更小的片段，从而更容易被植物细胞吸收利用。
木聚糖酶是一种能够降解木聚糖的酶，木聚糖是植物细胞壁中最重要的成分之一，由它和纤维素组成植物细胞壁的复式结构。
因此，木聚糖酶可以帮助植物细胞壁分解，使它们能够更有效的利用木聚糖。
漆酶是一种能够降解漆素的酶，漆素是植物细胞壁的一种重要成分，它可以使植物细胞壁表面的分子间的结合较为牢固，这样植物细胞壁才能够较为牢固地被细胞吸收，而漆素也能够减少植物细胞壁的渗漏性，从而保护细胞的稳定性。
共固定化技术可以有效的利用纤维素酶、木聚糖酶和漆酶的作用，将它们共同固定在一个可随机分离的载体上，从而使它们能够有效高效的催化单一催化体系中的反应。
这种方法可以有效的利用三种酶的联合作用，从而有效的将植物细胞壁复式结构中的构成成分分解，也可以通过利用植物细胞壁复式结构中的糖苷键反应来合成新的有机物，从而实现植物细胞壁复式结构的合成和分解。
此外，使用共固定化技术的另一个优势是能够更有效的利用酶的活性。
共固定化可以有效的将三种酶以较高的活性结合在一起，从而提高整个催化体系的性能，更有效的利用酶的活性，从而将植物细胞壁复式结构中的构成成分分解和合成。
此外，共固定化技术还具有一定的可操作性、可组装性特征，可以根据需要将多种酶混合，可以控制混合酶的比例，进行更加精确的操作，从而更好的利用混合酶的作用，节约成本，提高混合酶的性能。
黄单胞杆菌纤维素酶的原核表达及固定化研究
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关 键词 ： 野油菜黄单胞杆菌 ； 内切葡 聚糖酶 ； 原核表达系统 ； 固定化酶
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纤维素酶概述
整理ppt14源自3纤维素酶的制备工艺整理ppt
15
固体发酵生产纤维素酶
固体发酵法又称麸曲培养法。主要原料一般是麸皮、米糠等。农作物秸秆、甘薯渣、玉米粉、豆粕、压扁谷粒等 通常也可以作为主要原料或辅助原料。 固态发酵生产纤维素酶工艺流程图如 1 所示。首先对发酵原料灭菌，然后将菌种接入到与适当的水充分混合的培 养基中，选择适宜的温度和湿度进行发酵，最后用缓冲溶液（或无菌水）抽提纤维素酶，即可得到粗酶液。
整理ppt
4
纤维素酶来源及分类
来源：
真菌(mainly)： 木霉属、曲霉属和青霉属，如 绿色木霉菌,康宁木霉菌,黑曲霉，绳状青霉、变幻青霉等.
细菌: 好氧菌：如纤维单胞菌属、纤维弧菌属、噬胞菌属 厌氧菌：厌氧性的芽孢梭菌属、产琥珀酸拟杆菌、牛黄瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌等 超古菌：激烈火球菌等.
