DNA合成原理
dna分子杂交技术原理
dna分子杂交技术原理
DNA分子杂交技术是一种常用的实验技术，用于检测、分离
和定量DNA序列。
其原理基于DNA的互补配对特性。
首先，人工合成两条DNA片段，一条称为“探针”，另一条称
为“目标DNA”。
探针和目标DNA片段的序列需要在一定程度上互补。
探针通常被标记上荧光染料或放射性同位素等化学标记物，以便于检测。
然后，将探针和目标DNA混合，并进行热变性处理。
这个过
程使得DNA分子的双链断裂，形成两条单链DNA。
接下来，通过降温使两条单链DNA重新互补配对。
如果目标DNA中
有与探针互补的序列，它们将形成稳定的双链结构。
在杂交后，通过适当的处理，可以将未与探针结合的目标
DNA从混合物中去除。
而与探针结合的DNA可以被检测、定量和分离。
可以使用不同的技术来检测已标记的探针，例如荧光检测或放射性测量。
DNA分子杂交技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、基因
工程和临床诊断等领域。
它可以用于检测特定的DNA序列、
基因分型、基因突变等。
此外，通过结合其他的分析技术，如聚合酶链式反应（PCR），DNA分子杂交技术还可以实现高
效的基因扩增和检测。
DNA合成原理及操作
3. 氨解脱保护 合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。
一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要 时间越长。
4. 纯化: 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯
化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和 力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗 脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml 的20%乙腈洗脱。
缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接 收不好也不能有效分离。
5. 样品定量分装 样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液
里，260紫外波长下测值，根据客户要求分 装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5 倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽 样检测合格后交给市场。
合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可 以出货
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成
合成部根据合成实际情况合理安排订单， 依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽 量同批次安排合成，部分长链、G含量高、 合成量大的引物比较难合成，时间上可能会 有所延缓
2. 上机合成
不同型号的合成仪合成通量和合成时间均 不同，公司预定的仪器批次合成96条引物， 20bp长度合成需要2-3小时。
④氧自由基伤害 细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿 嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
三、 碱基插入或缺失 吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱 基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插 入一个碱基。 DNA聚合酶在复个碱基的缺 失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺 失，在生长链上滑动易于造成插入。 插入或缺失会导致读码框改变。
人工合成DNA技术的原理及应用
人工合成DNA技术的原理及应用人工合成DNA技术，又称基因合成技术，是近年来生物工程领域的一项重要技术。
它利用现代合成化学原理，以单个核苷酸为基本单位，通过不断连接和扩增，合成出特定的DNA片段或整个基因组，来探究基因功能、构建新型生物、研制新药等。
本文将介绍人工合成DNA技术的原理及应用。
一、原理人工合成DNA技术的核心是“化学合成+PCR扩增”。
