综合实验讲义-微生物胞外多糖纯化2012年11月
胞外多糖
胞外多糖(EPS extracellular polysaccharide)早在50年代人们就认为胞外多糖可能是青枯菌的致病因子，随后围绕青枯菌胞外多糖的病理学意义进行了大量研究。
H u sain和Kelman比较了青枯菌自发无毒突变株和野生型菌株的特点，发现自发无毒突变株不产生胞外多糖，致病力丧失，因此认为胞外多糖在致病过程中可能具有重要作用l 5l。
青枯菌的胞外多糖是由多种化学物质组成的复合物，其中主要的组成成分是氮乙酞半乳糖醛酰胺。
研究发现，不同青枯菌小种的胞外多糖的组分有所不同，同一小种也存在不同类型的胞外多糖。
一些研究显示，一个称为EPS I的胞外多糖，可能与Ralstonia solanacearum的致病性最为相关I6J EPS I合成的特异突变研究显示，即使直接注入大量的突变菌细胞进入植物茎组织，与非突变菌比较，其植株的萎蔫和死亡程度也很低。
通过土壤接种试验也显示，尽管突变菌在维管组织中繁殖，但植株的发病很轻。
近年来的研究发现，胞外多糖的合成受l6 kI1的eps操纵子调控，涉及l0个调控基因产物和3个不同的调控信号，这种严谨的调控也从另一个角度说明EPS I对病原菌本身的重要性以及在病原菌对植物的致病性中的重要作用『青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearu‘)或称青枯菌引起许多重要经济作物如烟草、花生、番茄等植物的萎焉病。
主要通过土壤传染病害，它的寄主范围很广泛，有33科100多个种，危害茄科植物为最多“。
青枯菌毒力株能产生胞外多糖，用特殊固体培养基培养时形成两种菌落形态即易变的和固定的，前者产生胞外多糖有毒力，后者很少产生这种多糖。
为此，日本科学工作者研究了这种胞外多糖的组成以及它与致病性的关系。
发现这种多糖是一种混合物一主要由N一乙酸半乳糖胺(2一氨基2半乳糖)和少量鼠李糖、葡萄糖以及某些简单肤所组成。
事实上，这是同型一N一乙酞半乳糖胺葡聚糖的一个例证。
其化学性质还不清楚，但认为这种胞外多糖与毒力有关系‘，这是因为它阻滞寄主植物维管束组织，导致水分输导的困难。
多糖实验报告
一、实验目的1. 掌握多糖的提取方法；2. 了解多糖的鉴定方法；3. 分析实验过程中可能出现的误差，提高实验技能。
二、实验原理多糖是一类高分子碳水化合物，广泛存在于自然界中，如植物、动物和微生物等。
多糖具有多种生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等。
本实验通过提取植物材料中的多糖，并对其进行鉴定，以了解多糖的提取与鉴定方法。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：玉米淀粉、纤维素酶、葡萄糖、苯酚、浓硫酸等；2. 实验试剂：95%乙醇、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、碘液、硫酸铜、硫酸钼酸铵等；3. 仪器：组织捣碎机、电热恒温水浴锅、分析天平、移液管、滴定管、比色皿等。
四、实验方法1. 多糖提取（1）称取一定量的玉米淀粉，用蒸馏水溶解，搅拌均匀；（2）加入适量的纤维素酶，置于电热恒温水浴锅中，恒温反应一定时间；（3）反应结束后，用滤纸过滤，收集滤液；（4）向滤液中加入适量的氯化钠，使多糖沉淀；（5）将沉淀物用95%乙醇洗涤，去除杂质；（6）将沉淀物干燥，得到粗多糖。
2. 多糖鉴定（1）碘液鉴定：取少量粗多糖，加入碘液，观察颜色变化。
若呈蓝色，则表明存在多糖；（2）苯酚-硫酸法鉴定：取少量粗多糖，加入苯酚试剂，滴加浓硫酸，观察颜色变化。
若呈紫色，则表明存在多糖；（3）硫酸铜-硫酸钼酸铵法鉴定：取少量粗多糖，加入硫酸铜试剂，滴加硫酸钼酸铵试剂，观察颜色变化。
若呈蓝色，则表明存在多糖。
五、实验结果与分析1. 多糖提取结果经过实验，从玉米淀粉中成功提取出粗多糖，提取率为30%。
2. 多糖鉴定结果通过碘液、苯酚-硫酸法和硫酸铜-硫酸钼酸铵法对粗多糖进行鉴定，均呈现阳性结果，说明粗多糖中确实存在多糖。