3
银杏叶中提取黄酮提高56％
2
三七总皂苷提高24％
1
金银花绿原酸提高26％
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11
在纺织行业的应用
1、减量处理 减量处理主要是改善织物的柔软、弹性 和悬垂性。棉织物经过纤维素酶整理后 , 手感和外观可以有很大的改善 ,织物的硬 挺度和刚性降低, 光滑度和悬垂性提高 , 能使织物获得更好的手感。
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6
02
纤维素酶的应用
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7
在食品行业的应用
纤维素酶在食品工业上的应用更为广泛。 如用于豆腐生产中，能提高出品率 10%； 用于制备速溶茶，可有效提高速溶茶的提 取率；用于果蔬榨汁，能大大提高出汁率； 用于大豆的提取，可提高优质蛋白得率， 还可回收豆渣中的蛋白和油脂；用于淀粉 的制造，能缩短制造时间，提高淀粉的出 品率；用于烟草生产，改善烟草品质；用 于酒的酿造，提高出酒率 3%～5%；用于 酱油的发酵，能提高酱油得率，改善酱油 的风味和品质等
纤维素酶稳定性的研究
纤维素酶稳定性的研究一．背景介绍纤维素是地球上最丰富、最廉价的再生资源。
有资料表明 ,全世界每年的植物体生成量达1500亿吨干物质 ,其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨。
纤维素的基本单位是葡萄糖 ,但由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造 ,其外围又被木质素包围着 ,要把它水解成可利用的葡萄糖非常困难。
所以到目前为止仍没有得到很好地利用。
当前 ,新能源、新食品资源的开发利用是世界各国都在研究的重大课题 ,因此 ,纤维素酶的研究成为其主要组成部分。
纤维素是一种多糖, 是葡萄糖以β- 1,4-糖苷键结合的聚合物, 在自然界中储量极其丰富, 在纤维素酶的催化条件下可分解产生二糖或葡萄糖, 纤维素的利用目前尚未完全开发, 造成资源及能源的巨大浪费。
为了更好地利用纤维素, 愈来愈多的国内外学者开始关注纤维素酶的研究与应用, 期望能借助纤维素酶将地球上最丰富(占全球总生物量 80%)、最廉价的可再生资源纤维素转化为能直接利用的能源和资源。
现在纤维素酶的应用已扩展到食品发酵、医药、纺织、日用化工、造纸、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域, 其应用前景十分广阔。
[1]1. 纤维素酶的组成纤维素酶是指 3种起协同作用的一组酶的总称 ,现已确定纤维素酶主要组分如下: 内切型葡聚糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶、纤维二糖酶。
[2]2. 纤维素酶的特性2.1 内切型葡聚糖苷酶也称 Cx酶、CMC酶。
它以随机的形式在纤维素聚合物内部的非结晶区进行切割 ,对末端键的敏感性比间键小。
其主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖等带非还原性末端的小分子纤维素。
[2]2.2 外切型葡萄糖苷酶又叫纤维二糖水解酶或微晶纤维素酶。
该酶在天然纤维素的降解过程中起主导作用 ,它能从纤维素链的还原或非还原性末端切割糖苷键 ,生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。
[2] 2.3 纤维二糖酶也称β2 葡萄糖苷酶 ,简称 BG。
它能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。
纤维素酶研究进展及固定化技术
纤维素酶研究进展及固定化技术摘要: 纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。
