毛细管胶束电动色谱分离技术
色谱5--HPCE
－ － － － － － －
－ － － －
石英表面 负电荷
＋＋ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－
＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － － － － － － EOF
－ － － － －
水合阳 离子在 表面积 聚
电场作用下 向负极运动
＋
－ －
电渗流的一个独特性质是其具有平面
流型，推动液体流动的力在毛细管内 均匀分布，平面流型的优点是对谱带 的扩散没有直接作用。
热称为焦耳热。受毛细管尺寸、溶液电导、 外加电压等影响。 不均匀的温度梯度和局部的黏度变化会引 起区带展宽。温度变化1℃→黏度变化 2%～3% →淌度变化2%～3% 。 进样塞长度——在进样过程中减少样品塞 长度非常重要。对进样长度的限制是低于 毛细管总长度的（1～2）%。例 70cm长 的毛细管，进样量应小于7mm。
溶质与管壁相互作用——可能导致峰拖
尾 或发生对溶质的完全吸附。对多肽和 蛋白质来说，这种吸附特别严重。可采 用多种方法来减少相互作用： 增加缓冲液浓度以降低有效表面电荷； 在极端pH值下进行分离，使石英表面 硅羟基以不带电的形式存在； 对毛细管壁进行涂层处理。 电分散作用——样品区带与操作缓冲液 的电导差异可产生峰型畸变。
表面活性剂
在毛细管电泳中常添加表面活性剂， 作为疏水性溶质的增溶剂、与溶质形 成离子对，或作为毛细管内壁的改性 剂等，以改善分离效率。常用表面活 性剂有 ： 阴离子—十二烷基硫酸钠（SDS） 阳离子---十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB） 两性离子---N,N’二甲基胺-3-丙烷-1磺酸
化合物 HCl NaCl 甘氨酸 柠檬酸 细胞色素C 人血红蛋白 烟草花叶病毒
扩散系数D 3.05 1.48 1.06 0.66 0.11 0.069 0.0046
5现代色谱分析-毛细管电泳
第二节 毛细管电泳基本理论
电泳和电渗 分离柱效 引起区带展宽的因素
一.电泳和电渗
电泳（electrophoresis）和电渗（electroosmosis) 是毛细管电泳分离理论中最基本的概念。 电泳是指溶液中带电粒子（离子）在电场中定 向移动的现象。 电泳迁移速度Vp为 Vp=µE=µV/L 式中 µ－电泳迁移率（电泳淌度） （electrophoresis mobility)（m2/V.s）
毛细管电泳最基本的分离模式。背景电 解质是缓冲液，分离是基于样品中各个 组分间质荷比的差异。有时需在缓冲液 中加入一定的添加剂，用以提高分离选 择性，改变电渗流的大小、方向或抑制 毛细管壁的示样 品离子的迁移，带正电荷的物质， 迁移方向与电渗流相同，带负电荷 物质的迁移方向则与电渗流相反
1984年，Terabe等建立了分离电中性有机 化合物的胶束电动毛细管色谱。此后相继 出现了毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳、 毛细管电泳手性分离等。
毛细管电泳的优缺点
优点：与HPLC相比，CE操作简单，样 品消耗少，分离效率高，运行成本低。 缺点：在迁移时间的重现性、进样准确 性方面逊色于HPLC，并且不利于制备性 的分离。
在缓冲液中加入有机添加剂，如甲醇、 异丙醇等，或水溶性高分子物质，对 EOF也有较显著的抑制作用。
二.分离柱效
毛细管电泳中，若有电渗流存在，则分离 时间用表观电泳迁移率µapp表示为：
µapp=µ+µeo
按照Giddings的色谱柱效理论，分离柱效表 示为： N＝l2/σ2 σ2是以标准差表示的区带展宽，l为区带移动 的距离。
毛细管电泳装置
1.高压电极槽和进样机构 2.填灌清洗机构 3.毛细管 4.检测器 5.铂丝电极 6.低压电极槽 7.恒温系统 8.数据记录处理系统
毛细管电泳分离技术
3、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用， 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分 离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模 等的电荷 式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DNA排序的重要手段。 式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DNA排序的重要手段。 CGE能获得良好分离 排序的重要手段 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。
1、毛细管区带电泳 capillary zone electrophoresis ，CZE
