实验植物组织中过氧化氢酶的活力测定-PPT精选文档
过氧化氢酶CAT活性测定
.过氧化氢酶活性测定 ------------ 紫外吸收法过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理】H2O2在 240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度 (A 240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与设备与试剂】1、材料小麦叶片等。
2、仪器设备研钵；离心机； 250ml 容量瓶；移液管（ 0.5ml 、 2ml 各 2支）；10ml 试管 3支；恒温水浴；紫外分光光度计；3、试剂0.2mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H 2O2（用 0.1mol/L 高锰酸钾标定）。
【方法】1.酶液提取：藻液接种后每隔 1d，取 40ml 藻液（取时需摇匀），于 4℃，于 8 500 r/min （10 000g）下离心 10min 收集藻体，用 0.1mol/L 、pH7.8 磷酸钠缓冲液 3mL重悬浮，然后用冰浴超声破碎细胞，破碎液在 4℃下 10200 r/min 离心 10min, 上清液即为SOD 和 CAT粗酶液。
2.酶活性测定取10ml 试管 3支，其中 2支为样品测定管， 1支为空白管，按表 2-14-1 顺序加入试剂。
表2-14-1紫外吸收法测定H 2O2样品液配置表管号S1S2S3管号S0S1S2粗酶液 (ml)0.20.20.2蒸馏水1.0 1.0 1.0 /mlpH7.8 磷酸 (ml) 1.5 1.5 1.5将 S0号管在沸水浴煮 1min以杀死酶液，冷却。
然后将所有试管在25℃预热后 ,逐管加入 0.3ml 0.1mol/L 的 H O，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm 下测定吸光度，22每隔 1min 读数 1次，共测 4min，待 3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定
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【高中生物】高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定
【高中生物】高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定原理过氧化氢酶广泛存在于所有植物组织中。
它能将过氧化氢分解为氧气和水，保护生物体免受过氧化氢的毒性影响。
测定过氧化氢酶的方法包括测压法、滴定法和分光光度法。
氧电极法是一种灵敏、快速的氧释放速率测量方法。
氧释放速率与过氧化氢酶活性成正比。
仪器药品氧电极记录仪电磁搅拌器超级恒温水浴注射器、微量注射器和容量瓶反应杯亚硫酸钠过氧化氢酶50mmol/l磷酸缓冲液，ph7.0(见附表2)。
50mmol/L过氧化氢溶液：取30%过氧化氢1.4ml，用磷酸缓冲液稀释至250ml。
标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(sigma)1.0mg(110u/mg)，溶于50mmol/l磷酸缓冲液(ph7.0)11ml中，使酶浓度为10u/ml。
操作步骤1.仪器的标定按照实验步骤88校准仪器，以获得记录纸上每个小网格的等效氧含量。
2.绘制酶活性标准曲线（1）在反应杯中加入过氧化氢磷酸缓冲液，打开电磁搅拌器搅拌10分钟，插入电极，吸收电极外溢出的溶液，调整换档旋钮，使记录笔约满刻度的10-20%，使记录纸四处移动，温度在1-2分钟后达到平衡，记录笔画出一条直线。
(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110u/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。
（3）按照上述相同步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μL（例如，浓度为20、30、40、50U/ml），并记录氧释放曲线。
(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。
（5）以过氧化氢酶活性单位为横坐标，以每分钟释放的氧气量为纵坐标绘制标准曲线。
3.样品测定（1）将50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液注入反应室，搅拌10分钟，插入电极，记录10分钟后，以直线μL注入适当浓度的待测酶溶液样品，立即记录前90秒内的析氧曲线。
(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。
实验九过氧化物酶活性的测定(共5张PPT)
操作步骤：
3ml ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。
2. 3.0 ml 0.3%愈创木酚反响液，加 实验材料: 海桐、黄杨叶
过氧化物酶活性(U)= 0) 7ml(分次参加,最后用于洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆，过滤或以 7000r／min 离心15分钟，倾出上清液。
20 0 u l 3 ％ 过 氧 化氢 ， 最后 加酶 液 20 ul 1mo1/L磷酸缓冲液 (pH7.
