克伦特罗荧光免疫层析试纸条的制备及特性研究
盐酸克伦特罗检测方法的研究进展
盐酸克伦特罗检测方法的研究进展盐酸克伦特罗是一种临床常用的药物，常用于治疗心血管疾病和高血压。
克伦特罗也被用于研究细胞的信号传导途径。
为了定量检测盐酸克伦特罗的含量，需要建立可靠的分析方法。
本文将综述盐酸克伦特罗检测方法的研究进展。
盐酸克伦特罗的检测方法主要包括物理化学方法和生物化学方法两大类。
物理化学方法包括高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等；生物化学方法主要包括酶联免疫吸附法、免疫荧光法、生物传感器等。
高效液相色谱法（HPLC）是目前最常用的分析方法之一。
该方法具有分离能力强、分析速度快、检测灵敏度高等优点。
HPLC检测盐酸克伦特罗的条件包括流动相的选择、柱温的控制、流速和检测波长等参数的优化。
近年来，研究者通过改进色谱柱材料和液相色谱柱填料，进一步提高了方法的分离能力和分析速度。
毛细管电泳法（CE）是一种电分离技术，其分离效率取决于使用的毛细管和电场强度。
CE检测盐酸克伦特罗的关键是控制pH值和缓冲液浓度，以增强样品的分离效果。
研究人员还通过改进偏析电泳、等温电泳等技术，提高了方法的分离效率和检测灵敏度。
酶联免疫吸附法（ELISA）是一种高度选择性和灵敏度的生物化学方法。
通过将特异性抗体固定在酶标板上，可以与盐酸克伦特罗结合并形成可检测的复合物。
ELISA检测盐酸克伦特罗的关键是选择适当的抗体和酶，以及优化反应条件。
近年来，研究人员采用改进的ELISA技术，如发光ELISA和荧光ELISA，提高了方法的检测灵敏度和准确性。
生物传感器是一种新兴的生物化学方法，可以直接测量盐酸克伦特罗与生物分子的相互作用过程。
生物传感器检测盐酸克伦特罗的关键是选择合适的生物分子，如酶、抗体或DNA探针，以及优化传感器的构建和检测条件。
研究者近年来发展了多种类型的生物传感器，如电化学传感器、光学传感器和电子传感器。
盐酸克伦特罗检测方法的研究进展包括物理化学方法和生物化学方法两大类。
未来的研究方向包括提高方法的分析速度、灵敏度和选择性，并探索新的检测技术和应用领域。
时间分辨荧光微球免疫层析法定量检测克伦特罗
时间分辨荧光微球免疫层析法定量检测克伦特罗赖科洋;陈媛【摘要】建立了一种定量检测克伦特罗的时间分辨荧光微球免疫层析法.对抗体标记量、微孔中克伦特罗抗体-时间分辨荧光微球探针的体积以及检测线上抗原浓度进行了优化.通过时间分辨荧光微球试纸条检测仪读取试纸条上检测线和质控线的信号强度,以克伦特罗标准品的浓度为横坐标,以检测线和质控线信号强度的比值为纵坐标建立标准曲线.结果表明:该方法定量检测范围为0.01～0.81μg/L,检测限为0.004μg/L,半抑制率为0.06μg/L.本检测方法具有简便、灵敏度高、快速和可定量等特点,适合于大批量样品的现场筛查.【期刊名称】《江西科学》【年(卷),期】2018(036)002【总页数】4页(P244-247)【关键词】时间分辨荧光微球;克伦特罗;检测;免疫层析【作者】赖科洋;陈媛【作者单位】南昌市第三中学,330029,南昌;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,330047,南昌【正文语种】中文【中图分类】O657.30 引言克伦特罗(Clenbuterol,CLE)是一种β-肾上腺素受体激动剂，最初作为一种饲料添加剂用于畜牧业养殖，能够显著地提高动物瘦肉率，俗称“瘦肉精”[1]。
人食用残留有CLE的肉制品后会引起如心悸、头晕、心跳加快等中毒症状[2]，对人的身体健康造成危害。
因此，我国明文禁止CLE用于饲料添加剂，规定在动物性食品中不得检出CLE[3]。
目前，分析CLE残留常用的方法有气相色谱串联质谱法[4]、液相色谱串联质谱法[5-6]、高效液相色谱法[7]、酶联免疫吸附法[8-9]和胶体金免疫层析法(Colloidal gold lateral flow assay,CGLFA)[10-11]等。
