第七章微生物的研究方法
第七章 工业微生物原生质体育种和原生质体融合
4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融
合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。 6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
融合过程中细胞膜变化
类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法
物理法、化学法及生物法 。
原理 增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法
在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。 膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。
原理与过程
灭活后的病毒颗粒结合到原 生质体表面。两受体细胞开 始凝聚。 两细胞的膜紧密结合。病毒 被膜与受体细胞的浆膜融合 。病毒颗粒周围的膜脱离整 个膜，产生破口，在两细胞 间形成细胞质通道（37℃下 1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点
研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法
包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为 H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后 引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发 生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻
第七章微生物生态revised2p演示教学
（2）微生物营养：土壤和地下水中，尤其是地下 水中，氮、磷都是限制微生物活性的重要因素。 因此要保持一定的C：N：P比值，一般以土壤微 生物碳氮比25：1，污水好氧生物处理BOD5：N： P= 100：5：1作为参考值。
（二）污染土壤的微生物生态 污水长期灌溉会引起土壤微生物生态的变化：
区系和数量改变。 ① 产生可分解各种污染物的微生物种类。 ② 重金属的作用。
四、土壤污染和土壤生物修复
（一）土壤的污染及其不良后果 来源：废水（农田灌溉和土地处理）、固体废弃物
、油库泄漏或农药的过度使用等。 污染物质：农药、石油类、氨、重金属等。 易降解的污染物在土壤中会被逐渐分解，而难降解
➢ 生态系统的平衡的破坏与建立，是自然界发展的 普遍规律。生态系统总是在不平衡-平衡-不平衡的 发展过程中进行着物质和能量的交换，推动着自 身的变化和发展。
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第二节 土壤微生物生态
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土著微生物：authochthonous microorganism 在一定给定的生境中生存、生长和进行活跃代
第七章 微生物生态
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主要内容： 生态系统 土壤生态系统及其微生物 空气生态系统及其微生物 水体生态系统及其微生物
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第一节 生态系统
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一、 生态学的定义
不同学者对生态学的定义不同，其中比较经典的 定义是：“生态学是研究生物与环境相互关系的 科学“（Haeckel,1986）。
我国著名生态学家马世骏先生将生态学定义为 “生态学是研究生物的生存条件、生物群落与环 境系统之间相互作用的过程及其规律的科学” （马世骏，1990）。
(1)第一篇 第七章 微生物在海洋环境中的作用
微生物在海洋环境中的 作用
第一节 海洋微生物环境生态的特点 第二节 海洋微生物在环境循环中的作用 第三节 海洋微生物在可燃冰形成的作用 第四节 沿海养殖虾池的微生物 第五节 赤潮发生的原因以及与海洋环境的关 系
教学重点
1、海洋微生物环境生态的特点
2、海洋微生物在环境循环中的作用
教学难点
1、常见的海洋微生物种类
（3）造成恢复养殖业困难 海产养殖业的特点：投资大、风险大、回报 大。 影响：养殖者信心、资金困难。 1989年：山东等省损失超过3亿元 1997-1998年两次赤潮：广东损失超过4亿 元，香港损失超过3亿元。
2、赤潮对海洋环境的破坏 （1）影响水体的酸碱度和光照度 正常pH8.0-8.2;赤潮pH8.5-9.3，影响海洋 动物死亡，底层生物量锐碱。影响水体透明度。 造成珊瑚死亡。
塘水 底泥 塘泥 塘泥
100 78 0 22