传统上将其分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。
纤维素酶属于糖苷水解酶类，近年来，根据氨基酸序列的同源性以及纤维素酶结构的相似性，将其分成不同的家族。
本文介绍了纤维素酶的研究进展，主要包括纤维素酶的性质及作用机理，应用与发展趋势，来源及生产技术，分离纯化方法，最后介绍几种常用的纤维素酶固定化方法。
关键词: 纤维素酶；研究进展；固定化引言：纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。
纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。
自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了，随着在工业上的广泛应用，特别是在纺织工业、能源工业上的应用，纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。
近年来有关纤维素酶的研究，包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能，以及酶蛋白的基因调控等诸多方面都取得显著进展。
到目前为止，登记在Swiss-Protein数据库的纤维素酶的氨基酸序列有649条，基因序列有433条。
我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代，迄今已有50多年的历史。
在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、基因的克隆与表达、纤维素酶的固定化，以及纤维素酶在纺织、能源等方面的应用都取得较大进展。
1 纤维素酶的性质及作用机理纤维素酶分子的大小因来源不同而不尽相同，三大类酶分子量一般在23Kda～146Kda之间。
多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化，糖基与蛋白之间以共价键结合，或呈可解离的络合状态。
糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解，而纤维素酶正是由于糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异，导致酶的多形式和分子量的差别。
通过比较分析，人们发现许多不同纤维素酶间表现出一定的同源性，且纤维素酶分子普遍具有类似的结构。
纤维素酶作用
纤维素酶作用纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，它由纤维素分子组成，这些分子之间通过氢键相互连接形成纤维状结构。
纤维素酶是一类能够降解纤维素的酶类，它在植物生物质转化和生物质能源利用中具有重要的作用。
纤维素酶主要包括β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖微晶酶和纤维素酶混合体等，它们通过切断纤维素分子的β-1,4-葡聚糖链来分解纤维素。
纤维素酶的作用过程可以分为两个步骤，即纤维素的固定和纤维素链的水解。
在固定步骤中，纤维素酶通过识别并结合纤维素分子，将其固定在酶的活性位点上。
这一过程是通过纤维素酶的结构域实现的，它们与纤维素分子的结合点之间存在各种非共价键，如氢键、疏水相互作用和静电相互作用等。
通过这些键的形成，纤维素酶能够与纤维素分子形成特异的结合，从而实现纤维素的固定。
在水解步骤中，纤维素酶通过切断纤维素分子的β-1,4-葡聚糖链来分解纤维素。
这一过程是通过纤维素酶的催化作用实现的，它们能够使水分子攻击纤维素分子的β-1,4-葡聚糖链，并将其水解成低聚糖。
纤维素酶的催化作用包括两个关键步骤，即切断和再结合。
在切断步骤中，纤维素酶将水分子引入纤维素链的内部，并切断β-1,4-葡聚糖链的连接。
在再结合步骤中，纤维素酶将切断的β-1,4-葡聚糖链与水分子重新结合，形成低聚糖。
纤维素酶的作用可以应用于多个领域。