前4种方法具有灵敏度高、准确性好、特异性强的优点，不过检测时间长、操作复杂、费用高，不适合大量样本的现场筛查。
CGLFA具有快速、简便和费用低等优点[12]，但该检测方法灵敏度较差，一般只用于定性分析。
免疫荧光层析试剂盒研发流程
免疫荧光层析试剂盒研发流程免疫荧光层析试剂盒是一种常用于检测生物样本中特定分子的工具。
它能够通过结合抗体和荧光染料，实现对目标分子的高灵敏度、高特异性的检测。
下面我们将介绍免疫荧光层析试剂盒的研发流程。
在免疫荧光层析试剂盒的研发过程中，需要明确目标分子的类型和检测需求。
这通常是通过文献调研和市场需求分析来确定的。
在确定目标分子后，研发团队会着手筛选和购买合适的抗体和荧光染料。
接下来，研发团队会进行抗体的制备和标记。
抗体是免疫荧光层析试剂盒中的核心组成部分，它能够与目标分子特异性结合。
制备抗体的过程通常包括免疫动物免疫、抗体纯化和浓缩等步骤。
为了实现免疫荧光层析试剂盒的高灵敏度和高特异性，研发团队还需要对抗体进行荧光标记。
完成抗体制备和标记后，研发团队将进行试剂盒的组装和包装。
这包括将抗体、荧光染料和其他试剂组装到试剂盒中，并进行适当的包装，以确保试剂的稳定性和长期保存。
在试剂盒组装和包装完成后，研发团队会进行试剂盒的验证和性能测试。
这包括对试剂盒的灵敏度、特异性、稳定性和重现性进行测试，以确保试剂盒的质量和可靠性。
完成验证和性能测试后，研发团队将试剂盒提交给相关机构进行临床试验和注册申请。
这些试验和申请是确保试剂盒的安全性和有效性的重要步骤。
在获得相关机构的批准后，免疫荧光层析试剂盒将正式投放市场。
免疫荧光层析试剂盒的研发流程包括目标分子的确定、抗体制备和标记、试剂盒的组装和包装、验证和性能测试以及临床试验和注册申请等多个步骤。
这些步骤的完成需要研发团队的精心设计和严谨实施，以确保试剂盒的质量和可靠性。
通过免疫荧光层析试剂盒的研发，我们能够更准确、快速地检测生物样本中的目标分子，为科研和临床提供有力支持。
荧光免疫层析法
荧光免疫层析法
荧光免疫层析法是一种检测指标物质的新技术，它可以准确、灵敏、可重复地检测分
子量小于1000Da的蛋白质、神经递质以及其他少量或微量物质。
荧光免疫层析法可以同
时检测一个以上指标物质，从而大大提高了检测效率，是一种具有重要意义的廉价、高效、可重复的增强技术，在生物医学领域受到越来越多的关注。
荧光免疫层析法的原理是利用特定的抗体分子与指标物质结合，使用荧光染料指示物
灵敏地检测抗体的结合，在一定的光度下，抗体沉淀越多，发射的荧光越强，可用于检测
少量和极少量的电子发射物质。
其特点是，它可以迅速检测大量物质，而且在试样量小、
检测灵敏度高时，仍能有较好的特异性检测能力。
荧光免疫层析法应用 tableView 检测时，常需要经过亲和缓冲体的处理，这样可以
避免B＃的重组，从而提高检测的准确性和灵敏度。
另外，还需要补充不同蛋白质的抗体，以提高检测的特异性和灵敏度。
在操作过程中，还可以采用模拟多元抗体反应，以提高检
测的准确度。
在荧光免疫层析法检测时，实验条件也影响最终结果，实验室应为每个指标物质选定
一组实验参数，以保证实验质量，以防止偏差。
此外，常规维护也是非常重要的，荧光免
疫层析仪需要定期维护，以确保其精确性、稳定性及准确性。
总之，荧光免疫层析法是一种准确且灵敏的检测技术，它可以准确、快速地检测指标
物质的含量，具有很多优势，已广泛应用于免疫检测和生物样品分析等技术中。
但同时，
它也需要精心调整实验条件，，再加上定期的维护，才能确保检测结果的准确性和可靠性，才能发挥最大的性能。
胶体金试纸条的制备
结合垫(Conjugate pad)：
玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质，多种规格，批间稳定。