Hale Waihona Puke 塘水 底泥 塘泥 塘泥100 50 37 13
河弧菌广泛分布于低盐度海水环境的港 湾水、河水中。广泛存在于鱼、虾、蟹、牡 蛎、蛤和螺等动物中。
副溶血性弧菌在低盐度的海水环境中繁 殖迅速。各种弧菌对人和动物均有较强的毒 力，其致病物质具有溶血活性、肠毒素和致 死作用。
赤潮种类 有260余种浮游藻类可形成赤潮，其中 有70余种有毒。 主要两类型的藻类形成赤潮： （1）甲藻类（涡鞭藻类） 这种藻类的细胞伤有两条鞭毛，其中一 条绕着藻体的环沟，另一条在纵沟中伸出。 具甲板、毒素。
各种引起赤潮的甲藻
（2）硅藻类 富含硅质，无害。个别种类有毒，可 产生记忆缺失性毒素。
海洋微生物在地球历史上的作用： 1、在20亿年前，为地球制造了氧气，从而具 有多样性的生物圈。 2、将空气中的氮气变成了硝酸盐，否则，地球 就没有动物。
第7章微生物的生长(简)
连续培养原理
原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时， 一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流
方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能 长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。
连续流入 新鲜培养液
单批培养 恒浊法 恒化法
lg细胞数（个/ml）
连续培养
单批培养
④衰亡期(decline phase) 细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目急剧下降， 出现了“负生长”。其中有一段时间，活菌数呈几何级 数下降，故有人称之为“对数死亡阶段”。 这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一 些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体 细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊， 有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性 反应等。
小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显 微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。
第一节 微生物生长的测定
在微生物学情况进行测定
1、培养平板计数法 2、膜过滤培养法 3、显微镜直接计数法
三. 以生物量为指标测定微生物的生长
认识延迟期的特点及原因对实践的指导意义：
◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： ①增加接种量； （群体优势----适应性增强） ②采用对数生长期的健壮菌种；
③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的 某些成分。 ④选用繁殖快的菌种
◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌
抑制大多数其它微生物的生长，使待分 离的微生物生长更快, 数量上升 直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。 ＊利用选择培养基进行直接分离 ＊富集培养
利用选择培养基分离
第七章微生物的生长与环境条件ppt课件
根据公式：G = （t2 - t1 ）/3.3 ·lg (x2 /x1)
t2 - t1 = （4 - 0）× 60 min = 240 min
x2 = 108
x1 = 104
lg(x2 /x1 ) = lg108 ~ lg104 = 8 - 4 = 4
代入上式 G = 240/3.3 × 4 = 240/13.2 = 18 min
二、孢子生长
无性孢子繁殖 孢子的生长包括: 孢子肿胀（外源肿胀，不需营养；内源肿胀，需要营养）; 萌发管形成; 菌丝生长。
有性孢子繁殖 第一阶段是质配（plasmogamy） 第二阶段为核配（karyogamy） 第三阶段是减数分裂（meiosis）
第三节 环境条件对微生物生长的影响
生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的 改变，在一定限境条件的某些改 变；当环境条件的变化超过一定极限，则导致微生物的死亡。 研究环境条件与微生物之间的相互关系意义重大。本节将较 多地涉及各种物理、化学因素对微生物生长的抑制与致死的 影响。
用最高稳定期的培养物接种
抑制DNA合成法
利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后再解除 其抑制，也可达到同步化的目的。试验证明：氨甲蝶呤、 5-氟脱氧尿苷、羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟 苷等，对细胞DNA合成的同步化均有作用。