首先，在化学合成的过程中，我们可以使用经过特殊化学修饰的核苷酸单体，如氨基甲酸二乙酯（Pac）、5-氟化脱氧尿嘧啶（5-FdU）、2'-端磷酸酯异构体（2'-O-Me）、磷酸二乙酰溴（DEPC）等，按照特定序列依次连接，形成目标DNA片段。
化学合成的优点是可精准控制DNA序列、长度和纯度，且生产效率和成本较高。
其次，对于长DNA片段的合成，常常需要分段合成然后通过PCR扩增来获得。
PCR技术能够在体外通过酶催化，在不断升温、降温、延伸等环节中扩增DNA模板的指定片段。
PCR扩增的过程中，我们可以在引物末端添加特定序列，使得目标DNA片段与载体DNA重组。
需要注意的是，人工合成DNA片段需要经过质检和验证，可通过酶切、测序、杂合性等多种方式来确保所得产品质量。
二、应用人工合成DNA技术的应用非常广泛，以下是其中的几个方面。
1. 研究基因与蛋白质功能利用人工合成DNA技术可以有针对性地构建基因突变体和蛋白质变异体，从而探究基因和蛋白质的生物学功能。
例如，特定氨基酸序列的点突变可能会导致蛋白质结构或功能上的变化，进而深入了解蛋白质的生理功能及生化特性。
此外，对长链DNA片段的合成和组装，也有助于对重要生物过程的理解。
2. 制备新生物和新产物通过人工合成DNA技术，可以让人类创造出新的生命体来实现某些应用，如制造新型细菌、昆虫、植物等。
它也可用于生产生物合成产物，如药物、新型材料、化学原料和食品添加剂等。
3. 基因治疗人工合成DNA技术不仅可以用于研究和生产，而且可作为基因治疗的手段。
dna合成仪原理
dna合成仪原理DNA是构成生物基本遗传遗传物质的核酸，其序列的精确复制和修复对于生命的长期存在和演化的至关重要。
DNA合成仪是一种在短时间内合成高质量的DNA片段和基因组的设备，被广泛应用于基因工程、基因组学、药物研究和诊断等领域。
1. DNA合成基本原理DNA的合成是一种与模板依赖性的生化过程，需要引物（prmer）作为起始点，核苷酸单元（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）作为合成材料，以及酶（DNA聚合酶）作为催化剂。
合成过程中，引物与模板DNA相互配对，酶沿着模板链“读取”模板上的信息，依次加入适配的核苷酸单元，使合成链适配模板链。
反复循环直至合成结束，形成一条新的DNA链。
2. DNA合成仪的构成（1）固相合成化学载体固相合成技术是DNA合成过程中的关键技术，它可以在化学载体表面上合成DNA，同时可以利用高效液相色谱技术对DNA进行纯化和分离。
合成化学载体主要包括：- 硅胶：用于合成磷酸二酯键（phosphodiester bond）；- DNA修饰因子：用于定向控制合成反应；- 引物修饰因子：用于提高合成效率及反应稳定性。
- 化学发光系统：用于监测反应的进行情况；- 氨基酸保护缓冲剂：用于保护酶的氨基酸残基，同时也可以增加合成效率；- 光学系统：用于记录反应的光信号以及反应的质量；- 清洗和纯化装置：用于去除反应体系中的杂质和副产物，以及纯化DNA产物。
（1）引物的设计和配对DNA合成必须要有起始点，通常我们需要在所要合成的DNA片段的两端加上可互补的引物（primer），引物为一串短链的DNA或RNA，通常为18-30个核苷酸。
- 引物的长度和组成；- 引物的互补性；- 引物的位点选择。
（2）DNA链延伸在DNA链延伸过程中，首先需要将反应体系加热至95°C，使沉淀的DNA片段变为单链DNA。
然后将反应体系冷却至50-60°C，将引物加入体系中，引物与模板DNA序列互补，同时可以通过最优反应条件，使引物与模板DNA序列恰好在位点上完全互补，保证整个反应体系的效果。
Oligo DNA合成原理
Oligo DNA 合成
固相亚磷酰胺三酯法是目前最常用的Oligo DNA化学合成方法，它具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
合成步骤：
1、脱保护：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；
2、缩合：合成DNA的原料-单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应；
3、带帽(capping)反应：缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应；
4、氧化：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯；
通过上述步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被连接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率；
