2-疏水层析 (HIC)课件
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4
HIC vers 03 Aug 2000
Why should I use it?
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Complementary to ion exchange (IEX) and gel filtration (GF) Mild, non-denaturing High selectivity High recovery Concentrating technique
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Hydrophobic interaction chromatography
HIC vers 03 Aug 2000
Hydrophobic interaction chromatography
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HIC vers 03 Aug 2000
Hydrophobic interaction chromatography • What is hydrophobic interaction chromatography?
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HIC vers 03 Aug 2000
Purification of rhGM-CSF from inclusion bodies produced in E. coli
Renatured rhGM-CSF
HIC
Phenyl Sepharose FF
Removes buffer constituents (GuanidineHCl, Berol 185, glutathione etc) •Purification factor: ca 2 •Recovery: 92% of activity •Concentration factor: ca 5
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9 HIC vers 03 Aug 2000
疏水相互作用层析
疏水相互作用层析
液体分子中存在着由疏水相互作用层（hydrophobic interactions）引起的吸引力或者排斥力，即在表面上构成一个光滑的膜状结构，从而使相邻的分子能够彼此吸引。
疏水相互作用可分为氢键形成的疏水相互作用（hydrogen bonding）和电位效应（ion-pairing）。
氢键形成的疏水相互作用主要是由液体分子中的氢原子及其离子之间，形成氢键来构成的，这个相互作用层相对稳定，能够加强其他分子的相互结合作用，使其保持在稳定的状态中。
电位效应（ion-pairing）主要是由中性分子中离子（并非完全离子化）之间形成，它们之间不受静电力的影响，构成一个轻微的膜状结构，从而使分子之间产生互相吸引和排斥的作用力。
完整版第九节疏水作用色谱
第九节疏水作用色谱疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。
此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC 已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。
目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理(一) 疏水作用疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。
而根据热力学公式△G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。
当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。
hic层析原理
hic层析原理HIC层析原理是一种常用的蛋白质纯化方法，具有选择性强、操作简单等优点，在生物制药、生物医学等领域得到广泛应用。
本文将围绕HIC层析原理，分步骤阐述其基本原理和实现过程。
一、HIC层析原理1. 静电交互作用HIC层析原理的基础是分子间的静电交互作用。
水相与有机相之间存在分子间的静电相互作用，这种相互作用随分子间距离的变化而变化，因此可通过控制溶液浓度或改变盐的种类和浓度引发分子的相互作用。
2. 比较亲水性HIC层析可以通过控制盐溶液的浓度和种类来达到分离目标蛋白的目的。
越亲水的蛋白质与水的相互作用力越强，因此在高盐浓度下，亲水性较强的蛋白质会与亲水剂发生静电交互作用并在层析柱上被吸附，相反，亲水性较弱的蛋白质则在低盐浓度时被吸附。
3. 物理表面等效性物理表面等效性是指，吸附质在两相界面上的化学势相等，即可以同时吸附或脱附某种物质。
因此HIC层析可以使不同蛋白质在水相和有机相之间达到化学势相等，使不同蛋白质达到一定程度的相互对等，进而避免所需蛋白质的非特异性吸附。
二、HIC层析实现过程1. 样品的准备样品可来源于细胞、组织、培养基等来源，样品需要经过破碎和离心等处理方法获得目标蛋白。
2. 层析柱的制备在层析柱中填充具有亲水性的支持物质，如葡聚糖、硅胶、羧甲基纤维素等。