首先，纤维素酶能够提高生物质的降解效率，促进植物生物质转化为生物能源的过程。
这对于生物质能源的利用具有重要的意义，可以减少对化石燃料的依赖，降低温室气体的排放。
其次，纤维素酶可以应用于食品工业，用于酿造和发酵等过程中的纤维素去除。
此外，纤维素酶还可以用于纸浆和纤维素制品的生产，提高纤维素材料的可加工性和品质。
纤维素酶的研究和应用正处于快速发展的阶段。
随着对生物质能源需求的不断增加和生物技术的进步，纤维素酶的性能和应用领域将得到更多的拓展。
通过对纤维素酶的深入研究，可以提高其催化效率和稳定性，提高纤维素的降解效率，促进生物质能源的可持续利用。
纤维素酶固定化研究
第 ５期
２０ ０ ８年 １ ０月
哈 尔 滨 理 ］ 二大 学 学 报 Ｊ ０ＵＲＮ ＡＬ ＨＡＲＢ Ｎ ＵＮＩ Ｉ Ｖ．Ｓ Ｉ Ｃ ．＆ Ｔ Ｈ． ＥＣ
Ｖｏ ． ３ ＮＯ ５ １１ ．
Ｏｃ ． ０ ｔ，２ ０８
纤维素 酶 固定化研 究
董学卫 ， 朱启 忠，． 于秀敏 ， 吕新萍 ， 徐 国英 ， 于 涛
纤维 素是 光合作 朋 的产 物 ， 有 大量 关 于 将纤 现 维素降解 为葡 萄糖 ， 后生产酒 精的物 理 、 随 化学 及生
物的方法 ． 丰 维素 酶降解纤 维素 的选择性 高 、 利， 纤 ｊ 反
性， 广泛 厢 于 废水 处理 、 农业 、 药 、 工 、 品等 领 医 化 食
域 ． 虽然研 究 表 明 ， 聚糖 是 酶 固 定 化 的优 良载 壳
酶 为 ３ ３ｍ ｌ 与游 离酶相 比 ， 固定化 纤维素 酶热稳 定性 明显提 高， 具有 良好 的操作 和存 储稳 ． ． 该 并
定性．
关 键词 ： 乙二 醇改性 壳聚糖 ；纤维素酶 ；固定化 ； 聚 裁体 中图分类 号 ： ５ Ｑ５ 文献标 识码 ： Ａ 文章编号 ：１０ — ６３ ２０ ）５ ０ １— ５ ０ ７ ２８ （０ ８０ — １８ ０
（ｈ 大学威海分梭 海 洋学院， ｉ东 山东 威海 ２４ ０ ） ６ ２９
摘 要 ： 采用 交联 法制备 了聚 乙二醇 改性 壳聚糖 （ Ｅ Ｐ Ｇ—Ｃ ） 体 ， Ｓ载 并将其 用于 固定 纤维 素酶．
探 讨 了载体制备 过程 中的 几种主要 影响 因素 、 纤维素酶 固定化 的影 响 因素 ， 并对 固定化纤 维素酶 的
性质进 行 了讨论 ． 结果表 明 ， 固定化 酶最适 ｐ 值 比原 酶 降低 ， Ｈ 最适 温度 为 ６ ｃ 比游 离酶 高 ｌ℃ ． ０Ｃ， ０ 在ｐ Ｈ值 为 ５０ 温度 ４ 时 ， ．， ０ 固定化 酶对羧 甲基 纤 维素钠 盐的表 观 米 氏常数 为 ７２ｍ ／ ， ． ｇ Ｌ 而游 离
酶工程实验报告六(纤维素酶的固定化及其性质测定)
3、用注射器将上述混合液取20ml（各取四次）逐渐滴入200mlCaCl2溶液的三角瓶中
6、反应混合物物保温30min后，于各个浓度底物试管中加入3mLDNS试剂终止液，迅速振荡均匀。
（1）于游离酶对照中加入0.5 ml的酶液。
（2）于固定化酶对照中加入2.00mLCMC-Na溶液。
7、混合后将各个实验组的三支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水19.5mL。摇匀，在540nm处读取OD值。
④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5、实验结果与数据处理：
5.1实验数据与结果：
表一固定化酶（3.5%）与游离酶稳定性的比较
保温时间（min）
吸光度OD540、酶活（u/g）、相对酶活(%)
固定化纤维素酶酶
游离纤维素酶酶
10 0.0375 639.04 33.63 0.0585 7586.50 65.23
②酶稳定性比较：由图三可看出在反应30min以后，游离酶的酶活稳定性保持升高到40min达最大酶活，之后酶活（相对活性）急剧下降（曲线斜率较陡曲）；而固定化纤维素酶的酶活从20min后保持平缓的下降趋势（斜率较缓），即稳定性较高。
③不同浓度的海藻酸钙对固定化酶性质影响：随着海藻酸钙的浓度由：2.5%、3.5%、4.5%、5.5%升高，呈现增后减的趋势，固定化纤维素酶酶活性在3.5%达最大相对酶活性100%。