5、氨解：通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来；
6、纯化：切下来的Oligo粗品根据实验目的不同选择不同的纯化手段进行纯化，OD260定量及抽干后根据定单要求对Oligo进行分装。
DNA合成和选择性修饰的基本原理
DNA合成和选择性修饰的基本原理DNA合成和选择性修饰是生物学中非常重要的过程，涉及到生命的存续和传承。
本文将从DNA合成和选择性修饰的基本原理入手，探讨这个过程的机制和意义。
一、DNA合成的基本原理DNA合成是生物体进行细胞分裂和生殖的关键步骤，也是生命基因的传递和延续的基础。
DNA合成的主要原理是，根据DNA 双螺旋结构的规律，将一个DNA分子的两个互补链分开，使之成为两个单链，并在每个单链上按方案合成新的互补链，再将两个新的DNA分子重新组装成一个分子。
DNA是由四种不同的碱基组成的核苷酸，分别是腺嘌呤（Adenine，简称A）、胸腺嘧啶（Thymine，简称T）、鸟嘌呤（Guanine，简称G）和胞嘧啶（Cytosine，简称C）。
其中A和T、G和C是互补的碱基对，它们之间恰好相间排列，形成了DNA双螺旋结构的“阶梯状”结构。
因此，DNA合成的基本原理就是，将DNA的单链进行复制，使之与原有链上的互补碱基配对，实现新链的合成。
在细胞分裂过程中，DNA合成的速度非常快，但合成的过程是由多个酶催化完成的。
DNA合成过程分为三个阶段：1、准备阶段在准备阶段，细胞会检查DNA双链是否有破损或损坏，如果有，会先修复这些损伤。
同时，细胞还会等待一段时间，以便DNA复制所需的各种物质充分积累。
2、DNA合成阶段在DNA合成阶段，DNA双链被分开，并且在每个单链上按照碱基配对的原则从5'端向3'端合成新链。
合成过程中需用到酶，其中DNA聚合酶是最重要的酶之一。
DNA聚合酶具有催化合成新DNA的活性，可在酶缺陷情况下修改稳定DNA的标准化力常数。
3、结束阶段DNA合成结束后，细胞会检查新合成的DNA是否出现错误。
如果有错误发现，细胞会用修复系统进行修复。
如果修复不成功，细胞就会自我消亡或导致发生突变。
二、DNA选择性修饰的基本原理为了保证DNA复制过程的准确性和稳定性，细胞会在DNA上加上一些特定的化学标记，从而实现DNA选择性修饰。
DNA合成原理及操作
4.4 HPLC纯化 HPLC吸附基质分反相柱和离子柱: RP(反相柱）是根据疏水性的差别来分离的: 疏水性更强的长片段比短片段在柱内保留的时间更长。 离子柱是根据不同长度的寡核苷酸带有不同的净电荷，通过缓慢增加流动相的离子强度将n-片段先洗脱。 优点: 纯化效果好，纯度可达99%以上，特别是对标记引物，特殊探针特别有用。 缺点: 不能批次生产，比较费时，有时样品接收不好也不能有效分离。
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成 合成部根据合成实际情况合理安排订单, 依次安排加急-测序-内部-外部, 同一客户尽量同批次安排合成, 部分长链、G含量高、合成量大的引物比较难合成, 时间上可能会有所延缓 2. 上机合成 不同型号的合成仪合成通量和合成时间均不同, 公司预定的仪器批次合成96条引物, 20bp长度合成需要2-3小时。
DNA合成碱基缺失或错误原因分析
一般客户提出异议时，我们首先给客户重新合成，然后再分析原因。 从合成机理上分析就可以很清楚的表明：人为的因素不可能造成碱基缺失或个别的碱基错误。如果说某一个碱基由于种种原因(如瓶中溶液没有了，或管道堵塞)，未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一个反应Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止 。造成的原因可能是： 1、Taq酶的原因。因为在PCR扩增时引物也被扩增,就可能出现错误 ， 2、化学原因 。在合成过程中，如果本公司提供的DNA合成报告单是正确的，表示合成是成功的 。化学合成的DNA片段要比天然的DNA片段有更多的碱基突变概率。但其真正的化学机理还不太清楚，但可以肯定的是要保证100％不发生错误是不可能的。 解决的办法： 1、采用高保真的 Taq酶 2、重新挑克隆 3.重合引物
DNA合成原理
DMT O
Base 2 O
O P iPr2N OCH 2C H2CN H
DMT O
Base 2 O
O
P N OCH2CH2CN NN N
NN NN
b. 耦连 （Coupling）
DM TO
Base2 HO
Base 1
O
O
O
P N O CH2CH2CN NN N
O CPG
DM TO
Base 2
O
O NCH2CH2COPO
PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板， 以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合 酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至 完成新的DNA合成。
基本反应步骤 ：高温变性 → 低温退火 → 适温延伸。
寡核苷酸的化学合成原理
目前，oligo DNA的合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法，亚磷 酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上，经过四步循环反应：脱保 护、耦连、加帽、氧化，逐一将一个一个核苷酸单体连接上去，最 终完成DNA链的合成。此法具有高效、快速偶联、起始反应物比较 稳定的优点。
dG-phosphoramidite
H 3C O
OCH3
O
HN
ON O
O
O P ON
CN
dT-phosphoramidite
H 3C O
OCH3
O HN
N
ON O
O
O P ON
CN
dC-phosphoramidite
1. 脱DMT （Detritylation）
D M TO
B a s e 1
O
O C P G
该方法的特点： • 第一个核苷酸是3’固定在固相载体上 • 每一个核苷酸依次连接上去
DNA合成的原理与方法
DNA合成的原理与方法DNA合成是指将单个核苷酸迅速连接成DNA分子，这是一个生物化学的过程。
它是DNA复制和基因组宏基因组学中必不可少的过程，因为DNA合成是生命体进化和繁殖的关键步骤。
在本文中，将介绍DNA合成的基本原理和方法。
DNA合成的基本原理结构上，DNA由两条互补的链组成，每个链由一些核苷酸组成。
核苷酸由一个五碳糖、一个苷基和一个磷酸基组成。
在DNA链中，核苷酸通过它们之间的磷酸酯键连接在一起。
这些酯键在形成DNA分子时形成了磷酸二酯键杆。
DNA合成是一个需要高能物质的过程。
在细胞周期的S期，DNA合成会被触发，这是为了让染色体复制以备细胞分裂。
细胞通过不断地使用ATP分解来释放能量，提供给DNA合成反应所需的高能物质。
DNA合成的方法DNA复制可以分成两个步骤：模板DNA链的拆分和新合成的DNA的组装。
DNA合成的方法如下：1. 拆分模板DNA链。
DNA复制开始时，两个互补的链都需要通过酶的作用分离开来。
在这种情况下，酶称为DNA脱氧核苷酸链终止酶，或称拉格酶。
拉格酶对模板DNA进行切割，使RNA 引物被加到DNA链上。
2. 添加引物。
在DNA复制过程中，DNA合成酶不能直接合成DNA链，因为它没有起始位置。
因此，必须有一小部分RNA链被添加到DNA链上，称为RNA引物。
DNA链上的RNA引物将为DNA合成酶提供启动点。
3. 新的DNA链的组装。
一旦引物和DNA合成酶都聚集在基因组的起始点上，DNA合成酶可以开始将新的DNA链组装在已存在的DNA链上。
这个过程涉及到DNA合成酶将新的核苷酸加入到芯片DNA链的所有位置，按照RNA引物指示的方向进行。
4. 砍断RNA引物。
最后，DNA合成酶也需要处理添加到DNA 链上的RNA引物。
它做的是将这些引物破坏，以便RNA链不与DNA链结合，而新的DNA链可以匹配起来，形成一个完整的双链DNA分子。
DNA合成的其他原理除了上述的步骤之外，DNA合成还有另外一些原理。
DNA合成及其具体操作流程探析
DNA合成及其具体操作流程探析DNA合成是生物科学中的重要技术手段，通过人工合成DNA序列，科学家可以进行基因修饰、基因工程以及生物学研究等。
本文将探析DNA合成的基本原理及其具体操作流程。
一、DNA合成的基本原理DNA合成是指通过人工合成DNA链的方法，将特定的DNA序列合成出来。
DNA合成的基本原理是利用核苷酸分子之间的磷酸二酯键反应，将单个的核苷酸链接成DNA链。
DNA合成的一般步骤包括：脱保护、酶切、连接和纯化等。
1. 脱保护：DNA合成通常使用的是有机化学方法，在合成过程中，核苷酸的羟基会被保护基团所保护，以防止其与其他核苷酸发生反应。
在DNA链合成完毕后，需要通过化学方法将保护基团去除，使得DNA链上的每个核苷酸都暴露出可反应的羟基。
2. 酶切：在DNA合成过程中，需要将已合成的DNA链切割成所需的片段。
通过使用特定的限制性内切酶，可以在特定的位置切割DNA 链。
酶切的结果是一条含有相应酶切位点的DNA链断裂，并暴露出能够连接的末端。
3. 连接：DNA片段合成完成后，需要将这些片段连接起来，形成完整的DNA序列。
连接的方法包括DNA连接酶催化的连接反应、连接酶独立的连接反应等。
连接反应的关键是将两条DNA片段的末端通过磷酸二酯键连接，形成连续的DNA链。