总之，机械法对细胞正常生理代谢影响很少；而诱导同步分裂 虽然方法多，应用较广，但对正常代谢有时有影响，而且对其 诱导同步化的生化基础了解很少，化学诱导同步化的本质还是 一个尚待研究的问题。
在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数级数增加的，即 20 →2 1 →22 →23 ……2n 这里的指数 n 为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一 个细菌繁殖n代产生2n 个细菌。 如果在对数期开始时间 t1的菌数为 x1 ，繁殖 n 代后到对数 期后期t2的菌数为 x2，则代时（Generation time，G）（即 每增加一代所需要的时间）应为：
微生物研究进展内生菌研究进展ppt课件
0.5mg/mL丙 酮提取物对 小麦纹枯病 菌丝生长抑 制
果实刺针法
发酵液原液 对番茄灰霉 病的保护
2019
盆栽法对黄瓜霜霉病的保护
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根、茎、叶、花 根、茎、叶、花
研 究 和 开 发 路 线 图
优化指标？
菌量、抑菌活性或？
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三、内生菌的研究方向展望
自然资源日渐匮乏、环境污染日益严重
2019
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影响内生菌种类的因素：植物的生长地域、品种、 气候、季节、植株的不同部位（组织专一性）等。 药用植物内生菌资源！
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3、植物内生菌的起源
• 通过种子传递给植物； • 通过对植物细胞纤维素的降解，破坏植物细胞壁， 从而进入；
• 根际菌通过植物侧根的裂缝进入植物，经过长期
的协同进化，与植物建立了一种和谐的内生关系。 许多内生菌能利用纤维素为唯一碳源生长。
448mgl2019174产生杀虫活性物质的内生菌除虫菊形态图201918天然除虫菊素酯的结构201919生长速率法101发酵液对辣椒疫霉病菌菌丝生长抑制101发酵液对番茄灰霉病菌菌丝生长抑制05mgml丙酮提取物对小麦纹枯病菌丝生长抑果实刺针法发酵液原液对番茄灰霉病的保护盆栽法对黄瓜霜霉病的保护2019优化指标
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结构上可分为：生物碱、甾醇、萜类、异香豆素、醌类、黄酮、 苯丙素和木质素、肽类、酚及酚酸类、脂肪族化合物等。
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2019
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2、 “协同进化”机制 ——解释内生菌可以产生与植物相同或相似
的生物活性物质
• 基因传递理论：基因的水平转移 传递方向：能产生紫杉醇的植物只有红豆杉 紫杉醇产生菌有多样性 • 内共生理论：产生与植物相同的代谢物有利于微生 物在竞争性环境中生存下来。
第七章 微生物的生长繁殖
平板划线分离法
稀释倒平板法
单孢子或单细胞分离法
利用选择性培养基分离法
（一）平板划线分离法
用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，
在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其
他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划
线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，
① 生长速率常数等于零 ② 细胞形态变大或增长 ③ 细胞内RNA尤其是rRNA含量增高， 原生质呈嗜碱性
④ 合成代谢活跃
⑤ 对外界不良条件反应敏感
影响停滞期长短的因素
接种菌龄：接种龄即“种子” 的群体生长年龄，亦即它处在生长曲 线上的哪一个阶段。实验证明，如果以对数期接种龄的“种子”接种， 则子代培养物的停滞期就短。 接种量：接种量的大小明显影响停滞期的长短。（基数大）
待测菌液与等体积血液混匀涂片； 血液中红细胞数已知； 显微镜下观察菌液细胞与红细胞的比例； 计算：
每毫升菌液的含菌数可通过已知红细胞浓度和菌液细胞与红
细胞的比例计算得知。
细胞的自动计数
电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔 仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显 增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是 否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
其群体的规模成正相关。
