肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用随着医学技术的不断前进，对肿瘤治疗的研究也越来越深入。
其中，肿瘤干细胞的研究备受关注。
肿瘤干细胞是指在肿瘤中所存在的一小部分细胞，能够不断分裂增殖，并给予肿瘤再生的可能性。
因此，肿瘤干细胞的分离与培养以及在肿瘤治疗中的应用，成为了当今医学研究的热点话题。
一、肿瘤干细胞的分离方法目前，分离肿瘤干细胞的方法主要包括紫杉醇浸润法、细胞表面标记法、限制稀释法等。
其中，限制稀释法是较为常用的一种。
限制稀释法是将单个肿瘤细胞样本通过连续的稀释、培养与观察，逐渐筛选出肿瘤干细胞。
它通过观察单个细胞的生长、分裂、增殖情况，来得出大量肿瘤细胞当中的干细胞。
虽然这种方法过程复杂、费时费力，但是它能够筛选出更加纯度高的肿瘤干细胞。
二、肿瘤干细胞的培养方法早期肿瘤干细胞的培养，主要采用血清补充的液体培养基进行细胞的培养。
但是在这种培养条件下，肿瘤干细胞很容易分化。
因此，近年来，越来越多的实验室采用无血清培养条件进行肿瘤干细胞的培养，以维持肿瘤干细胞的稳定状态。
无血清培养条件下，需要选择不同种类的培养基，添加多种生长因子与细胞基质，来模拟肿瘤干细胞自身的生长环境。
同时，还需注意对细胞的密度、温度、pH 值、CO2浓度等生理性因素的控制。
三、肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的治疗应用肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗中，具有重要的应用价值。
首先，肿瘤干细胞作为肿瘤治疗的靶点，开启了新的临床治疗途径。
其次，肿瘤干细胞可以用于评估肿瘤药物的治疗效果，这一评价标准能够更为准确反映药物的实际效果。
此外，肿瘤干细胞还可以用于评估肿瘤的预后情况，帮助医生选择更加有效的治疗方式。
总之，肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗研究领域，具有非常重要的价值。
分离肿瘤干细胞、培养肿瘤干细胞以及开展针对肿瘤干细胞的治疗策略，将有助于提高肿瘤治疗的效果，为患者带来更好的治疗效果。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用随着科学技术的不断进步，干细胞技术已开始被应用于临床治疗中，尤其是在肿瘤治疗中。
干细胞是一类未分化的细胞，具有自我更新和分化成多种细胞类型的潜能，因此被广泛研究并用于临床治疗。
本文将介绍干细胞技术在肿瘤治疗中的应用，包括干细胞移植、干细胞免疫治疗和干细胞治疗耐药性肿瘤等方面。
一、干细胞移植在干细胞移植中，一种或多种类型的未分化干细胞被通过手术移植到患者的体内，以代替已经损坏或死亡的细胞并恢复组织的功能。
这是一种广泛应用于肿瘤治疗中的治疗方法，可用于恢复因癌症治疗而导致的非造血细胞的缺陷和免疫系统的功能，通过提高治疗的效果和减少治疗后的不良反应，以改善患者的生存率和生存质量。
在干细胞移植中，研究人员通常使用的干细胞类型是造血干细胞和淋巴细胞。
造血干细胞可以分化成一个或多个血细胞系列的血细胞，包括白细胞、红细胞和血小板。
淋巴细胞则是免疫系统的主要细胞组成部分，可以分化成效应细胞和记忆细胞，以激发和保持免疫反应。
二、干细胞免疫治疗干细胞免疫治疗是应用干细胞的一种新型治疗方法，旨在改善免疫系统对肿瘤的反应。
在干细胞免疫治疗中，研究人员通常使用的干细胞类型是免疫干细胞和肿瘤干细胞。
免疫干细胞可以从患者或捐赠者体内获取，并在实验室中培养和扩增。
此后，这些免疫干细胞可以重新注入到患者体内，以增加免疫系统对肿瘤的反应。
肿瘤干细胞则是从患者或捐赠者体内获取的未分化细胞，这些细胞具有分化成多种细胞类型的潜能，可以通过适当的刺激和诱导分化成免疫干细胞。
在肿瘤干细胞分化后，它们可以被使用在干细胞免疫治疗中，以增强免疫系统的对肿瘤的反应。
三、干细胞治疗耐药性肿瘤肿瘤的耐药性是指肿瘤细胞在作用于其上的化疗、放疗、免疫治疗等治疗手段后不再受治疗影响，导致治疗的难度加大。
干细胞的优势在于它们可以定向分化成给定细胞类型，并因此用于治疗耐药性肿瘤。
研究人员利用干细胞为药物输送增加了非常有前途的传递方式，如包括导向药物输送、控制释放、检测和修复损伤组织等。
原代肿瘤细胞的分离培养
原代肿瘤细胞的分离培养实验目的：从新鲜人体标本中分离肿瘤细胞实验器材：新鲜人体乳腺癌组织胶原酶（Ⅰ、Ⅳ型胶原酶干粉溶解于DF12培养基，浓度1mg/ml），DMEM培养基，胎牛血清，PBS，双抗（青链霉素，100×）手术器械，培养皿，培养瓶，离心管，恒温摇床，离心机，倒置显微镜，细胞培养箱实验原理：酶消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶。
胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开，适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。
本实验就使用Ⅰ、Ⅳ型胶原酶对乳腺癌组织进行消化，以获取原代乳腺癌细胞。
实验步骤：1.将新鲜乳腺癌组织置于培养皿中，加入适量ＰＢＳ，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用ＰＢＳ清洗两遍。
2.将癌组织放入新的培养皿中，加入少量DMEM培养基，使用眼科剪将组织剪成约1mm3大小的碎块。
3.转入15ml离心管中，用PBS冲洗数遍，组织块自动下沉后，除去PBS。
4.将组织块转入培养瓶中，加入5ml胶原酶和双抗（稀释至2×），吹散组织碎块，置于３７℃恒温摇床上消化组织，调节速度150r/min，每隔30min于镜下观察一次。
肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究得不断深入,肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究得热点、肿瘤干细胞得体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代得重要地位,通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤得演化、转移与抗药性等进行研究,为肿瘤得早期诊断与治疗提供了新得思路与策略。
肿瘤干细胞得体外培养多采用无血清培养基(serｕｍｆree meｄium, SF Ｍ),根据不同得细胞类型加入适当得细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者就是临床肿瘤组织联合采用机械与胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液,经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选得方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在饱与湿度得条件下进行体外培养,但值得注意得就是临床肿瘤组３7℃,５％CO２织得获取应该越新鲜越好,最好就是在外科手术后１小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞得活性,不利于体外培养。
无血清培养基有很多种,针对不同得细胞类型有专门得无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下得优点:各批产品之间成分相对明确、质量相对一致;便于控制培养得生理环境;特殊细胞类型得优化配方有利于提高细胞得稳定性,使不同类型得细胞能在最有利于各自生长得环境中持续传代培养;依据不同类型得细胞、甚至不同得细胞系(株)都可能有各自得无血清培养基。
总得来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分［1］。
基础培养基一般采用人工合成得培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraＣULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEＭ/F１2(1:1,Iｎｖitｒoｇen)最为常用。
附加成分就是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需得营养成分,包括①营养因子:胰岛素、转铁蛋白与亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、Ｌ—谷氨酰胺;②细胞因子:白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养得细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶得作用,可使用０.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(sｏｙbeaｎ trypsin inhi ｂiｔｏr)。
肿瘤干细胞实验方法
肿瘤干细胞实验方法肿瘤干细胞是一种新型细胞，具有自我更新，自我修复，多向分化和肿瘤形成的潜能。