结合垫的作用主要为：
- 吸附一定量的金标结合物颗粒； - 吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上； - 保持金标结合物颗粒的稳定性； - 保证金标结合物颗粒定量完全释放等。
玻璃纤维膜/聚酯纤维膜
胶体金免疫层析试纸模式双抗体夹心模式疫病抗原检测竞争模式小分子物质检测spa蛋白g模式疫病抗体检测双抗体夹心模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显色显色竞争模式判定检测线质控线阳性不显色显色阴性显色显色spag蛋白模式判定检测线质控线阳性显色显色阴性不显色显色在兽药残留检测中的应用zhang等用克伦特罗制备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针然后将偶联bsa的克伦特罗作为t线以竞争模式组装成试纸用于样品的克伦特罗残留检测为我国食品安全检测提供了有效的工具
4、5 号管颜色无变化与对照颜色一致，最低蛋白量即为4 号管的蛋白量。
最终结合（McAb）
• 取100ml金溶液，调整pH值至8.2 • 调整滤过和离心的抗体溶液（0.1μg/μl）至
pH8.2 • 当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的
抗体（蛋白最小浓度量加10%即蛋白稳定 量），大约5分钟加完 • 在金标溶液中加入10ml滤过的10％BSA至 终浓度为1%，并轻轻搅拌10分钟。
» 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三 钠，Na3C6H5O7.2H2O
» 当获得深红颜色的溶液时停止加热
胶体金的合成
胶体金 1％柠檬酸 粒径 三钠加入量 （nm） （ml）*
16
2.00
24.5 1.50
41
1.00
71.5 0.70
荧光免疫层析技术原理进展ppt课件
• ②较大的Stokes 位移和狭 窄对称的荧光谱峰。
• 使得用同一激发光源可同 时激发不同大小的量子点， 产生不同发射光谱，使同 步检测多样本成为可能。
• ③QDs 荧光性质稳定，可 长期保存，经受反复多次 激发。
35
④生物相容性好 物理结合
化学偶联
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量子点在免疫层析中的应用
• 量子点是一种新的荧光标记物，目前在免疫层析 中得应用相对UCP，胶体金较少见报道。
19
• 胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗 粒表面的过程。
• 由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一 个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使 胶体金处于稳定状态。
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• 胶体金作为标志物有以下优势: • ①几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单，
效率高，用量少，便宜，基本不改变被标 记蛋白的活性。且稳定，无毒，使用方便， 保质期长。 • ②不同直径的纳米金可以用于多重标记。 • ③结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼 观察。
• [1]王倩倩，颜红侠，李朋博，等． 碳纳米管的纯化、性 能及应用［J］． 化学工业与工程，2010，27( 3) : 259-265．
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胶体金作为标记物的应用
