神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤_范广明

中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第14期 2010–04–02出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 2, 2010 Vol.14, No.14P .O. Box 1200, Shenyang 110004 25721Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2Affiliated Hospital of Medical College of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China; 3First People’s Hospital, Lingyuan 122500, Liaoning Province, ChinaFan Guang-ming ★, Studying for master’s degree, Attending physician, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, ChinaPhoenix2a2@163. comCorrespondence to: Zhang Sai, Doctor, Doctoral supervisor, Chief physician, Affiliated Hospital of Medical College of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, Chinazhangsai718@yahoo .comReceived: 2010-01-06 Accepted: 2010-02-27神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤★范广明1，张文彬2，张 赛2，王丽君3Nerve growth factor combined with neural stem cell transplantation for treating spinal cord injury in ratsFan Guang-ming 1, Zhang Wen-bin 2, Zhang Sai 2, Wang Li-jun 3AbstractFan GM, Zhang WB, Zhang S, Wang LJ. Nerve growth factor combined with neural stem cell transplantation for treating spinal cord injury in rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(14):2572-2578. [ ]摘要范广明，张文彬，张赛，王丽君.神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(14):2572-2578. [ ]范广明，等.神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH2573www.CRTER.org1天津医科大学，天津市300070；2武警医学院附属医院，天津市 300162；3凌源市第一人民医院，辽宁省凌源市 122500范广明★，男，1978年生，辽宁省喀左县人，蒙古族，天津医科大学在读硕士，主治医师，主要从事颅脑创伤亚低温治疗，脑肿瘤手术治疗和干细胞移植治疗。

Phoenix2a2@ 通讯作者：张赛，博士，博士生导师，主任医师，武警医学院附属医院，天津市300162zhangsai718@中图分类号:R394.2 文献标识码:B文章编号:1673-8225(2010)14-02572-07收稿日期：2010-01-06修回日期：2010-02-27(20100106015/ M ·Q)0 引言以往的治疗脊髓损伤方法有手术、药物、理疗等[1]，但均未有突破性进展。

神经干细胞具有自我增殖能力和多向分化潜能，一定条件下可以分化成神经系统的各种细胞，因此在神经损伤修复方面有着良好的应用前景[2-5]。

神经生长因子(nerve growth factor ，NGF)是神经系统最主要的神经营养因子之一，兼有神经元营养和促突起生长双重作用[6]。

本实验将神经干细胞(neural stem cells ，NSCs)联合NGF 移植于大鼠脊髓损伤区，观察其对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的作用。

1 材料和方法设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2009-02/08在武警医学院完成。

材料：实验动物：孕14~16 d 的Wistar 大鼠1只；健康雌性SD 大鼠42只，10周龄，体质量250~300 g ，购自中国医学科学院动物实验室(动物质量合格证号：SCXK(津)20050001)。

实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求[7]。

主要试剂：实验方法：NSCs 的培养和鉴定：取孕14~16 d 的Wistar大鼠1只，引颈处死，体积分数为75%的乙醇浸泡消毒，剖腹取出胎鼠。

取胎鼠大脑，去除脑膜和血管，浸泡在DMEM/F12液中，用吸管反复吹打成悬液，过100目孔筛网，接种培养瓶中，加EGF 10 mg/L ，bFGF 10 mg/L ，N2添加剂，于37 ℃，体积分数为5%CO 2培养箱中培养。

3 d 后换液。

加入含BrdU 的培养基进行标记。

脊髓损伤动物模型的建立：选择雌性SD 大鼠42只，实验室饲养2周后，用2.5%氯胺酮20 mg/kg 腹腔注射麻醉，取俯卧位，固定在手术台上，备皮，常规消毒，选择T 9棘突，沿后正中线切开背部皮肤及皮下组织，长2.0~3.0 cm ，剥离椎旁肌并向两侧牵开，显露T 8~T 9棘突及椎板，用大鼠椎板钳咬除T 8棘突、T 9棘突及椎板，显露硬膜。

剪开硬膜，用由针头特制的刀口切除右半侧脊髓。

以右侧后肢瘫痪为造模成功标准。

术毕用青霉素盐水冲洗伤口，逐层缝合组织。

早晚各挤尿1次，直至恢复排尿反射。

动物分组：42只急性脊髓损伤动物模型，随机分成3组(n =14)：培养液组，单纯NSCs 组，NSCs + NGF 组。

损伤1周后分别再次手术，显露出脊髓损伤区域，用微量注射器自损伤处头尾两端向损伤处分别缓慢注入10 μL DMEM/F12培养液或10 μL(1×1010 L -1)细胞悬液，3 min 内注射完毕，留针5 min ，用医用生物胶封闭针孔以防止细胞悬液顺针道外溢，逐层缝合伤口。