它们在肿瘤的形成、发展和复发过程中扮演着重要的角色，因此对肿瘤干细胞的实验研究具有重要的意义。
本文将介绍肿瘤干细胞实验的基本方法。
1. 肿瘤干细胞培养肿瘤干细胞可通过单细胞克隆形成球体的方式进行培养，这种方法又被称为肿瘤球体培养。
其步骤如下：1) 确定肿瘤细胞株中的肿瘤干细胞含量。
2) 将肿瘤细胞株悬浮在无血清培养基中，添加必须的生长因子如EGF和FGF等，使其形成肿瘤球体。
3) 观察肿瘤球体的形成和生长情况，并进行维持和分离。
肿瘤球体与普通二维培养方式相比，具有较高的肿瘤干细胞含量，并具有良好的体外模拟肿瘤生长和浸润的特性。
此外，肿瘤球体可直接用于药物筛选和肿瘤干细胞信号机制的研究。
肿瘤干细胞的鉴定是肿瘤干细胞研究的重要环节。
主要通过以下两种方法进行：1) 流式细胞术通过肿瘤干细胞表面标志物表达的差异，通过流式细胞仪的分析来鉴定和筛选肿瘤干细胞。
常用的肿瘤干细胞表面标志物有CD133、CD44、CD24和ESA等。
2) 功能性鉴定法此方法是通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化的特性来进行鉴定。
肿瘤干细胞应该具有自我更新的能力，同时还具有多向分化的潜能，可以分化成多种类型的细胞。
通过上述方法鉴定出的肿瘤干细胞，需要进一步进行分选。
常用的方法有磁珠分选、流式细胞术和细胞筛等。
磁珠分选法是利用与表面标志物相关的磁珠对肿瘤干细胞进行筛选和富集。
流式细胞术，是利用表面标志物和细胞生物学特性进行筛选和富集。
细胞筛法是根据肿瘤干细胞的体积和生长特性进行富集。
4. 肿瘤干细胞治疗效果评价1) 体内治疗将肿瘤干细胞或肿瘤球体种植到动物体内，并进行药物治疗，以评价药物对于肿瘤干细胞的杀伤效果。
例如, 免疫缺陷小鼠移植瘤模型。
2) 体外药物筛选3) 分子生物学方法通过单细胞的特异性PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法，检测肿瘤干细胞相对于肿瘤非干细胞的基因差异，从而评价治疗效果。
肿瘤干细胞名词解释
肿瘤干细胞名词解释肿瘤干细胞是一种特殊类型的细胞，可以通过不同方式来发展成其它类型的细胞，从而为肿瘤细胞提供利用或被肿瘤细胞所利用的能力。
其广泛应用于肿瘤研究，为肿瘤研究和治疗提供了新的方法。
肿瘤干细胞是细胞培养技术的重要组成部分，广泛用于生物医学研究的各个领域，如癌症研究、细胞生物学和细胞分子生物学等，已成为肿瘤研究的一个主要部分。
肿瘤干细胞具有多重特性，基本上可以被归纳为三类：肿瘤母细胞、肿瘤前体细胞和肿瘤细胞。
肿瘤母细胞是指能够自动复制的细胞，可被肿瘤细胞长期利用的细胞。
它们有着复杂的分子和结构特征，通常具有自我重组和自我复制的能力，比肿瘤细胞更加强大。
比起肿瘤细胞，肿瘤母细胞更加稳定。
它们可以被肿瘤细胞长期利用，作为攻击身体细胞的“坦克”而被肿瘤细胞利用。
肿瘤前体细胞是指生成肿瘤细胞的细胞，是肿瘤发展的最初状态。
肿瘤前体细胞具有两个重要特征：一是非常脆弱，易受损害，可以被抗癌药物破坏；二是它们具有某种能力，可以与其它细胞融合，形成新的细胞，肿瘤细胞也是其中一种。
肿瘤细胞是最重要的肿瘤细胞，是肿瘤的核心，它们可以通过一系列的过程来复制自身，并向周围组织繁殖，最终形成肿瘤组织。
具有特殊的生物学特性，如具有强大的抗药性和耐受性，很难被抗癌药物抑制。
肿瘤干细胞在肿瘤研究中有着重要的作用，可以对肿瘤细胞的功能和生长进行有效控制。
在诊断阶段，它们可以帮助评估患者的疾病状态和治疗效果；在治疗阶段，它们可以用于新型抗肿瘤治疗的开发，为肿瘤的治疗提供有力的支持。
总之，肿瘤干细胞是肿瘤研究的重要组成部分，具有自我复制能力和肿瘤细胞长期利用的特性，可以用于诊断和治疗肿瘤，成为新型抗肿瘤疗法研究的有力支持。
肿瘤干细胞的研究和应用，有助于我们更好地理解肿瘤病理生物学，更有效地治疗肿瘤。
肿瘤细胞培养
第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。
癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。
另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。
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肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。
肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。
肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该CO2越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。
无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。
总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。
基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。
附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。
一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子(一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。
胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。
LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth Factor ,TGFβ)和叶酸(Retinoic Acid ,RA)诱导的细胞分化。
(二)干细胞因子(stem cell factor,SCF) 又称肥大细胞生长因子(MGF)，Kit 配体(KL)及Steel因子(SLF)，SCF可以诱导干和祖细胞增生。
SCF主要由脑、肝脏、骨髓、胎盘等组织(尤其骨髓)中的基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞产生。
SCF是一种作用于最早期造血干祖细胞的造血细胞因子，在维持造血及肥大细胞存活、促进造血细胞增殖和分化、调控各系造血细胞的生长发育过程中起着重要作用。
(三)表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 是含有53个氨基酸的多肽, 早期研究中发现其有剌激表皮细胞生长的作用,是表皮细胞培养的最常用的添加因子之一。
EGF可显著促使细胞分裂、增殖，在一定浓度范围内(5~20ng/ml),随EGF浓度提高,效应加强。
(四)碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF) 1975年Gospodarowicz 及其同事从牛大脑和垂体中分离纯化出一种分子量为16-18kD由146个氨基酸组成的阳离子多肽，并将其命名为成纤维细胞生长因子。
bFGF具有多种生物学功能，可以促进和调节血管内皮细胞、上皮细胞、和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层源性的许多种细胞的增殖和分化。
二、肿瘤干细胞目前肿瘤干细胞已经在多种肿瘤细胞系以及白血病、脑瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中分离鉴定和培养。
不同组织来源的肿瘤特性不同的，培养条件也不完全相同，本章就已有报道的从不同肿瘤细胞系或者肿瘤组织分离的肿瘤干细胞的体外培养体系加以阐述，在实际操作中读者需要经过摸索才能针对不同的肿瘤干细胞建立稳定的体外培养条件。
(一)白血病干细胞 ALL急性淋巴细胞白血病干细胞(CD34+/CD10–/CD19–)采用悬浮培养体系培养[2]。
ALL急性淋巴细胞白血病患者来源的骨髓用Ficoll分离得到单个核细胞(MNC)，使用IMDM(Gibco)添加50% FCS(Gibco)和10% DMSO二甲基亚砜(Manor Park Pharmaceuticals)冻存液将分离得到的MNC在液氮中备用。
培养时以5×105个/mL密度接种在IMDM无血清培养基中，添加了10μg/mL人胰岛素，200μg/mL转铁蛋白( Sigma-Aldrich)和2% HAS。
使用时以下两组生长因子任选其一：①20ng/mL重组人Fms样酪氨酸激酶3 (rhFlt3) 配体、20ng/mL 重组人白介素3 (rhIL-3)、20ng/mL rhIL-6、20ng/mL rhGM-CSF、20ng/mL rhG-CSF 和50ng/mL SCF。
②20ng/mL rhIL-3、10ng/mL rhIL-7和50ng/mL SCF (R&D Systems)。
每周半量换液一次，培养6周后收集细胞用于细胞遗传学和形态学分析。
(二)乳腺癌干细胞乳腺癌干细胞培养多参考Max Wicha及其同事建立的人乳腺上皮干/祖细胞体外悬浮培养体系[3]，在无血清培养基中乳腺上皮干细胞呈悬浮非分化形式生长，我们称之为乳腺干细胞球。