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试孕纸
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应用（定量）
• 08天津大学精密仪器 与光电子工程学院与 天津市进出口检验检 疫局合作开发研发一 种便携式仪器。
• 竞争法原理 • 用于农药残留定量检
测
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2 镧系元素 • 镧系元素又称为稀土金属元素，指元素周
期表中原子序数 57～71 的所有元素。
长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射
强度。
6
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克伦特罗荧光免疫层析试纸条的制备及特性研究李静宇;何小维;刘晓云;李文美;邓建超【摘要】本研究旨在制备性能优异的克伦特罗(clenbuterol,CLB)荧光免疫层析快速定量检测试纸条,为实现其产业化应用奠定基础.采用荧光胶乳微粒为标记物,以抗原包被浓度、膜干燥时间、混匀反应时间、反应温度及层析时间为单因素优化制备了CLB荧光免疫层析试纸条,并对该试纸条的检测限、特异性、临床准确度及添加回收率、精密度和稳定性进行了评价.最佳制备条件:抗原包被浓度2.0 mg/mL,膜干燥时间5d,混匀反应时间1 min,反应温度25℃,层析时间15 min.评价结果显示,试纸条检测限可达0.35 μg/L;CLB与其他8种同类药物交叉反应率均小于0.8％,特异性良好;各批添加回收率在80％～120％之间,准确度达到要求;不同CLB浓度下变异系数(CV)均小于5％,符合精密度标准;此外,稳定性试验验证了该试纸条稳定性良好.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)010【总页数】6页(P2606-2611)【关键词】克伦特罗;荧光免疫层析法;试纸条;快速检测【作者】李静宇;何小维;刘晓云;李文美;邓建超【作者单位】华南理工大学轻工与食品学院,广州510640;华南理工大学轻工与食品学院,广州510640;广州万孚生物技术股份有限公司,广州510663;华南理工大学轻工与食品学院,广州510640;广州万孚生物技术股份有限公司,广州510663;广州万孚生物技术股份有限公司,广州510663【正文语种】中文【中图分类】R155.5克伦特罗（clenbuterol，CLB）俗称“瘦肉精”，是一种β－肾上腺素受体激动剂，在畜牧生产中大剂量使用可明显提高瘦肉率［1］。
临床上它可用于治疗人的呼吸道疾病和慢性阻塞性肺病，而且具有一定程度的营养重分配作用［2］。
然而其毒副作用明显，人食用含一定浓度CLB的肉制品时会引发中毒现象，严重时会导致死亡［3－4］。
因此，各国政府明确规定禁止向饲料中添加CLB。
1997年，中国农业部也明文规定禁止在饲料中使用CLB，但实际生活中其非法使用现象仍有发生。
因此建立灵敏度高、简便快速的克伦特罗检测技术在现今社会显得尤为必要。
目前CLB的常用检测方法主要有酶联免疫吸附测定法［5］、气相色谱—质谱法（GC－MS）［6］和高效液相色谱法（HPLC）［7］等。
上述方法尽管灵敏度和准确度高，但费用昂贵、检测方法复杂，且不适于市场现场监督。
筛查方法用的较多的是胶体金法，该法简便快捷、费用较低，已广泛用于食品安全现场初筛检测［8－10］，但该方法在定量检测和灵敏度方面存在不足。
为弥补现有检测方法中检测过程复杂、费用昂贵、灵敏度不高等不足，以荧光微球为代表的发光标记材料已成为免疫层析定量检测的备选标记物，并用于快速检测试纸条的制备［11－13］，但荧光免疫层析法目前还处于研究阶段。