基于聚乙烯醇／Fe2O3纳米颗粒的纤维素酶固定化
关键词
纤维素酶 ；固定化 ；聚乙烯醇 ； ｅＯ 纳米颗粒 Ｆ：
Ｑ ９ ５５ 文献 标识 码 Ａ 文章编号 ０ ５ －７ ０ ２０ ）８１６ －５ ２ １０ ９ （０ ８ ０ —５４ ０
中图分类号
纤 维素酶 可用 于将 纤 维素转 化 为可发 酵糖 ， 进而 生产 燃料 乙醇 ．由于 天 然纤 维素 酶 多 为一 次性 直
接使用 ， 使用成本高 ， 阻碍了该转化过程的工业化 ．采用纤维素酶 的固定化 ， 有利于酶 的回收和再
利用 ，有望解 决该 酶 生产应 用 的实 际 问题 ． 现有纤 维 素酶 的固定方 法多 是通 过双 功 能试剂 将纤 维素 酶化 学交 联在 固体 载体 上 ， 而 提 高 了纤 从 维素 酶 的稳定 性 和重复 使用 率 ＇．由于 纤维 素 酶 的底 物 是 水不 溶 性 的 ， 纤 维 素 酶 直接 化 学 交联 在 ３ Ｊ 将
用物理交联作用将纤维素酶固定 ， 并对 固定化酶的特点和固定化效果及一些影 响因素进行分析 ， 以期
提供 一种 固定 化纤 维素 酶 的新 方法 ．
收稿 日期 ： ０ ８ －１ ２ ０ ￣１２ ．
基金项 目： 湖南省农业 生物 纳米 技术 重大专 项基 金 （ 准号 ： ３ Ｋ １０ ） 湖南省科 技 计划项 目基 金 （ 准号 ： ０ ７ Ｔ １３ 批 ０Ｎ Ｙ ０ １ 和 批 ２０Ｆ３０ ）
酶固定化 ．采用透射 电镜 、红外光谱仪 、 动样 品磁 强度计对 固定化酶 复合 体进行 了表征 ，结果显示 ，固定 振 化酶 复合 体为大小约 １ ｍ 的微凝胶 团 ，内含 １ １ 左右 的 Ｆ ： 。纳米颗粒 ．研 究影响 固定化 因素后 发现 ， ０１３ １ １ ｅＯ 当ｐ Ｈ为 ６ ，固定化时 间为 １ ， １ｈ 纤维素 ￣／ Ｖ Ｐ Ａ质量 比为 ４， Ｖ ／ ｅ 量 比为 ５ Ｐ ＡＦ 质 ０时 ，固定化纤维 素酶效果 最好 ． 通过该方法 固定后酶 活回收率达 ４ ％ ， ２ 酶水解效率 显著提 高 ， 过 ５次反应后 的固定化酶相对酶 活力 经 保留 ５ ％以上．因此 ， ０ 基于聚 乙烯醇／ ｅＯ 纳米颗粒 的纤维素酶 固定有利 于酶的循环 使用并显 著提高酶 的 Ｆ： 。
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纤维素酶载体的选择试剂：硫酸亚铁（FeSO4·7H2O），氯化铁（FeCl3·`6H2O），氨水（NH3·H2O），聚乙二醇（PEG），高纯氮，正硅酸乙酯(TEOS)，丙酮（CH3COCH3），羧甲基纤维素纳（CMC）3,5—二硝基水杨酸（DNS），3—氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），丙三醇（C3H8O3），磷酸氢二钠（Na2HPO4·H2O）柠檬酸（C6H8O7·H2O），纤维素酶，去离子水，甲醇和乙醇为分析纯。
仪器：超声波清洗机，真空干燥箱，可见分光光度计，PH计，恒温水浴振荡器氨基硅烷化磁性纳米复合载体的准备采用化学共沉淀法制备纳米Fe3O4颗粒。
以Fe2+和Fe3+摩尔比1:2将8.34gFeSO4·7H2O 和16.23g FeCl3·`6H2O溶于300ml去离子水中，加入4gPEG，置于三口烧瓶中，在氮气保护下逐步升温至70℃，然后滴加50ml25%的氨水，在450r/min下搅拌反应1h，水浴逐步升温至85℃，保温1h，蒸发过量的氨水，冷却至室温后，在3800Gs磁场条件下分离，并用无水乙醇和去离子水反复洗涤。
用无水乙醇分散定容至200ml，4℃冰箱保存备用。
去一定量制备的Fe3O4颗粒于异丙醇、去离子水和氨水的混合液（100:20:3）中，滴加一定量的TEOS，室温下搅拌12h，得到的产物用磁场分离，去离子水反复洗涤，真空干燥后得到SiO2包裹的纳米磁性微球。
取2gSiO2纳米磁性微球、2.5ml水和10mlAPTES加入到250ml的甲醇中，超声分散30min。