3. 实验误差分析（1）纤维素酶的添加量对多糖提取率有较大影响，实验过程中应严格控制；（2）洗涤过程中，95%乙醇的浓度对杂质的去除有较大影响，应选择合适的浓度；（3）实验过程中，温度、时间等条件对多糖提取率有较大影响，应严格控制。
胞外多糖实验方案
泡菜制作实验以甘蓝作为原料，姜、蒜和红辣椒作为辅料，白胡椒作为调味料，制备直投式的甘蓝泡菜。
1 所需原料：甘蓝所需辅料：姜（50g），红辣椒（25g），大蒜（2%），花椒（0.05%），酒食盐（20%）（用于盐封）2 试验材料预处理原料、辅料去除不可食部分，修剪清洗干净，晾干，然后切块（片），漂烫（漂烫条件：85℃左右，3min），沥干。
3 直投式乳酸菌发酵泡菜原料、辅料沥干后以适当的比例搭配，与适量已清洗干净的白胡椒一同装入泡菜坛中，松紧适中。
然后将含乳酸菌的盐水注入至装满甘蓝的泡菜坛中，至坛口边沿1cm处，泡菜坛子中料液比大致为1：1，加盖后用2%的盐水水封，发酵温度25℃。
通常情况下成品泡菜的pH控制在4.2左右效果最佳。
胞外多糖含量测定所需试剂：80%三氯乙酸：80克TCA加20克水使之溶解，可置冰箱中长期储存；6%苯酚：6克苯酚加94克水使之溶解；浓硫酸：分析纯，95.5%；无水乙醇，葡萄糖。
所需装备：透析袋(MWCO为8000～12000)，具塞试管，离心机(16000r/min)实验步骤：1. 葡萄糖标准曲线的制作（采用苯酚一硫酸法）:2. 乳酸菌胞外多糖的分离方法：取10mL泡菜发酵液在 100 ℃，15min加热灭酶，加入1.7mL 质量分数80%三氯乙酸（TCA），4 ℃，16000r/min离心30min 除去蛋白。
收集上清液，加入三倍体积的无水冷乙醇（调节终浓度在10％～30％（30%）），沉淀过夜。
在4℃下 16000r/min离心20min ，收集沉淀物，并用蒸馏水溶解。
4℃透析24h ，保存溶液。
3.胞外多糖合成量的测定: 取 2. 0 mL 于具塞试管中, 加 6% 苯酚1. 0 mL 摇匀, 迅速加入浓硫酸 5. 0 mL, 同标准曲线的操作,测定吸光度后查标准曲线得多糖的浓度, 再乘以稀释倍数,即得多糖的合成量。
新的透析袋：可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净即可。
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》范文
《乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究》篇一一、引言乳酸菌是一类重要的微生物，其产生的胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）具有多种生物活性，包括增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化等作用。
因此，对乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化及免疫活性研究具有重要的科学意义和应用价值。
本文旨在探讨乳酸菌胞外多糖的筛选、纯化方法及其免疫活性的研究进展。
二、乳酸菌胞外多糖的筛选1. 菌种筛选首先，从各种乳酸菌中筛选出能够产生胞外多糖的菌种。
通过观察菌株在培养基上的生长情况、产糖量的多少以及产糖速度的快慢等因素，初步筛选出具有产糖潜力的菌种。
2. 发酵条件优化对初步筛选出的菌种进行发酵条件的优化，包括温度、pH值、接种量、培养时间等因素的调整，以提高胞外多糖的产量和质量。
三、乳酸菌胞外多糖的纯化1. 初步纯化采用离心、沉淀、超滤等方法对发酵液中的胞外多糖进行初步纯化，去除杂质和未完全分解的物质。
2. 高级纯化通过凝胶过滤、离子交换、高效液相色谱等方法对初步纯化后的胞外多糖进行进一步纯化，得到较为纯净的胞外多糖样品。
四、免疫活性研究1. 细胞免疫实验通过细胞免疫实验，观察乳酸菌胞外多糖对免疫细胞的影响，包括刺激淋巴细胞增殖、促进细胞因子分泌等作用。
2. 动物实验通过动物实验，观察乳酸菌胞外多糖对动物免疫功能的影响，包括增强体液免疫、细胞免疫等作用，以及其对肿瘤的抑制作用等。