实验九过氧化物酶 活性的测定
第1页，共5页。
材料与设备
实验材料: 海桐、黄杨叶
试 剂： 3％过氧化氢；，0.1mo1/L磷酸缓冲液 pH6.0，pH7.0； 0.3%愈创木酚反响液：100 mmo1／L磷酸缓冲液 〔pH 6．0〕100 ml于烧杯中，参加愈创木酚0.3ml ， 于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。
第2页，共5页。
操作步骤：
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过氧化氢酶活性测定
实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
即可求出消耗的H2O2的量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴； 5. 容量瓶。
（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3.0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液 5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。
三、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液 2.5ml，再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
2018年高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定-文档资料
高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶广泛存在于植物的所有组织中，能将过氧化氢分解为氧和水，可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。
测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光光度法等。
用氧电极法测量放氧速度，方法灵敏而快速。
放氧速度与过氧化氢酶活性成正比。
仪器药品氧电极仪记录仪电磁搅拌器超级恒温水浴注射器、微量注射器容量瓶反应杯亚硫酸钠过氧化氢酶50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0(见附表2)。
50mmol/L过氧化氢溶液：取1.4ml30%H2O2用磷酸缓冲液定容至250ml即得。
标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(Sigma)1.0mg(110U/mg)，溶于50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)11ml中，使酶浓度为10U/ml。
操作步骤1.仪器的标定按实验88步骤进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量。
2.绘制酶活性标准曲线(1)在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液，开启电磁搅拌器搅动10分钟，插入电极，吸去溢出在电极外面的溶液，调节移位旋钮，使记录笔位于满刻度的10─20%左右，使记录纸走动，1─2分钟后温度达到平衡，记录笔画出直线。
(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110U/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。
(3)根据上述同样步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μl(例如浓度为20、30、40、50U/ml等)，记录氧释放曲线。
(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。
(5)以过氧化氢酶活性单位为横坐标，每分钟氧的释放量为纵坐标，绘制标准曲线。
3.样品测定(1)在反应怀内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10分钟，插上电极，待记录为一直线后，注入10μl合适浓度的待测酶液样品，立即记下最初90秒钟内的放氧曲线。
(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。
(3)如果没有标准的过氧化氢酶，不能计算酶活性单位时，也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。
过氧化氢酶活性的测定
轻度的氧伤害在解除高氧逆境后可恢复生长， 重则不可逆致死。
c. 膜脂过氧化作用
膜脂过氧化（membrane lipid peroxidation)是指 生物膜中不饱和脂肪酸在自由基诱发下发生的过氧化 反应。 膜脂由液晶态转变成凝胶态，引起膜流动性下降， 质膜透性大大增加。 d. 损伤生物大分子 活性氧的氧化能力很强，能破坏植物内蛋白质 （酶）、核酸等生物大分子。
• 植物对逆境的适应：
避逆性（stress avoidance）
耐逆性（stress tolerance）
• • • • •
生物膜 胁迫蛋白 活性氧 渗透调节 脱落酸
逆境下的自由基伤害
PSI 铁氧还蛋白 O2 还原型铁氧还蛋白 . O2NADP+
O2
NADPH
S → UQ → Cytb→→ O2
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：三叶草、盐胁迫、干旱胁迫、低温 2、仪器： (1) 滴定管 (2)研钵 (3) 容量瓶 (4)移液管 (5)三角瓶(100ml) 3、试剂：
（1）0.05M H2O2 （2）0.2M Na2S2O3 （3）1.8M H2SO4 （4）1.5%淀粉溶液 （5）10%（NH4)6Mo7O24 （6）20% KI （7）石英砂
A 空 10 白 B 5 5
5
分 钟
-
1
3
5
VA(空白)
=
VB(反应
5 1 3 5
液) =
反 10 应
-
5
酶活力： 1个酶活力单位是指在特定条件 （25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内 能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物 中1微摩尔的有关基团的酶量。
五、实验结果与计算：
植物体内过氧化物酶活性的测定
植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控 IAA 水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的 H2O2的毒害作用。
故在科研上常加以测定。
二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色 4 －邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（ A ）值，即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。
3. 试剂及配制：0.1mol·L－1磷酸缓冲液（ pH7 ）。
反应液（100ml 0.1mol · L－1磷酸缓冲液（ pH6 ）中加入 0.5ml 愈创木酚、 1ml 30 ﹪ H 2 O 2，充分摇匀）。
四、实验步骤1. 酶液提取称取植物叶片 1g ，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为 10mlpH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在 8000 r / min 离心 15min ，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。
2. 酶活性测定吸取反应液 3ml 于试管中，加入酶提取液 0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径 1cm 的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在 470nm 波长处，以时间扫描方式，测定 3min 内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△ A 470 ）。
五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性△ A 470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1） = ————————————————————样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）。
实验29过氧化氢酶活性测定(高锰酸钾滴定法)
过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理过氧化氢酶（catalase ）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧， 的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
