蛋白质的等电点测定及性质实验
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蛋白质的等电点测定及性质实验
一、实验目的
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法,并了解蛋白质的性质。
二、实验原理
蛋白质分子是两性电解质,当调节溶液的酸碱度,使蛋白质分子上所带的正负电荷相等时,在电场中,该蛋白质分子既不向正极移动,也不向负极移动,这时溶液的pH值,就是该蛋白质的等电点(pI)。不同蛋白质,等电点不同。在等电点时,蛋白质溶解度最小,容易沉淀析出。因此,可以借助在不同pH溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。
在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐,蛋白质即从溶液中沉淀析出,这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。蛋白质的盐析作用是可逆过程。由盐析获得的蛋白质沉淀,当降低其盐类浓度时,又能再溶解。而重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
三、试剂和器材
⑴高筋面粉、低筋面粉。
⑵ 1mol/L醋酸。(每组自配L醋酸、L醋酸)
⑶ %酪蛋白溶液。
称取克酪蛋白,放入烧杯中,加入40℃的蒸馏水,再加入50毫升1N氢氧化钠溶液,微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转到500毫升容量瓶中,并用少量蒸馏水洗净烧杯,一并倒入容量瓶。在容量瓶中再加入1N醋酸溶液50毫升,摇匀,再加蒸馏水定容至500毫升,得到略显混浊的、在NaAc溶液中的酪蛋白溶液。
⑷鸡蛋白溶液。
将80mL鸡蛋清与800mL蒸馏水混合均匀后,用洁净的多层湿纱布垫在漏斗上过滤,滤液即为鸡蛋白溶液(不能有不溶性物悬浮)。要现配现用,最好使用经过煮沸并封在容器中隔绝空气冷却的蒸馏水。
⑸质量分数为5%的CuSO
4
溶液。(每排3组合配)
⑹ (NH
4)
2
SO
4
饱和溶液。(确保有固体析出)
⑺天平、水浴锅、移液管、试管等。
四、操作步骤
1、蛋白质的等电点测定
⑴取5支同种规格的试管,编号,按表1顺序精确加入各种试剂,特别注意%酪蛋白溶液最后加入,然后逐一振荡试管,使试管混合均匀。此时1、2、3、
4、5管的pH值依次为、、、、。
⑵将上述试管静置于试管架上15min后,仔细观察,比较各管的浑浊度,将观察的结果记录于表格内,并指出酪蛋白的等电点。
注意:本试验各种试剂的浓度及用量均要求很准确,确保缓冲液的pH值准确;浑浊度可用-、+、++、+++等符号表示,最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。
表2-1 蛋白质的等电点测定表
试管号蒸馏水/mL 1mol/L醋
酸/mL
L醋酸/mL L醋酸/mL
%酪蛋白溶
液/mL
浑浊度
1
2
3
4
5
2、蛋白质性质实验
⑴蛋白质的盐析
在试管里加入1~2mL鸡蛋白的水溶液,然后逐滴加入(NH
4)
2
SO
4
饱和溶液,观
察现象(有无白色混浊产生)。滴加过程中不要摇动试管,现象不明显时,多加几滴硫酸铵饱和溶液。
把少量混浊倾入另一支盛有蒸馏水的试管里,观察白色混浊是否溶解。
⑵蛋白质的变性
在试管里加入2mL鸡蛋白的水溶液,沸水浴加热5min,观察现象。把试管里的下层物质取出一些放在水里,观察现象。
把试管里加入3mL鸡蛋白的水溶液,然后加入1mLCuSO
4
溶液,观察现象(有无淡蓝色絮状混浊沉淀产生)。把少量沉淀放入盛有蒸馏水的试管里,观察沉淀是否溶解。
⑶蛋白质发泡性
取100mL烧杯,装入5mL鸡蛋白的水溶液,插入1mL移液管,用吸耳球不断鼓入空气1min,观察发泡情况(泡沫数量、泡沫持续时间)。
另取100mL烧杯,装入5mL蒸馏水,插入1mL移液管,用吸耳球不断鼓入空气1min,观察发泡情况(泡沫数量、泡沫持续时间)。
3、面粉中面筋的粘弹性
⑴将20g高筋面粉加9mL水揉成面团(注意朝着一个方向揉捏)。另外将20g低筋面粉加9mL水揉成面团(注意朝着一个方向揉捏),要求揉捏有力。
⑵将上述揉捏好的面团静止15min以上。
⑶将上述静置好的面团,用手握住,不断在水中揉洗(注意朝着一个方向揉捏)。直至没有淀粉洗出为止,即无白色液体流下。
⑷将上述洗好的面团放置60min以上,使得表面水分挥发。
⑸用手揉捏上述两个面团,观察两个面筋的粘弹性及拉伸成薄膜的情况,并进行对比。
4、自主设计实验
根据兴趣爱好,3-6位同学为一组,查找相关资料,开展趣味自主设计实验,或者对在本实验基础上,进行扩展实验。
五、实验要求
1、记录各实验结果并解释相关实验现象。
2、在等电点时,蛋白质溶液为什么容易发生沉淀?
3、当实验结果与已知发生较大误差时,试着分析其原因。