五、结果与讨论经过筛选、纯化后的乳酸菌胞外多糖具有较高的纯度和生物活性。
在细胞免疫实验和动物实验中，均表现出较强的免疫增强作用，能够刺激免疫细胞增殖、促进细胞因子分泌，增强体液免疫和细胞免疫等作用。
此外，乳酸菌胞外多糖还具有抗肿瘤、抗氧化等作用，具有广泛的应用前景。
在研究过程中，我们还发现乳酸菌胞外多糖的产量和纯度受发酵条件、菌种类型等多种因素的影响。
因此，在今后的研究中，需要进一步探讨不同因素对乳酸菌胞外多糖产量和纯度的影响，以及不同来源的乳酸菌胞外多糖的生物活性差异等方面的内容。
应用微生物第一章 第三节 微生物胞外多糖及其应用
(3) 采用流加补充底物(淀粉、Glc或蔗糖)和氨水调节pH7.0， 可进一步促进分批发酵过程中的黄原胶合成。
3、黄原胶分离纯化
分离原理与方法
(1).乙醇、丙酮沉淀法 国内外常用方法，纯度高，溶剂回收是技术与成本的关 键
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二、微生物多糖的合成模式和生理学调控
2、不依赖于C55-Lipid-P糖基载体合成模式
肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)厌氧条件下 合成右旋糖酐(dextrans)即属该合成模式
(1). dextrans生物合成显著特点
1). 菌体生长和dextran生物合成以蔗糖为特异性底物； 2). 蔗糖诱导菌体细胞产生葡聚糖-蔗糖酶(胞外酶)； 3). 蔗糖做底物不进入菌体细胞。在胞外水解成葡萄 糖 和
4、质量标准
GB:食品添加剂黄原胶 粘度（CP）1％水溶液 剪切性能值6rpm.V/60rpm.V 干燥比重（％） 灰分（％） 总N含量（％）
≥600 ≥6 ≤13 ≤13 ≤1.5
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三、微生物多糖发酵研究
砷（As）含量（ppm）
≤3
重金属（以Pb计，ppm）
≤10
微生物指标
细菌总数（1g粉状产品）
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五、微生物胞外多糖的分子构型与性质
黄原胶的分子构型
一级结构：
黄原胶分子主链以β-1.4键构成纤维素骨架的线性结构， 侧链含羧酸带负电荷，反向缠绕主链，呈锯齿状
二级结构：
两条线性黄原胶分子靠氢键维系成右手双股螺旋结构
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三级结构：
双股螺旋结构间靠微弱的非共价键结合，排列成螺旋共聚体
综合实验讲义-微生物胞外多糖纯化2012年11月
水溶性功能多糖的分离纯化一、实验原理胞外聚合物（EPS，extracellular polymeric substance），是在一定环境条件下由微生物，主要是细菌，分泌于体外的一些高分子聚合物。
主要成分与微生物的胞内成分相似，是一些高分子物质，如多糖、蛋白质和核酸等聚合物。
EPS普遍存在于活性污泥絮体内部及表面，具有重要的生理功能，可将环境中的营养成分富集，通过胞外酶降解成小分子后吸收到细胞内，还可以抵御杀菌剂和有毒物质对细胞的危害。
EPS物质，尤其是胞外多糖物质，常被用作生物絮凝剂应用于污水处理中。
而分离纯化EPS物质中的多糖组分并分析其结构，成为目前的一个研究热点。
目前用来研究多糖类和糖蛋白类絮凝剂组成的方法较少。
由于对多糖的研究远没有像核酸及蛋白质那样成熟的方法，所以需要结合很多化学方法和仪器分析来测定糖的组成结构。
测定糖的组成就要将离子交换层析、凝胶层析薄层层析（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气质联用（GC-MS）等各种方法结合起来。
先将多糖粗品经交换层析、凝胶层析薄层层析，然后用HPLC检测糖的纯度，再将多糖酸水解后做TLC分析就可以知道多糖中含有几种单糖组分，然后将酸解后的产物做乙酰化衍生，通过GC-MS分析就可以知道多糖由哪几种单糖残基组成及各单糖残基间的比例。
有的学者还通过测定糖苷酶、蛋白酶、金属鳌合剂（如EDTA）和加热处理等对生物絮凝剂絮凝能力的破坏与否，来判断絮凝剂的化学组成。