4. 纯化：合成出的DNA链需要进行纯化处理，将其中的杂质去除，以获得较纯的DNA产物。
纯化的方法包括凝胶电泳、柱层析、质粒放大复制等。
通过这些纯化方法，可以去除多余的核苷酸、限制性内切酶、连接酶以及其他杂质。
二、DNA合成的具体操作流程DNA合成按规模可以分为小规模合成和大规模合成两种。
下面将重点介绍小规模DNA合成的具体操作流程。
1. 设计合成序列：首先，需要根据研究的需要和目的，设计合成所需的DNA序列。
合成序列可以通过计算机软件进行设计，并考虑到所需的限制性内切酶位点、引物结合位点等。
2. 下单：将设计好的DNA序列提交给合成公司，进行下单。
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dT-phosphoramidite
O
OCH3 O N H3CO O O O P N N
OCH3 N
NH O N H
HN
H 3C O
O
O O O P
N
O
N
O
N
CN
CN
dG-phosphoramidite
dC-phosphoramidite
1. 脱DMT （Detritylation）
DM T O Base 1
多聚酶链式反应
寡核苷酸的化学合成原理
目前，oligo DNA的合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法，亚 磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上，经过四步循环反应：脱 保护、耦连、加帽、氧化，逐一将一个一个核苷酸单体连接上去， 最终完成DNA链的合成。此法具有高效、快速偶联、起始反应物比 较稳定的优点。
U 尿嘧啶 Uracil
H N H N N o g i l o O C 胞嘧啶
O N H N N N o l i g o H N H G 鸟嘌呤
O H N H N
N H N N N N o l i g o o g i l o O
T 胸腺嘧啶
A 腺嘌呤
寡聚核酸的用途
PCR扩增 DNA测序 亚克隆，点突变 基因建构（全基因合成） 反义核酸
各纯化方法的比较
纯化方法
C18柱脱盐
优 点 和 缺 点
省时省力，但只能去除盐分，不能去除比目的片段短的小片段。
OPC PAGE HPLC
省时省力，纯化效果略好于C18柱，但对于小片段的去除效果 不太好，并且吸附量低，对于长于25bp的片段纯化效果不好。
纯化效果较好，能去除小片段，与C18柱联用效果更好，缺点 是费时费力，样品损失大。 自动化程度高、省人力，可以去除小片段，纯化效果较好，缺 点是设备昂贵，纯化量小，通常不能纯化40bp以上的片段。
优点：方便、快捷。 缺点：其专一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段带 入的可能，而且负载量小，特别是对长于25个碱基 以上的片段纯化效果不好。
PAGE 纯化
聚丙烯酰胺凝胶电泳法，利用不同长度片段DNA在凝胶 中迁移率不同来分离大小片段。由于各分子所带电荷和 大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度，大片段迁 移速度慢，待目的片段与缺碱基片段分开后，经过剥离 凝胶，切割目的片段，浸泡碎胶，再从泡胶的盐溶液中 回收目的DNA。 优点：纯化效果好，尤其是纯化长链效果好。 缺点：费时费力，样品损失大。
O B a s e 1 O
耦连中未反应核苷酸链
已加帽核苷酸链
4. 氧化 （oxidation）
D M T O
B a s e 2 O
D M T O
B a s e 2 O
O O N C H C H C O P 2 2
I 2
B a s e 1 O
O O N C H C H C O P B a s e 1 2 2 O O O C P G
B a s e 2 O
O P NO C H C H C N 2 2 NN N
O C P G
O N C H C H C O P O 2 2
B a s e 1 O
O C P G
3. 加帽 （Capping）
O H O B a s e 1 A c e t i c A n h y d r i d e O O C P G O O O O C P G
纯
C18柱脱盐纯化 OPC 纯化 PAGE 纯化
化
HPLC 纯化
C18柱脱盐纯化
C18柱上一种活性炭柱子，又称为简易反相柱，它对DNA 有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱， 所以能有效地去除盐分。 优点：所有纯化方法中最简单的一种。
缺点：不能有效去除比目的片段短的小片段，前提是合成 效果很好时才能选用此法。
PCR：Polymerase Chain Reaction