然后通过化学修饰的方法，在支持物表面引入烷基、硫醇等亲疏水基团。
3. 层析条件的选择通过对盐的种类、浓度以及pH值等条件的选择，来调节样品的吸附和洗脱。
一般来说，当盐浓度增加时，吸附质的亲水性减弱，在低盐浓度时，吸附质的亲水性强。
4. 结果的分析通过检测目标蛋白在各个步骤中的含量来判断层析效果，包括种类、纯度、活性和结构等方面的分析。
三、结论HIC层析原理是一种非常重要的蛋白质纯化方法，通过控制盐溶液的浓度和种类，选择亲水性不同的支持物质来达到纯化目标。
具有简便、安全、可重复操作的优点，是蛋白质分离纯化领域中一种重要的手段。
2019最新3 疏水层析英语
Hydrophobic interaction chromatography
• What is hydrophobic interaction chromatography? • What is it used for? • Underlying principles
• How to do it
22 HIC vers 03 Aug 2000
• Underlying principles
• How to do it
13 HIC vers 03 Aug 2000
Interaction principle
Ligands
Water molecules
Surface exposed hydrophobic groups
Solute
14 HIC vers 03 Aug 2000
A280 3.0 2.0 1.0
mS/cm 100
rhEGF
50
0.0
50
100
liter
8 HIC vers 03 Aug 2000
Purification of recombinant phosphatase
Sample:
Column: Buffer A: Buffer B: System:
170 ml eluate containing rPhosphatase from a DEAE Sepharose run, adjusted to 1.6 M (NH4)2SO4, pH 7.0 HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose High Performance 25 mM Tris-HCL, 1.4 M (NH4)2SO4, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.4 25 mM Tris-HCL, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.4 ÄKTAprime, 5.0 ml/min (150 cm/h), 0-100%B in 20 CV
3 疏水层析共45页文档
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10 HIC vers 03 Aug 2000
Separation of a2-macroglobulin isomers
A 280 0.04 AU
Na2SO4 1.0 M
Sample: 60 mg active and 60 mg methylamine-treated, inactive a2-macroglobulin
3 疏水层析
怎样思想，就有怎样的生活
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Hydrophobic interaction
chromatography
HIC vers 03 Aug 2000
Hydrophobic interaction chromatography
3 HIC vers 03 Aug 2000
Hydrophobic interaction chromatography
A280 3.0 2.0 1.0
mS/cm 100
rhEGF
50
0.0
50
100
liter
9 HIC vers 03 Aug 2000
Purification of recombinant phosphatase
Sample:
Column: Buffer A: Buffer B: System:
170 ml eluate containing rPhosphatase from a DEAE Sepharose run, adjusted to 1.6 M (NH4)2SO4, pH 7.0 HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose High Performance 25 mM Tris-HCL, 1.4 M (NH4)2SO4, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.4 25 mM Tris-HCL, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 7.4 ÄKTAprime, 5.0 ml/min (150 cm/h), 0-100%B in 20 CV
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
第九节--疏水作用色谱
第九节疏水作用色谱疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography HIC）是采用具有适度疏水性的填料作为固定相，以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子的疏水性质差异从而与固定相间疏水相互作用的强弱不同实现分离的色谱方法。