即可求出消耗的H 2O 2的量。
二、材料、仪器设备及试剂 1.材料小麦叶片等绿色植物的叶子。
2.仪器设备（1）. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
3.试剂：浓硫酸、高锰酸钾、草酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过氧化氢。
4.试剂配制（1）10%H 2SO 4。
（2）0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液 91.5mL 磷酸氢二钠和8.5mL 磷酸二氢钠混合。
（3）0.1mol/L 高锰酸钾标准液 取KMnO 4（AR ）3.1605g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，再用0.1mol/L 草酸溶液标定。
（4）取30%H 2O 2溶液 5.68ml ，稀释至1000ml ，用标准0.1mol/L KMnO 4溶液（在酸性条件下）进行标定。
（5）0.1mol/L 草酸：称取优级纯H 2C 2O 4.2H 2O 12.607g ，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml 。
三、实验步骤 1 酶液提取取小麦叶片2.5g 加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2 取50ml 三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml ，对照加煮死酶液2.5ml ，再加入2.5ml 0.1mol/L H 2O 2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min ，立即加入10%H 2SO 42.5ml 。
实验十一 植物体内过氧化物酶活性的测定
活力单位(U) w(g FW)
W=W总（g FW)* V(mL)/V总
实验十一 植物体内过氧化物酶 活性的测定
——愈创木酚比色法
一、原理
过氧化物酶 过氧化物酶[perox idase, POD] 广泛 存在于各种动物、植物和微生物体内。 催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧 化反应: RH2+ H2O2→2H2O + R
•2 POD 分子结构特点
POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血 红素蛋白, 脱辅基蛋白分子须与血红素结 合才构成全酶。
3mL反应液+0.2mL粗酶液，震荡混匀后 立刻记时，以3mL反应液+ 0.2mL磷酸缓 冲液调零，测OD470，30’’内读第一次数， 之后每10S读数一次，至OD值>1.000。
3、计算酶活性
选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式 计算； 以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活 力单位（U）。
3、POD的主要生理功能
参与活性氧代谢过程； 参与木质素和木栓质的合成； 参与生长素的降解。
注：除了与植物正常代谢和生长发育相关 的结构型POD 外, 很大部分POD的合成属于诱 导表达型。
二、实验材料与试剂
实验材料： 不同浓度Cd处理7d的菱叶片； 试剂 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 愈创木酚； H2O2。
三、实验步骤
1. 提取酶液：
叶片2片（w gFW）+pH7.0磷酸缓冲液5mL 研磨，离心（4000rpm*10min），上清液 即为粗酶液。
2、配制反应液
1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 50ml +28uL愈创木酚+19uLH2O2(30%)
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三、材料、试剂与器具
1.材料：小麦叶片 2.试剂 （1）10% H2SO4； （2）0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8； （3）0.02mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g， 用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标 定； （4）0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取 30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定； （5）0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4 · 2H2O 12.607g，用 蒸馏水溶解后，定容至1L。
2.反应
取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定 瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液 2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时， 于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
用0.02mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现 粉红色（在30S内不消失）为终点。
3.器具 （1）恒温水浴； （2）研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管 （10ml）；容量瓶25ml×1等
四、实验步骤
1.酶液提取
取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量， 研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液 冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一 缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为 过氧化氢酶的粗提液。
3.滴定
五、计算
酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示
B ) V T 1 . 7 酶活(mgH2O2/g· min)= (A
式中：
F W V 1 t
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）；
V1—反应所用酶液量（ml）； F W—样品鲜重（g）；
实验七、植物组织中过 氧化氢酶活力测定
——高锰酸钾滴定法
一、实验目的
1.掌握酶活力测定的方法
2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理
二、实验原理
过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，
它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过
程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化
剂又是还原剂。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2
1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2
六、研讨题
1.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些? 2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关? 3.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收 法，原理是H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢 酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间 而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶 的活力。请你查阅资料设计一个应用该方法测定过氧化氢 酶活力的实验。
据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测
定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量
（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，
用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多 余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4
=5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4