本试验通过荧光免疫层析体系的建立和优化制备了一种具有高灵敏度和特异性的试纸条，并对其检测限、特异性、临床准确度及添加回收率、精密度和稳定性进行了评价，提供了一种快速定量检测CLB的新型方法，为CLB 试剂盒的市场开发奠定了基础。
1 材料与方法1.1 试剂与仪器硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司；荧光胶乳购自美国Bangs Lab公司；PVC 板购自上海杰一生物技术有限公司；吸水纸购自上海金标生物科技有限公司；CLB、莱克多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸妥洛特罗、盐酸班布特罗、盐酸氯丙那林、盐酸特布他林、酒石酸托特罗定、富马酸福莫特罗标准品均购自中国药品生物制品检定所；猪尿样本采自广州某屠宰场；荧光胶乳微球标记的抗克伦特罗单克隆抗体和羊抗兔IgG 标记抗体通过试验自制；喷膜包被液和标记胶乳稀释液均由广州万孚生物技术股份有限公司自制。
飞测Ⅱ型荧光定量检测仪购自万孚生物技术有限公司；GS201型切条机购自杭州峰航科技有限公司；Iso Flow 型喷膜机购自美国Biodot 公司；QL－901型漩涡振荡器购自长沙英泰仪器有限公司；CP224S型精密电子天平购自德国Sartorius公司。
1.2 检测原理CLB免疫层析试纸条的检测采用竞争法，荧光胶乳微粒与CLB 抗体共价结合。
将检测样本（尿样）加入荧光标记物中，其荧光标记CLB 抗体可与尿液中的CLB结合，形成复合物，而包被在硝酸纤维素膜上检测区（T）的CLB－BSA 偶联物也竞争结合荧光标记CLB抗体。
当含CLB样本与荧光标记物混合后滴加至检测卡的加样孔中，在层析作用下混合液沿着硝酸纤维素膜向前移动，样本中所含CLB量越多，可与T 区CLB－BSA 偶联物结合的荧光标记的抗体越少，从而使T 区测得荧光检出值降低。
通过荧光检测仪扫描T 区荧光信号强度，可检测出样本中CLB含量。
1.3 试验方法1.3.1 试纸条的制备本研究运用液相的荧光免疫层析方法进行试纸条的制备。
选用包被抗原浓度、膜干燥时间、混匀反应时间、反应温度、层析时间为考察因素，通过单因素试验优化反应工艺。
具体方法：先将硝酸纤维素膜贴于PVC 板的包被膜区，用包被缓冲液将CLB 包被抗原和羊抗兔IgG 稀释至一定浓度后喷到包被膜的检测带（T 线）和质控带（C线）上，置于50 ℃烘箱中干燥一定时间后密封保存。
随后，在PVC 板上顺次相互搭接样品垫、硝酸纤维素包被膜和吸水纸，用切条机切割成4mm 宽的试纸条，将试纸条放入卡盖中压紧，备用。
1.3.2 样本检测将待测样品和荧光胶乳微球标记抗体混匀反应一段时间后，取80μL 混合液滴加至检测卡加样孔中，一定温度下水平放置一段时间后将检测卡插入荧光定量仪中，仪器将自动读取并显示测试结果。
1.3.3 试纸条性能测试检测限：按1.3.2的检测步骤，取20份空白尿液进行测定，先根据标准曲线求出测定值，检测限等于测定值的平均值加上3倍标准差。
特异性：特异性用交叉反应率来表示，在阴性猪尿中添加莱克多巴胺、硫酸沙丁胺醇、盐酸妥洛特罗、盐酸班布特罗、盐酸氯丙那林、盐酸特布他林、酒石酸托特罗定、富马酸福莫特罗，添加浓度为1 000μg／L，用试纸条进行测试。
交叉反应率计算公式：临床准确度及添加回收率测试与精密度测试：取10份阴性猪尿样本，每份分别添加1、3、5μg／L 3个浓度的新鲜猪尿配制的CLB标准品，按1.3.2中的方法检测，根据荧光检测仪T／C 值和标准浓度工作曲线计算出检测浓度，检测浓度与添加浓度的比值百分率为回收率，同时计算变异系数（CV），分析精密度。
稳定性：本试验测试试纸条在1年的保存时间是否有效。
按常理，将检测卡置于50℃1个月未变质，相当于室温1年有效，荧光试剂37 ℃放置7d，相当于4 ℃1年有效。
本试验将检测卡置于50 ℃1个月、荧光标记抗体37 ℃放置7d加速反应后与未加速的试纸条与和荧光标记抗体作对比，考察其稳定性。