PCR是由美国科学家穆利斯(Kary Mullis)提出的一种体 外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法， 此技术获得1993年诺贝尔化学奖。 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板， 以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚 合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直 至完成新的DNA合成。 基本反应步骤 ：高温变性 → 低温退火 → 适温延伸。
iP r 2 N
O C H 2C H 2C N
iP r 2 N H
O C H 2C H 2C N
N N D M T O O O P N B a s e 2 N
N
N N N
O C H 2C H 2C N
b. 耦连 （Coupling）
D M T O D M T O B a s e 2 O H O B a s e 1 O
O O CPG
TCA
HO
O O CPG
B ase 1
DM T
CPG：Controlled pore glass，可控微孔玻璃珠，作为寡居核苷酸依附的 固体载体。
2. 耦连 （Coupling）
a. 活化 （Activation）
D M T O O O P B a s e 2 H N N N O P N D M T O O B a s e 2
脱氧核苷酸
核苷酸
Base=A, G, C,T
Base=A, G, C, U
N H 2 N N N N H A 腺嘌呤 Adenine
N
O N H
NH2 N N H O
O NH N H O
NNN H 2 H G 鸟嘌呤 Guanine O
NH N H O
C 胞嘧啶 Cytosine
T 胸腺嘧啶 Thymine
HPLC 纯化
HPLC根据吸附介质分为反相柱和离子柱。 反相柱是根据疏水性的差别来分离的，即疏水性更 强的长片段比短片段吸附能力更强，后出峰； 离子柱上根据不同长度寡核苷酸带有不同净电荷， 较长的片段带有高电荷比带有电荷低的短片段在离子柱 内流动得慢，从而依次将不同片段洗脱出来。 优点：自动化程度高，省人力，纯化效果好，纯度可达 99%以上，特别是在标记引物和特殊修饰探针纯 化中效果好。 缺点：纯化量小，不能纯化长片段，设备昂贵。
O C P G
核苷酸的纯化方法
在所有合成循环结束后，就得到一个目标DNA片段粗品， 首先需经过氨解步骤，然后再通过各种方式进行纯化。
氨
切
解
割：将合成好的寡聚核苷酸从固体载体（CPG）上化学切割下来。 常用新鲜的浓氨水来裂解CPG 上连接化合物与初始核苷间的 酯键。 脱保护基：将合成好的寡聚核苷酸上的各个碱基与磷酸上的保护基脱掉。 一般用新鲜的浓氨水来处理较长时间以脱掉氰乙基（P）、苯 甲酰基（ dA、dC）、异丁酰基 （dG）。
磷酸
核苷酸
核苷
戊糖：核糖 碱基：A 、G 、C 、U
核 酸
脱氧核苷酸
磷酸
戊糖：脱氧核糖
脱氧核 苷
碱基：A 、G 、C 、T A （腺嘌呤）、G （鸟嘌呤）、C （胞嘧啶）、 U （尿嘧啶）、T （胸腺嘧啶）
H O
O
B a s e
B a s e H O O
O O P O H O H
O O H O P O H O H
该方法的特点： • 第一个核苷酸是3’固定在固相载体上 • 每一个核苷酸依次连接上去 • DNA合成的方向是3’→5’ • 合成是在疏水环境中进行OCH3 HN N 来自 3C O O O O P N N
O
O C H 3
O H N
N
H C O 3 O N O O O P O N
O
N
CN
C N
dA-phosphoramidite
谢
谢
OPC 纯化
利用OPC柱中装有对DMT基团具有特殊亲和力的树脂， 合成DNA片段时保留5’端最后一个碱基上的DMT，所有合 成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有 DMT片段的吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT的片 段吸附能力弱从而被洗脱，然后用酸脱去吸附在OPC柱上 DNA的DMT，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。
寡聚核苷酸
背景介绍
寡核苷酸的化学结构
寡核苷酸的用途
寡核苷酸的化学合成原理
寡核苷酸的纯化方法
DNA的化学结构
双连螺旋结构
1953年，沃森和克里克 发现了DNA双螺旋的结 构，开启了分子生物学 时代，使遗传的研究深 入到分子层次，“生命 之谜”被打开，人们清 楚地了解遗传信息的构 成和传递的途径