样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可
以借助特定的仪器设备来测定相应的指标。
第二节 微生物的生长曲线
一、细菌的生长曲线
将少量菌种接种在适当的液 体培养基中培养，隔一定时 间取样，计算菌数，以菌数 的对数为纵坐标，生长时间 为横坐标作图，所得的曲线 即为细菌的生长曲线。 典型生长曲线 延滞期(适应期)、对数期、稳定期、衰亡期。
研究微生物的方法
研究微生物的方法
1. 直接观察法：通过显微镜或肉眼观察微生物的形态、大小、颜色、运动等特征。
2. 培养法：利用培养基为微生物提供适合生长的环境，使其繁殖增殖，并进行分离纯化、鉴定和检测。
3. 分子生物学技术：包括PCR、DNA测序、基因克隆和重组等技术，主要用于分析微生物的基因结构、功能和进化等方面。
4. 比较生物学方法：通过比较不同微生物的形态、解剖结构、代谢途径等特征，及其同其他生物和环境的关系，推测其分类和生态学特征。
5. 生态学研究法：通过对微生物的生境、环境因子等方面的研究，了解其分布、功能和影响等方面的特征。
微生物学的新研究方法
微生物学的新研究方法微生物学是生命科学中一个快速发展的研究领域，其对于人类健康和环境保护等方面有着至关重要的作用。
而近年来，随着科技的不断进步，微生物学的研究方法也得到了极大的改进和拓展。
在这篇文章中，我们将会谈到微生物学的新研究方法。
1. 基因组学基因组学是研究基因组的结构，功能和演化等方面的一门学科。
对于微生物学而言，基因组学的应用可以帮助研究者更好地理解微生物的进化，代谢和栖息等方面的基本特性。
与传统的微生物学研究方法相比，基因组学可以大大缩短研究过程，提高研究效率，并且其结果更加精确和准确。
2. 元转录组学元转录组学是通过测量RNA的转录量和种类来研究基因表达谱的一门学科。
与基因组学类似，元转录组学同样可以在研究微生物学方面提供重要的帮助。
通过分析微生物在不同环境下的基因表达差异，可以更好地理解微生物适应不同环境的能力，同时也可以为人类对于微生物抗菌药物的研究提供有力的支持。
3. 代谢组学代谢组学是研究代谢产物的种类和数量的一门学科。
在微生物学领域，代谢组学可以用于分析微生物在不同环境下的代谢产物变化，从而探究微生物的代谢途径，以及寻找新的药物开发方向。
例如，代谢组学可以帮助鉴定微生物产生的新抗生素，为抗菌药物研究提供崭新的思路和方向。
4. 全基因组比较学全基因组比较学是通过比较两个基因组之间的不同以及其演化过程的一门学科。
在微生物学方面，全基因组比较可以用于研究微生物的进化，研究微生物与人类健康相关的生物学特性，以及探究微生物感染和传播等机制。
利用全基因组比较学，我们可以更好地理解微生物的分布和演化规律，为微生物防治和治疗等领域提供有用的参考。
总结在本文中，我们介绍了微生物学的新研究方法，包括基因组学、元转录组学、代谢组学和全基因组比较学。
每种方法都能够为微生物学领域提供重要的信息，帮助我们更好地理解微生物的基本特性以及其在环境和人类健康方面的作用。
随着科技的不断进步，微生物学的研究方法还将不断更新和拓展，为实现更好的微生物学应用和开发带来更多的可能性和机遇。
环境工程微生物学5~9章
环境工程微生物学5~9章第五章微生物的生长繁殖与生存因子1、微生物群的生长的研究方法微生物的培养方法有分批培养和连续培养-分批培养分批培养是讲一定量的微生物接种在一个封闭的，盛有一定体积液体培养基的容器内，保持一定的温度，pH，溶解氧，微生物在其中生长繁殖，结果出现微生物的数量由少变多，达到高峰后又有多变少，甚至死亡的变化规律。
这就是微生物的生长曲线。
-停滞期特点：（1）代谢活跃，个体体积重量增大；（2）不立即进行分裂增殖，数量不变，甚至变少。
缩短或消除停滞期的方法：（1）采用处于高效菌群对数期的菌种；（2）增大接种量；（3）保持接种前后所处的培养介质和条件一致。
-对数期特点：（1）繁殖速度最大；（2）平均代时最短；（3）形态、染色、生物活性都很典型。
-静止期特点：（1）消耗了大量营养物质，代谢毒物增多；（2）死亡率=出生率。
-衰亡期特点：死亡率>出生率（相当于内源呼吸阶段）连续培养定义：是细胞培养对数期后，以一定速率流入新鲜培养基，并利用溢流方式等流出培养物，使容器内培养物或细菌达到动态平衡。
微生物生长维持在某一对数生长期的生长速率。
-恒浊连续培养（细菌以最高生长速率生长）恒浊连续培养是使细菌培养液的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。
-恒化连续培养（使细菌在低于最高生长速率的条件下生长繁殖）恒化连续培养是维持进水中的营养成分恒定，以恒定流速进水，以相同流速流出代谢产物。
2、细菌生长曲线在污水生物处理中应用-常规活性污泥法利用生长速率下降阶段的微生物，包括减速期、静止期。
-生物吸附法利用生长速率下降阶段的微生物。
-高负荷活性污泥法利用生长速率上升阶段（对数期）和生长速率下降阶段（减速期）的微生物。
-有机物含量低的污水，利用内源呼吸阶段（衰亡期）的微生物。
-为什么常规活性污泥法不利用对数生长期的微生物而利用静止期的？（1）对数生长期的微生物虽然生长繁殖快，代谢活力强，能大量去除污水中的有机物，但相应要求进水有机物浓度高，则出水的绝对值也相应提高，不易达到排放标准。