2 结果与分析2.1 荧光免疫层析试纸条工艺条件优化2.1.1 包被抗原浓度当膜干燥时间5d，混匀反应时间5 min，混匀反应温度25 ℃，层析时间20min时，由图1可知，包被抗原浓度越高，初始信号值越高，荧光信号梯度越明显，综合考虑选择2.0mg／mL为本试验包被抗原浓度。
图1 包被抗原浓度对T／C值的影响Fig.1 Influence of CLB concentration on T ／C value2.1.2 膜干燥时间当包被抗原浓度2.0mg／mL，混匀反应时间5 min，混匀反应温度25 ℃，层析时间20 min时，由图2 可知，干燥时间达到5d以后，荧光信号值随CLB标准品浓度的变化基本趋于稳定，说明干燥已达到平衡，因此选择5d 作为最佳干燥时间。
2.1.3 混匀反应时间当包被抗原浓度2.0mg／mL，膜干燥时间5d，混匀反应温度25 ℃，层析时间20min时，由图3可知，0.5～30min内，T／C值随混匀时间变化基本保持稳定，从快速检测的角度出发，选择1min为最佳混匀时间。
图2 干燥时间对T／C值的影响Fig.2 Influence of drying time on T／C value图3 混匀反应时间对T／C值的影响Fig.3 Influence of mixing reaction timeon T／C value2.1.4 反应温度当包被抗原浓度2.0mg／mL，膜干燥时间5d，混匀反应时间1 min，层析时间20min时，由图4可知，23～27 ℃时T／C 值变化比较稳定，本试验选择25 ℃为最佳反应温度。
图4 反应温度对T／C值的影响Fig.4 Influence of reaction temperature on T／C value2.1.5 层析时间当包被抗原浓度2.0mg／mL，膜干燥时间5d，混匀反应时间1min，反应温度25℃时，由图5可知，反应时间在15min后，测定结果基本稳定不变，故选择15min为最佳层析时间。
2.1.6 线性关系最优单因素条件下，分别在0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg／L 标准品浓度下绘制标准曲线。
结果显示线性方程为y=－1.0903x＋1.5936，R2=0.9986，线性良好（图6），可输入荧光定量仪器中作为定量标准使用。
图5 层析时间对T／C值的影响Fig.5 Influence of chromatography time on T／C value2.2 荧光免疫层析试纸条性能分析2.2.1 检测限由表1可知，20份阴性尿样检测结果的平均值为0.05μg／L，标准差为0.10μg／L，检测限为平均值加上3倍标准差，则此检测方法对猪尿样本的检测限为0.35μg／L。
图6 克伦特罗标准曲线Fig.6 Standard curve of CLB表1 阴性尿样检测结果（n=20）Table 1 Negative urine detection result（n=20）样本编号测定浓度（μg／L）样本编号测定浓度（μg／L）Samples No.Determinable concentrationSamples No.Determinable concentration 10 11 0.238 2 0 12 0 3 0 13 0 4 0 14 0.260 5 0 15 0 6 0 16 0 7 0 17 0 8 0 18 0 9 0.234 19 0.269 10 0 20 02.2.2 特异性由表2可知，各药物添加浓度为1 000μg／L时CLB与其他8种同类药物交叉率均小于0.8%，表明其特异性良好。
2.2.3 临床准确度及添加回收率分析与精密度分析由表3可知，猪尿中添加1、3、5μg／L高、中、低浓度CLB 标准品的平均回收率均在80%～120%之间，准确度符合要求，平行测定样本的变异系数均小于5%，精密度符合要求。