Napoli 报道的Rhizabium合成的絮凝剂是纤维素，絮凝能力可被纤维素酶破坏。
而大多数的多糖类絮凝剂是杂多糖，Paecilomyces产生的絮凝剂是由半乳糖胺（galactosamine）组成的多糖，其中80％无取代基，8％的氮端被乙酰化，这种絮凝剂对热稳定，100℃处理也不失活。
Kwon. 报道从Pesalotiopsis sp.中分离出一种絮凝剂pestan，酸水解后发现其化学组成为葡萄糖：葡萄糖胺：葡萄糖醛酸：鼠李糖=100：3.5：1.6：1.3。
多糖的分离和纯化
多糖的分离和纯化⼀、多糖的分离和纯化多糖是极性极⼤的⼤分⼦化合物，提取时⼀般先将原料脱脂、脱⾊，然后⽤⽔、盐或稀碱⽔在不同温度下提取。
提取物浓缩后加沉淀剂(⼄醇、丙酮等)离⼼沉淀，沉淀部分可反复多次离⼼沉淀，以除去部分⽔溶性⾊素等杂质。
1．除蛋⽩⽤⽔或稀碱提取的多糖常含有蛋⽩质，常⽤的除蛋⽩质的⽅法有Sevag 法、三氟三氯⼄烷法、三氯⼄酸法等。
前两种多⽤于微⽣物多糖，后者多⽤于植物多糖。
Sevag 法是经典的除蛋⽩质⽅法，复杂、费时，且样品损失较⼤。
冯建林等⽐较了Sevag 法、三氟三氯⼄烷法、三氯⼄酸法、硫酸铵法及⽊⽠蛋⽩酶复合酶法除蛋⽩的效果，从蛋⽩残留量和多糖的得率两⽅⾯评价．认为三氯⼄酸法最好，但三氯⼄酸仍不能完全除去蛋⽩，建议三氯⼄酸法和Sevag 法结合使⽤。
2．脱⾊多糖中常含有⼀些⾊素(游离⾊素或结合⾊素)，根据其不同性质采取不同的去除⽅法。
常⽤的脱⾊⽅法有离⼦交换法、氧化法、⾦属络合物法、吸附法(纤维素、硅藻⼟、⾼岭⼟、活性炭等)。
D EA E⼀纤维素是⽬前最常⽤的脱⾊⽅法，通过离⼦交换柱不仅达到脱⾊⽬的，⽽且可以进⾏多糖的分离。
H2 O2：是⼀种氧化脱⾊剂，浓度不宜过⾼，宜在低温下进⾏，否则引起多糖的降解。
对于同时含有游离蛋⽩质和⾊素的多糖，可通过⽣成⾦属络合物的⽅法同时除去蛋⽩和⾊素，即加⼊费林试剂⽣成不溶性络合物，经分离后⽤阴离⼦交换树脂分解络合物。
吸附脱⾊法也常⽤，如通过活性炭、⾼岭⼟、硅藻⼟柱达到脱⾊的⽬的。
3．多糖的分级采⽤⼀般⽅法提取的多糖，通常是多糖的混合物，即是多分散性的，其不均⼀性表现在化学组成、聚合度、分⼦形状等的不同。
分级可以达到纯化的⽬的，可按分⼦⼤⼩和形状分级(如分级沉淀、超滤、分⼦筛、层析等)，也可按分⼦所带基团的性质分级(如按电荷性质分级的电泳、离⼦交换层析等)。
(1)分级沉淀利⽤分⼦⼤⼩和溶解度不同进⾏分离，常⽤的有两种⽅法，即有机溶剂沉淀法和季铵盐或硫酸铵法。
多糖的分离纯化及分析
多糖的分离纯化及分析一、多糖的提取方法（一）溶剂提取法1、水提法水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法.多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂.用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5h，多糖的质量分数和得率均较高.2、酸碱提法有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。
有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。
与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。
3、超临界流体萃取法超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术.（二）生物酶提取法酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。
此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。
（三）超声提取法超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。
超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。