原代培养时在超低粘附板(Corning)以20000个/mL活性细胞传代时以1000个/mL密度进行培养。
无血清培养基选择无血清乳腺上皮生长培养基MEGM(BioWhittaker)，添加了B27 (Invitrogen)、20ng/ml EGF、20ng/mLbFGF(BD Biosciences)和4μg/mL肝磷脂(Sigma)，不添加牛垂体浸膏。
乳腺干细胞球培养7－10天后用0.05%胰酶和0.53mM EDTA-4Na消化10分钟(Invitrogen)，收集细胞到离心管中800rpm离心。
离心后得到的细胞需通过40μm滤膜并且在显微镜下观察是否为单个细胞。
10000个单细胞悬液中两个相连、三个相连、多个细胞相连的团块数量应该在30到150之间，如果细胞团大于>100需要重复进行消化和过滤的步骤。
外科手术得到乳腺癌实体瘤中乳腺癌干细胞(CD44 + / CD24− /low)的培养需要在手术后30分钟内对乳腺癌标本进行处理，在胶原酶(Roche)和透明质酸(Sigma)按1:1比例配成的消化液中37℃消化2小时后通过30μm滤膜后得到单细胞悬液。
以1000个/mL无血清DMEM-F12 (Cambrex), 添加10ng/mL bFGF、 20ng/mL EGF、5μg/mL胰岛素和0.4%牛血清白蛋白(Sigma)。
细胞在上述培养基中呈悬浮球状细胞团生长，每隔3天使用胰酶－EDTA消化2分钟后传代[4]。
乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中分离得到乳腺癌干细胞(CD24−/low /CD44 +)，收集细胞500g离心5分钟,使用Hanks’缓冲盐溶液洗涤后以1000个/mL重悬于无酚磺酞的DMEM – F12 (Cellgro) 添加0.4%牛血清白蛋白BSA(Sigma)、5μg/mL牛胰岛素(Sigma)、20ng/mL bFGF ( Sigma)和10ng/mL EGF (Sigma) ，每三天换液一次[5]。
(三)脑胶质瘤临床获得的肿瘤标本使用lympholyte-M (Cedarlane)去除红细胞，在充氧的人工脑脊液中使用胰酶消化成单细胞悬液，总的来说，每份肿瘤标本大概可以获得2－5×106个细胞。
肿瘤细胞使用TSM(tumor sphere medium)肿瘤细胞球培养基，添加20 ng/ml重组人EGF (Sigma)、20ng/ml bFGF (Upstate)、10ng/ml LIF(Chemicon)、1×神经元存活因子NSF(Clonetics)和60μg/ml N－乙酰半胱氨酸(Sigma), 使用60-mm细胞培养板进行培养确保活细胞数量为 3 ×106。
原代培养三天后免疫磁珠分选得到CD133+脑胶质瘤干细胞，使用上述细胞培养基培养[6]。
也有学者从临床肿瘤组织获得的单个肿瘤细胞悬液在Neurobasal培养基(Invitrogen)，添加2mM L-谷氨酰胺、N2 (Invitrogen)、B27 (Invitrogen)、20ng/ml hrEGF (Invitrogen)、20ng/ml hrbFGF (Invitrogen)和50mg/ml BSA。
实验中使用的细胞应该在4代之内，分选得到的Nestin+/CD133+细胞即为脑肿瘤干细胞[7]。
大鼠胶质瘤细胞系C6采用SP分选的方法得到脑胶质瘤干细胞[8], 在100-mm 培养盘中(Nunc)使用无血清的DMEM培养，添加了10μg/ml牛胰岛素、100μg/ml 人转铁蛋白、100μg/ml BSA、60ng/ml黄体激素、16μg/ml四甲烯二胺、40ng/ml 亚硒酸钠、63μg/ml N－乙酰半胱氨酸、5μM血小板凝集抑制剂forskolin、50units/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)、10ng/mlbFGF和10ng/ml PDGF。
大鼠胶质瘤细胞系9L，无血清NSC增殖培养基采用DMEM/F12添加20ng/ml EGF(Peprotech)和bFGF(Peprotech)、50ng/ml肝磷脂、1×B27 (Gibco)。
每隔两天换液一次。
当肿瘤细胞球达到100–200个时使用0.1%胰酶和1×EDTA (Gibco) 37°C消化10分钟。
通过25μm细胞滤膜(BD Biosciences) 以1000个/ml 密度接种在添加促有丝分裂剂的NSC培养基中每隔两天换液一次，18天后可以进行细胞的传代，培养的细胞球即为具有化疗抵抗和侵袭能力的肿瘤干细胞样细胞[9]。