关于在疏水作用色谱条件下进行分离的概念最早在1948年就由Tiselius提出，该技术真正得到发展和应用是在20世纪70年代早期开发出一系列适合进行疏水作用色谱的固定相以后。
此后随着新型色谱介质的开发生产和对机理认识的逐步深人，该技术得到了广泛的应用，并且随着高效疏水作用色谱介质的出现，HIC已在HPLC平台上被使用，称为高效疏水作用色谱（High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC）。
由于疏水作用色谱的分离原理完全不同于离子交换色潜或凝胶过滤色谱等色谱技术，使得该技术与后两者经常被联合使用分离复杂的生物样品。
目前该技术的主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。
一、疏水作用色谱基本原理(一) 疏水作用疏水作用是一种广泛存在的作用，在生物系统中扮演着重要角色，它是球状蛋白高级结构的形成、寡聚蛋白亚基间结合、酶的催化和活性调节、生物体内一些小分子与蛋白质结合等生物过程的主要驱动力，同时也是磷脂和其他脂类共同形成生物膜双层结构并整合膜蛋白的基础。
根据热力学定律，当某个过程的自由能变化(△G)为负值时，该过程在热力学上是有利的，能够自发发生，反之则不能。
而根据热力学公式△G=△H一T△S (6.9-1) 式中，△G是由该过程的烩变(△H) ，熵变(△S)和热力学温度(T)决定的。
当疏水性溶质分子在水中分散时，会迫使水分子在其周围形成空穴状结构将其包裹，此有序结构的形成会导致熵的减小(△S<0)，致使△G为正值，在热力学上不利。
层析介质
蛋白质纯化策略
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
融合蛋白质
更高纯度
多步纯化
粗提 中度纯化 精细纯化
非融合蛋白质
表达
三步纯化策略
考虑: 考虑
蛋白质特性: 蛋白质特性
稳定性
纯度水平
需要量
保持生物活性
有效和经济
• - pH • - 离子强度 • - 温度
分子量 等电点 蛋白的疏水性 蛋白的特异结合 蛋白的特异结合
Mr 100 - 7 000
Superdex 75
Mr 3 000 - 70 000
Superdex 200 pg
Mr 10 000 - 600 000
2 3 4 5
0
10
10
10
分离分子量大小 (球状蛋白质)
Prep Grade (34 µm)
有HiLoad™ 预装柱和小包装填料
快 速
Superdex - 仅需 30 - 40 min 的凝胶过滤
120 Å: 肽类
SOURCE™ RPC
聚苯乙烯/二乙烯基苯 聚苯乙烯 二乙烯基苯
C4, C8, C18
5 and 12 µm 100 Å: 肽类 300 Å : 蛋白质
pH 1 - 12 (14)
5, 15 and 30 µm 肽类
30 µm 15 µm
5 µm
反相层析
离子交换/疏水层析/反相层析 离子交换 离子交换/反相层析
载量
epharose™ HP 34 µm
交联琼脂醣 Q & SP <150 cm/hr
小包装和预装柱
SOURCE™ 30 µm
聚苯乙烯/二乙烯基苯 聚苯乙烯 二乙烯基苯 Q&S <1 800 cm/hr 小包装
介质讲义
1.疏水层析填料（HIC）2.离子交换填料（IEC）3.凝胶过滤填料（GFC）疏水层析填料1.生物分子表面大都含或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱和结合。
2.高离子强度可加强疏水性，和离子交换刚刚相反，高盐吸附，低盐洗脱。
经洗脱的样品又可直接或稍加稀释后上其它层析柱，作为连接下游层析步骤的桥梁，并可完全取代传统的盐析沉淀技术，更符合工业生产要求。
3.比反相介质的配体密度低很多，无需有机溶剂洗脱，保存生物活性。
配体种类繁多，提供宽广的选择性。
Butyl-S Sepharose 6FF(乙肝疫苗纯化使用的疏水介质)1.亲水性的交联6%琼脂糖基质和丁基配体2.疏水性最弱的疏水填料3.颗粒大小－45-165µm4.pH稳定性，工作－3~13; 清洗－2~145.最快流速－600cm/h6.耐压－0.3Mpa化学稳定性可用：1mM HCl 70%乙醇 30%异丙醇 50%乙烯 8M尿素 6M盐酸胍 1M NaOH在位清洗（CIP）建议：推荐5-10次层析循环做一次CIP(生产上每批都进行CIP,为了更好的控制内毒素) 如果杂质成分不明可以采用下列方法：在位清洗（CIP）1.去除脂质和更强疏水性蛋白A.70%乙醇或30%异丙醇 4CV-10CV用梯度反洗以防止由于使用高浓度有机溶液而产生气泡。
B.用表面活性剂或酸溶液洗柱2CV，例如：0.1-0.5%非离子表面活性剂+1M醋酸 ,40cm/h反洗，再用70%乙醇洗5CV，洗去表面活性剂,3-4CV WFI（生产未使用）在位清洗（CIP）2.去除其它杂质0.5-1M NaOH 反向清洗4CV，流速40cm/h WFI清洗2-3CV.如果还是清洗不充分可将柱子静置在0.5-1M NaOH 中过夜.（生产----0.5 M NaOH 反向清洗2CV 1h 流速40cm/h,之后WFI清洗10CV，此方法同时可以达到去除内毒素的目的，CIP后内毒素<0.25EU/ml）再生:为了保证介质有个良好的性能，在每次层析后都要清洗吸附在柱上的物质。