NSCs + NGF 组大鼠损伤后2 h 腹腔注射NGF 3 μg/(kg•d)，连续用药1周。

各组动物术后均置于普通鼠笼喂养，每天人工排尿两次。

Basso-Beattle-Bresnahan(BBB)运动功能评分测定[8]：采取双盲法于造模后1，2，4，6，8，10周对3组大鼠进行BBB 运动功能评分测定，共检测6次，取均值。

斜板实验：斜板试验是将斜板表面垫以6 mm厚的橡胶垫，按大鼠身体轴线与斜板纵轴垂直的方向放置大鼠，逐渐增加斜板倾斜角度，大鼠在斜板上至少停留5 s ，记录斜板倾斜最大角度。

分别在术后1，2，4，6，8周进行，每只大鼠测3次，取平均值。

体感诱发电位的检测：术后第8周，3组各取7只大鼠，参照文献[9]的方法用KEYPOINT 4诱发电位仪测定体感诱发电位。

10%水合氯醛腹腔注射麻醉，将其平放在水平面上，后肢固定刺激电极。

记录电极安放于冠状缝和矢状缝愈合线的相交处头皮下(即后肢皮质感觉区)，参考电极置于其后方0.5 cm 处。

给予直流方波电脉冲刺激，以后肢轻微抽动为宜，电流强度为5~15 mA ，波宽0.2 ms ，频率3 Hz ，叠加次数50~60次，记录体感诱发电位潜伏期及波幅的变化，观察神经电生理恢复情况。

主要试剂来源DMEM/F12 Hyclone, USA 胎牛血清Sigma, USA 重组大鼠基础碱性成纤维细胞生长 因子(bFGF)、重组大鼠表皮生长 因子(EGF)PeprotechN2添加剂[胰岛素(5 mg/L)，铁蛋白(100 μg/L)，腐胺(100 μmol/L)，亚硒酸钠(30 nmol/L)，青霉素 (100 U/mL)，链霉素(100 U/mL)，谷氨酞胺(2 mmol/L)] Peprotech兔抗鼠NgR 基因抗体、山羊抗兔抗体Sigma, USA NGF舒泰神药业有限 公司,北京范广明，等.神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤P .O. Box 1200, Shenyang 110004 2574www.CRTER.org苏木精-伊红染色和免疫组化染色：3组于伤后4周随机取2只大鼠取材，行伤处组织学检查以证实损伤程度。

对组织切片进行苏木精-伊红染色和抗BrdU 免疫组化染色。

每张切片在高倍镜(×200)下任取10个视野，计算每个视野的BrdU 阳性细胞数，取其均值。

HRP 逆行神经示踪：术后8周，以生理盐水溶解HRP 。

每组随机取2只动物，麻醉后手术暴露脊髓。

于T 12髓背正中静脉左、右侧1 mm 处进针，进针深度1.5 mm 。

以0.1 μL /10 min 的速度注射50% HRP 1 μL ，注射完毕后留针15 min 。

3 d 后水合氯醛麻醉，40 g/L 多聚甲醛心脏灌注，取出脊髓(T 3~T 12)，浸入300 g/L 的蔗糖溶液(4 ) 18 h ℃后制作成5 μm 的冰冻切片，DAB 加强染色。

在光镜下计数脊髓横切面上HRP 阳性神经纤维束数目，各组随机抽取10 张切片进行阳性纤维束计数。

主要观察指标：后肢运动功能，BrdU 阳性细胞数，HRP 阳性神经纤维束数目，体感诱发电位。

设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二作者，采用盲法评估。

统计学分析：数据以x _±s 表示, 采用SPSS 15.0统计软件进行完全随机设计的方差分析。

两组之间比较用Dunnett t 检验，以P < 0.05 为差异有显著性意义。

2 结果2.1 实验动物数量分析 中途死亡4只，随即补充，进入结果分析仍为42只SD 大鼠。

2.2 神经干细胞形态观察 脑组织单细胞悬液接种于培养瓶后1 h ，大部分细胞沉积瓶底，圆形，无突起。

同时可以观察到小的细胞团。

1 d 后，神经干细胞团增多，较小，形状不规则。

小部分细胞团贴壁。

5 d 后，神经干细胞球增多，较大，形状规则，成球形。

见图1。

2.3 BBB 评分 伤前各组BBB 评分均为21分。

伤后大鼠均表现为完全截瘫，后肢及尾无活动，排尿障碍，排便未见明显障碍。