（四）微波提取微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。
二、多糖的分离纯化（一）多糖的分离采用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分级的方法可达到纯化的目的．可按溶解性不同进行分级、按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等)，也可按分子所带基团的性质分级．1、按溶解性不同分离（1）分步沉淀法分步沉淀法是根据不同多糖在不同浓度低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，从小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分步沉淀．（2）盐析法盐析法是根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同而将其分离的一种方法。
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水溶性功能多糖的分离纯化
一、实验原理
胞外聚合物（EPS，extracellular polymeric substance），是在一定环境条件下由微生物，主要是细菌，分泌于体外的一些高分子聚合物。
主要成分与微生物的胞内成分相似，是一些高分子物质，如多糖、蛋白质和核酸等聚合物。
EPS普遍存在于活性污泥絮体内部及表面，具有重要的生理功能，可将环境中的营养成分富集，通过胞外酶降解成小分子后吸收到细胞内，还可以抵御杀菌剂和有毒物质对细胞的危害。
EPS物质，尤其是胞外多糖物质，常被用作生物絮凝剂应用于污水处理中。
而分离纯化EPS物质中的多糖组分并分析其结构，成为目前的一个研究热点。
目前用来研究多糖类和糖蛋白类絮凝剂组成的方法较少。
由于对多糖的研究远没有像核酸及蛋白质那样成熟的方法，所以需要结合很多化学方法和仪器分析来测定糖的组成结构。
测定糖的组成就要将离子交换层析、凝胶层析薄层层析（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气质联用（GC-MS）等各种方法结合起来。
先将多糖粗品经交换层析、凝胶层析薄层层析，然后用HPLC检测糖的纯度，再将多糖酸水解后做TLC分析就可以知道多糖中含有几种单糖组分，然后将酸解后的产物做乙酰化衍生，通过GC-MS分析就可以知道多糖由哪几种单糖残基组成及各单糖残基间的比例。
有的学者还通过测定糖苷酶、蛋白酶、金属鳌合剂（如EDTA）和加热处理等对生物絮凝剂絮凝能力的破坏与否，来判断絮凝剂的化学组成。
Napoli 报道的Rhizabium合成的絮凝剂是纤维素，絮凝能力可被纤维素酶破坏。
而大多数的多糖类絮凝剂是杂多糖，Paecilomyces产生的絮凝剂是由半乳糖胺（galactosamine）组成的多糖，其中80％无取代基，8％的氮端被乙酰化，这种絮凝剂对热稳定，100℃处理也不失活。
Kwon. 报道从Pesalotiopsis sp.中分离出一种絮凝剂pestan，酸水解后发现其化学组成为葡萄糖：葡萄糖胺：葡萄糖醛酸：鼠李糖=100：3.5：1.6：1.3。
Nam筛选的一株Aspergillus，经分析其分泌的絮凝剂含有30%的糖醛酸，20％的己糖胺和10％的中性糖。
目前已报道的多糖类絮凝剂组分如表2所示。
结构分析是了解多糖功能最基本的方法。
但是多糖链的无规则性及多变化性使得多糖结构分析非常复杂。
现在尚未得到多糖的单晶体，所以被广泛用来研究蛋白质的结晶学研究方法不能直接应用于多糖，只能通过对小寡糖的单晶研究及X-光衍射研究得到某些信息。
另外，核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）广泛应用于多糖的结构分析及构想分析上。
NMR可以提供的微观化学信息包括初级结构、立体结构及二级结构。
多糖的单链构象主要由单糖残基、连接方式及侧链基团决定。
糖链构象的复杂性是因为多糖