然后在三颈瓶中与150ml丙三醇混合，在85~90℃下，快速机械搅拌3h。
磁场分离，用甲醇和去离子水反复洗涤数次，得到表面氨基硅烷化的磁性载体。
纤维素酶的固定化分别取25mg的氨基化纳米磁性载体，加入一定浓度的戊二醛3ml，室温下放入摇床（120r/min）中反应2h，磁场分离，用去离子水反复洗涤。
将戊二醛活化的纳米磁性载体置于3ml一定PH值的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液中，然后加入不等量的纤维素酶。
在一定温度下，固定化反应一定时间后磁场分离，在用去离子水反复洗涤，直至上清液中检测不到蛋白质为止。
纤维素酶固定化含量的测定采用Bradford法测定上清液中游离酶蛋白含量，并根据加入蛋白的量换算成固定于磁性微球上的蛋白量。
固定化纤维素酶活性测定使用DNS法测定固定化纤维素酶的CMC酶活。
为了确定固定纤维素酶的最佳条件，以某以参数下的最大酶活为100%计，取相对酶活进行计算。
烟末的制备及预处理将废次烟叶去梗后，在100℃的烘箱中烘干2h，除去水分后研磨成粉末，称取40g烟末，加入350ml去离子水，在室温下搅拌2h，让烟叶中的水溶性杂质，如无机盐、糖类、尼古丁、苹果酸等溶于水中，抽滤后随滤液除去，滤渣留作做茄尼醇提取试验用。
烟草酶混合物料在保持其他条件不变的情情况下分别改变纤维素酶用量、PH、水解温度、底物质量分数和酶水解时间进行单因素实验；通过多组实验对水解条件进行优化。
茄尼醇含量的测定仪器及试剂：LC—高效液相色谱仪，SPD—6A V紫外线检测仪，C—R3A色谱数据处理机。
茄尼醇标准品，提纯的正己烷，正己烷加硫酸和硝酸搅拌过夜，用硫酸洗至无色，再水洗，脱水，蒸馏，取中段80%使用。
色谱柱：硅胶柱Shim—pack CLC—SLL（4um，5mm i.d.*150mm）；柱箱温度：30℃；流动相：正己烷—异丙醇（体积比为98:2）混合液，流速0.6mL/min;检测波长：215nm。
样品处理：取适量烟草叶提取物，精密称定，用提纯过的正己烷溶解定容，取5uL进样测定。
色谱条件的选择：选择正己烷—异丙醇混合液为流动相，考察了检测波长和柱箱温度等条件对分离效果的影响。
茄尼醇在200nm有最大吸收，205nm处有较大吸收，在215nm处的吸收只有200nm处的1/3，但由于检测波长为200nm和205nm时仪器难于稳定，因此选择检测波长为215nm；柱温对分离和出峰时间都影响很大，需要恒温；线性关系：精密吸取茄尼醇标准溶液（质量浓度为0.964g/L）1uL，3uL，5uL，7uL和10uL 进样测定，以峰面积（Y）对茄尼醇质量（X，ug）进行线性回归，在1ug~10ug，线性方程为Y=166204X-3253,相关系数为r=0.9997。
精密度：取同一样品溶液，重复进样5次，RSD为1.3%。
回收率试验：取同一样品溶液6份，精密加入确定量的茄尼醇标准溶液，定容后，分别进样测定，结果列于表中，茄尼醇的平均回收率为98.1%，RSD为1.9%。
中压层柱纯化茄尼醇仪器，试剂及原料：电子天平，高速离心机，高效液相色谱仪，色谱柱，磁力搅拌器，中压层析柱系统，硅胶，活性炭，聚乙烯基吡咯烷酮，氧化铝，层析氧化铝，丙酮，6号溶剂油，乙腈，异丙醇，茄尼醇标准品。
采用配有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪对茄尼醇粗品溶液进行分析，结果如图1所示，由图可以看出，茄尼醇粗品中所含的大部分杂质的吸收波长在300~600mm之间，说明他们都为有色杂质；另外，这些杂质的保留时间均小于6min，说明它们的极性均较大。
为了去除这些强极性色素类杂质，参考已有报道的天然活性成分中色素类杂质去除方法，设计了如下方案：称取茄尼醇粗品10.0g，加入100ml6号溶剂油溶解，溶液平均分成5分，其中4份分别加入300~400目的层析硅胶，颗粒状活性炭，聚乙烯吡咯烷酮和氧化铝各2.0g，用磁力搅拌器搅拌2h，离心，取上清液，另外1分溶液不加任何吸附剂，用作对照，上述5份溶液采用HPLC测定茄尼醇含量。
