常用核酸染料

特别的“染料”给特别的你：Invitrogen独家的SYBR GreenER

【字体：大中小】 时间：2006年05月23日来源：生物通------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

摘要：

要解决SYBR Green的非特异问题，当然不是只有一条途径。所谓条条道路通罗马，不同于Qiagen或者ABI利用的是提高DNA聚合酶的特异性，“曲线救国”，Invitrogen公司采用直接改造SYBR Green的方法，发展出更特异更灵敏的荧光染料——SYBR® GreenER™ qPCR Reagent System。SYBR Green系列荧光染料由于低毒、灵敏度度优于EB而日渐受到科研用户的欢迎，这个原属于Molecular Probes公司的专利随着Probes被并购进入Invitrogen 的大家庭，Invitrogen要优化它自然更方便啦。

SYBR® GreenER™被Invitrogen称为新一代定量PCR荧光检测方法的核心技术之一，相比原有的SYBR Green，最大的优势的发光强度更强更明亮，使得原来检测不到的低丰度DNA 的信号更容易被检测到——这也就意味着荧光染料的检测灵敏度提高了，从原来的0.1ng

左右提高到6pg，应用在定量PCR检测中就使得基因表达数据分析更为可靠。此外，对荧光染料构造的修饰使得减少了染料分子对PCR反应的抑制作用。SYBR GreenER和原有的SYBR Green一样适用相同的滤光片，并不需要增加新的仪器或者新滤光片(filters)。SYBR GreenER可以看作是SYBR Green的兼容升级版了，具体的升级优化如下：

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升级step one：快速反应与高灵敏度增加结果可靠性

SYBR GreenER这种新颖的DNA结合染料的一个显著特点就是在检测信号上有了大幅度提高，同时也由于SYBR GreenER消除了一些原有SYBR Green对PCR反应的影响（荧光染料结合入DNA小沟，阻碍扩增反应），因此反应时间得到了提升。而对于定量PCR反应来说，时间越长代表着反应越有可能进入平台期，影响数据分析，因此快速的反应也可以在一定程度上增加反应的可靠性（见下图）。

（通过对目标DNA的定量PCR扩增，可以从图中看出SYBR GreenER（绿色）比ABI SYBR® Green Master Mix (红色)，以及ABI Power SYBR® Green Master Mix (蓝色)早3到4个循环得到数据）

同时也正是由于SYBR GreenER在检测信号方面的改进，因此灵敏度在原有的基础上又进了一步，可以百分之百检测到3pg gDNA（约一个人的基因组当量），而这在同类产品中可是是并不常见的（见下）。灵敏度的提高对于检测单拷贝基因是十分之重要的，尤其是对于稀有复制子，如果检测不到很有可能在疾病诊断和治疗方面出现纰漏，影响甚大。

（这里我们特别就这个问题咨询了来自Q厂家的专家Ivy，因为上表中Quantitect正是Q 家花旦，Ivy表示，Quantitech可以检测低至5个拷贝的模版，用10pg模版也能得到非常漂亮的曲线（·“酶”头一蹙，计上心来Qiagen vs.ABI(II)参考文中图片）（这里顺便插一句，我们常常看到厂家的宣传资料中有和其他品牌的对比实验，这些做实验的专家们一般只擅长做自家的产品，人家的产品做的结果都特不好，所以读者还是要自己多看多思考哦！）而且Q厂家认为光有灵敏度是不够的，定量的特异性更是非常重要的，Q的特异性是通过引物设计和试剂盒中的酶和缓冲体系共同来实现的。试剂盒的特异性体现在：使用同样的引物时，Q的体系反应仅得到特异性产物，但是其他同类产品的体系会出现引物二聚体(NTC曲线上升)，Ct值偏高。）

升级Step two：重复特异性

可靠的定量PCR数据来自于高度的特异性和可重复性，这也正是传统SYBR Green的缺陷所在，要改善这一点，SYBR GreenER除了采用了新型的这种GreeER染料，而且在混合液里的DNA扩增酶也进行了化学修饰，保证其在常温下不会扩增以及可以长时间4°C保存，这种热启动酶活性减少了非特异性扩增。另外SYBR GreenER也同样采用了UNG，减少污染。

这样得到的混合体系即使是模板量从6pg到1ng都可以保证阴性对照（NTC，no template control，即将目的DNA以水取代作为模板）的荧光信号都保持在40持平水平（见下），说

明了这一混合液的高特异性和高重复性。

升级Step three：适合不同系统的多种选择

SYBR GreenER目前可以提供三种不同的体系以供选择，包括

∙SYBR® GreenER™ kits for ABI PRISM® （包括 premixed ROX reference dye，获得对照）

∙SYBR® GreenER™ kits for iCycler® （包括premixed fluorescein，获得动力学因子（dynamic well factors），可以用于参照）

∙SYBR® GreenER™ Universal

（生物通专稿）

细胞荧光化学

一、实验目的

1、进—步熟悉荧光显微镜的使用方法。

2、初步了解几种常用的荧光染色方法。

二、实验用品

荧光显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签

三、实验原理

荧光法较一般光学方法具有灵敏度高、特异性强、方法简便等优点，因此近年来荧光组织化学特别是免疫荧光技术有了很大的发展。利用荧光技术可研究细胞内化学成分的分布与定位，研究细胞与组织中物质的吸收与转运，进行病理鉴别以及细胞免疫等方面的研究。

当用一种波长的光(如紫外光)照射某种物质时，这种物质会在极短的时问内发射出较照射波长为长的光(可见的光)，这种光就称为荧光。有些生物材料受到紫外线照射后能直接发出荧光称自发荧光(或直接荧光)；有的生物材料受紫外线照射后并不发光，但当它吸收荧光染料后，也同样产生荧光，称间接荧光(或次生荧光)。与生物学有关的荧光现象有五种：

1、自发荧光如叶绿索、维生素A的红色荧光、胶原纤维的蓝绿色荧光、脂褐素的蓝色荧光等。

2、诱发荧光通过诱导剂作用而发的荧光，如甲醛蒸气处理可诱发细胞和组织中生物单胺类(儿茶酚胺、5—羟色胺等)产生荧光。

3、荧光染料染色荧光即经染色后荧光染料与细胞中某些成分结合而产生的荧光。

4、酶诱发荧光通过细胞内酶的作用，使某些不发荧光的物质转换为发荧光的产物。如细胞内的脂酶可使不发荧光的二醋酸荧光素分解为发荧光的荧光素。

5、免疫荧光荧光染料和抗体以共价键结合，这种标记的抗体再和相应的抗原形成抗原—抗体复合物，经激发后发射荧光，用以辨认抗原。

细胞和组织所产生的荧光必须通过荧光显微镜进行观察或通过显微荧光光度计进行定量测定。除少数生活物质含有自发荧光外，大多数研究需外加荧光染料，进行特异性结合而得以显示。.

四．实验方法

(一)几种荧光染料对细胞染色的观察

细胞吖啶橙荧光染色的观察：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA 同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。

1．将生长有培养细胞的玻片或鸡血涂片放入95%乙醇中固定15—30分钟，干燥；

2．在1%醋酸中酸化30秒；

3．在标本片上滴加足量的0．01%吖啶橙磷酸缓冲染液，染色5-10分钟；

4．用pH4．8磷酸缓冲液洗1分钟；

5．0.1mol／L氯化钙分化30秒或几分钟；

6．PBS漂洗三次，每次数秒钟；

7．在干净载玻片上滴—滴PBS，将标本片有细胞面向下临时封固，或在血涂片上滴加磷酸缓冲