链内部的相互作用非常特殊以致多糖链在溶剂中很少分散成单链的，从而造成研究上的困难。
多糖类絮凝剂虽然是有效的生物絮凝剂，但目前对多糖类絮凝剂的结构测定还未有成型的技术。
在多糖结构测定中，多是将化学方法与仪器分析结合起来以确定其结构。
目前用来测定多糖一级结构的方法有Hakamori法、改进后的Hakamori法等。
Isobe采用薄层层析结合气相色谱法分析了Bacillus circulans产生的一种多糖，结构表明它是由鼠李糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖醛酸＝2：2：3：3组成，并用NMR分析了这四种单糖残基的连接方式。
刘紫娟采用Hakamori法结合NMR分析研究了Bacillus megterium A25所产絮凝剂BP25的组成结构，表明BP25由葡萄糖：甘露糖＝4：1组成，单糖残基间以α-（1，3）及α-（1，6）糖苷键连接。
本实验利用离子交换层析及凝胶过滤层析分离纯化Arthrobacter.sp（节杆菌）胞外多糖样品B41，并检测其纯度。
二、实验材料
1．主要仪器及试剂：
上海沪西仪器厂层析装置（层析介质：CM Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-500）、722分光光度计、无水乙醇、PEG 20000、葡萄糖、苯酚、硫酸、蒸馏水等
2．实验材料
Arthrobacter.sp（节杆菌）胞外多糖组分B41
三、实验内容
1. 苯酚-硫酸法测定总糖：
葡萄糖标准曲线的制作：100μg / mL葡萄糖溶液的配置，精确称取干燥的葡萄糖1 g，溶于50 mL蒸馏水中，溶量瓶定溶至100mL。
取1mL，溶量瓶定溶至100mL。
分别取该溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL(含糖10～50μg)置于10 mL试管中，加入50 g / L苯酚溶液0.5 mL 混合后，迅速加入2.5 mL浓硫酸，混合均匀后，室温放置30 min ，在波长490 nm处测定吸光度,空白对照以蒸馏水代替糖溶液。
然后以490 nm处的光吸收值为横坐标，以葡萄糖浓度为纵坐标绘制标准曲线。
2. ZL5-2的纯化
2.1 B41的预处理：
将B41溶于适量三蒸水中，装入透析袋三蒸水透析48hr，每8hr更换一次三蒸水，用硫酸－苯酚法检测透析液中无单糖存在，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥得B41，将B41（0.336g）溶于50mL 三蒸水中，离心，取上清备用。
2.2 CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析
层析柱（1×20cm），填料为CM Sepharose Fast Flow，上样量10mL，流速为0.5mL/min，2mL/管分部收集，先用蒸馏水洗涤两个住体积，再用0-1mol/L NaCl梯度洗脱两个柱体积，测定每管收集液的糖含量。
收集糖含量高的活性峰组分。
2.3 Sephacryl S-500凝胶过滤层析
将上步收集的活性峰组分在三蒸水中透析除盐24hr，PEG 20000浓缩，层析柱（φ1×100cm），填料为Sephacryl S-500，上样量0.5mL，流速0.1mL/min，1mL/管分部收集，测定每管收集液的糖含量。
收集洗脱液中的糖含量高的活性峰组分B41。
3. B41糖组分分析
取上述纯化多糖样品10mg加5mL 1mol/L硫酸2mol/L，密封试管100度水解4小时。
水解后样品进行用薄层层分析，用葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖等做标准样品。
展层剂：正丁醇：甲醇：氯仿:冰醋酸=12.5:4.5:5:1.5:1.5（v/v）
显色剂：苯胺-二苯胺溶液（二苯胺4g，苯胺4mL,85%磷酸混合溶解于200 mL丙酮溶液）4、糖醛酸的测定—硫酸-咔唑法
溶液配制：
标准曲线制作：
样品测定：
5、氨基糖测定溶液配制：
标准曲线制作：
样品测定：。