不同吸附剂对茄尼醇和色素类杂质的吸附率见表，其中吸附剂对色素类杂质的吸附率用下列公式计算：式中P——吸附剂对色素类成分的吸附率；V1——对照溶液三维色谱的体积积分（0~6min，300~600nm）；V2——吸附后溶液三维色谱的体积积分（0~6min，300~600nm）。
从去除色素的角度考虑，良好的吸收剂应该少吸附或者不吸附茄尼醇，且易吸附色素类成分，从表的结果可以看出，4种吸附剂对茄尼醇粗品的色素均有吸附作用，其中活性炭，氧化铝和硅胶对色素的吸附率较高，且三者差别不大，PVP对色素的吸附率较小。
活性炭对茄尼醇的吸附率为32.2%，因为活性炭对低级性物质吸附作用强，多为不可逆吸附，对于属于低级性化合物的茄尼醇来说，用活性炭来吸附脱色，势必造成茄尼醇的大量损失；PVP 虽然对茄尼醇的吸附率低，仅为15.1%，但色素的去除效果较差；硅胶和氧化铝对茄尼醇的吸附率分别为46.1%和40.2%，但属于可逆吸附，茄尼醇可以被溶剂洗脱下来。
硅胶为层析试剂，价格较高，使用的氧化铝是化学纯，价格较低。
综合考虑上述各个因素，选择氧化铝作为去除茄尼醇粗品中色素类杂志的吸附剂。
吸附溶剂的选择：精密称取茄尼醇粗品3份，每份10.0g，分别加入100ml的6号溶剂油和丙酮，搅拌，溶解，再加入5g氧化铝吸附脱色，用磁力搅拌器进行搅拌，吸附2h，离心，取上清液，HPLC检测。
结果表明，吸附后6号溶剂油溶液在300~600nm处的吸光度明显减小（氧化铝脱色后溶剂油溶液三维谱图见图2）；而丙酮溶液的吸光度无明显变化，说明6号溶剂油对杂质的吸附量大，因此我们选择6号溶剂油作为吸附溶剂。
吸附时间和吸附剂用量的选择：精密称取10.0g茄尼醇粗品5份，分别加入100ml的6号溶剂油，搅拌，溶解，再分别按照茄尼醇粗品与氧化铝的质量比1:2,1:4,1:6,1:8,1:10加入氧化铝吸附脱色，吸附60min，每隔10min取样，离心，取上清液，HPLC检测，结果见图3 由图3可知，使用不同量的氧化铝脱色，随着吸附时间的延长，溶液中的茄尼醇相对峰面积均逐渐增加，说明色素类杂质逐渐被吸附，在40min时增加趋势明显变缓，因此选择吸附时间为40min。
由图3还可知在吸附40min时，随着氧化铝用量的增加，茄尼醇相对峰面积逐渐增加。
当茄尼醇粗品与氧化铝的质量比为1:8时，茄尼醇相对峰面积达到最大值，说明在此条件下可被氧化铝吸附的色素累杂质基本被完全吸附，继续增大氧化铝用量，茄尼醇相对峰面积几乎不再增加，为了在保证色素累杂质被充分吸附的前提下控制氧化铝的消耗量，选择茄尼醇粗品与氧化铝的质量比为1:8在此条件下脱色后的溶液经过浓缩，浓缩物的纯度达到67.26%。
洗脱机用量的影响：因为氧化铝在吸附色素类成分的同时，也吸附了部分茄尼醇，因此须将被氧化铝吸附的茄尼醇用溶剂洗脱下来。
精密称取10.0g茄尼醇粗品，加入100ml的6号溶剂油，搅拌，溶解，再加入氧化铝80g，自然吸附40min后，用6号溶剂油洗脱，每次100ml，洗脱液减压浓缩至干后HPLC测定茄尼醇含量，结果见图4.由图4可知，随着洗脱剂体积的增加，茄尼醇收率逐渐增加，当洗脱剂与茄尼醇粗品的比例达到100:1（ml/g）时，茄尼醇收率可达到92.8%，继续增加洗脱剂体积，茄尼醇收率增加趋势变缓，因此选择洗脱剂与茄尼醇粗品比例为100:1（ml/g）。
经脱色处理后的茄尼醇溶液与洗脱液合并，浓缩，经过测定，在最佳氧化铝脱色条件下，茄尼醇平均收率92.8%，纯度为68.32%（色谱图见图5b）。
中压层柱吸纯化茄尼醇：连续中压层析系统构成：玻璃层析柱，柱长50cm，内径5.5cm，内装650g300~400目层析用中性氧化铝，采用干法装柱，用砂芯板和法兰封口。
用柱塞泵泵入6号溶剂油平衡层析柱，取氧化铝脱色得到的茄尼醇样品40g，用80ml6号溶剂油溶解后泵入层析柱，用6号溶剂油—丙酮（30:1）为洗脱剂洗脱，柱的使用压力为1.0MPa，定量分批连续接收洗脱液，每份200ml，用薄层层析跟踪分析，合并含有茄尼醇的洗脱液，回收溶剂至干，经HPLC测定茄尼醇纯度为94.37%（色谱图见图5c），收率为78.6%。