样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离,比值愈大, 样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离,比值愈大, 跑得愈快. 跑得愈快. 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。
2、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC） micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂， 1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂 浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 在电场力的作 用下， 用下，胶束在柱中 移动。 移动。
2.药物分析 2.药物分析
检测体液或细胞中某 些代谢产物的分析； 些代谢产物的分析； 尿液中的氨基酸含量 作为临床诊断糖尿病的辅 助手段； 助手段； 采用毛细管区带电泳 方式， 11min内分离17 min内分离17种 方式，在11min内分离17种 药物； 药物；
毛细管电泳色谱在手性药物拆分中的应用
毛细管电泳色谱在手性药物拆分中的应用毛细管电泳色谱（CE）作为一种高效，高灵敏度，高分辨率，快速，经济的分离技术，在分析和拆分手性药物方面拥有极大的潜力。
手性药物通常由左右对映异构体组成，其中只有一种异构体具有治疗价值，另一种异构体可能会对人体产生负面影响。
因此，拆分出具有治疗效果的单一手性异构体对于药物的研究和开发至关重要。
毛细管电泳色谱是通过基于电场的毛细管胶体电泳技术进行分离，同时结合对分子电荷和大小的分析实现拆分的。
对于手性药物的拆分而言，毛细管电泳色谱避免了传统的手性色谱技术所需的手性色谱柱、手性试剂等昂贵的试剂和设备成本。
此外，毛细管电泳色谱还可以在光学比旋、荧光检测和质谱检测等多种检测方法下进行分析，同时可用于在线监测反应进程，这些特点使其成为一种非常有前景的手性药物拆分技术。
在毛细管电泳色谱中，选择合适的胶体和电解液对于药物分离至关重要。
对于药物分析，它们通常是带电离子。
因此，电解质的浓度和pH值的调整为药物分离中电荷作用至关重要。
此外，对手性药物的分离和拆分，还需要使用手性配体，如大环糖或丙氨酸等手性药物分离剂，以进行拆分操作。
手性配体能够与药物形成配合物，并使药物具有差异化的亲和力，从而实现手性药物的有效分离。
通过毛细管电泳色谱实现的手性药物分离与拆分，使得我们能够更好地了解药物对人体的影响，并确保临床治疗中使用的药物具有最大的疗效和安全性。
此外，这项技术还可以用于药品质量控制和新药的研发，对于药品的制造工艺控制及质量保证具有重要意义。
总之，毛细管电泳色谱作为一种高效，经济，便捷的手性药物拆分技术，使分析化学家能够更好地探索手性药物的分子结构、性质、制造工艺以及临床应用。
它在药学、环境科学、生物技术和食品科学等领域也得到了广泛应用。
胶束电动毛细管色谱法分析头孢吡肟与其E异构体等杂质
ｍｉ ｌ ｒ ｌｃ ｏ ｉｅｉ ｃｐｌ ｒ ｒｍａｏ ｒｐ ｙ（ Ｃ ） ｓ ｇｓ ｄ ｍ ｏ ｅｙ ｌ ａ Ｓ ） ｓｈ ｃｌ ｒ ｈ ｓ ｃ ｌ ｅｔ ｋｎ ｔ ａ ｉａｙｃ ｏ ｔｇａ ｈ ＭＥ Ｃ ｕ ｉ ｉ ｄ ｄｃ ｌ Ｕｐ ｔ ＤＳ ａ ｅ ｅｌ ａｅ ｅａｅ ｒ ｃ ｌ ｈ ｎ ｏｕ Ｓ ｈ ｅ（ ｔ ｍｉ ａ ｐ
ｗａ ｖ ｓｉ ａ ｅ ． ｅ ｈ ｄ Ｔ ｅｅ ｅ ｔ ｏ Ｈ， ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｏ ｈ ｓ ｈ ｔ ｕ ｅ ｏ ｕ ｉ ｎ Ｓ Ｓ ｍｉｅ ｌ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｓ ｎ ｅｔ ｔｄ Ｍ ｔ ｏ ｓ ｉ ｇ ｈ ｆ ｃｓ ｆ ｐ ｃ ｎ ｅ ｔａｉ ｆ ｏ ｐ ａ ｅ ｆ ｒ ｌ ｔ ， Ｄ ｃ ｌ ｃ ｎ ｅ ｔ ｉ ｏ ｐ ｂ ｓ ｏ ｅ ａ ｏ
摘要 ： 目的 以十二烷基硫酸 钠（ ＤＳ胶 束为准固定相 ，考 察头孢 吡肟、头孢吡肟Ｅ Ｓ ） 异构体及其他未 知杂 质在胶束 电动毛 细管色谱（ Ｃ ） ＭＥ Ｃ 分离模 式下的分离行为 。方法 研 究了运行 缓冲液的ｐ Ｈ值 、磷酸盐浓 度、Ｓ 浓度 、 甲醇体积分数、分离 电 ＤＳ 压、分离温度等因素对头孢吡肟 、Ｅ 异构体及其他杂质 的迁移 时间、分离度 以及可分离 出的杂质个数 的影响。结果 发现上述 因素对 头孢吡肟 与诸杂质 问的分离及检测有显著 的影 响，尤 以ｐ Ｈ值为最 。它不仅影响它们的迁移时间和分离效率 ，还直接影响 头孢吡肟及其杂质峰 的检测 。优化后 的分离条件 ：运行缓冲液 为７ ｍｍｏ／ 磷酸盐／Ｏ ｍ ｌ Ｄ －％甲醇（Ｈ ．） ０ ｌ Ｌ ｌＯ ｍｏ Ｌ Ｓ Ｓ５ ／ ｐ ７０ ，分离 电压为 １ｋ ５ Ｖ，分离温度为２ ＂ ５Ｃ。用非涂渍石英毛细管５ ｃ ｐ 有 效长度４ ． ｍ） １ｍＸ７ ＿ ５ ｍ（ ２５ ，压力进样５ ，检测波长２ ４ ｍ。结论 本法可分 ｃ ｓ ５ｎ 离出３ 个杂质 ，诸杂质彼此间及与头孢 吡肟 间可 得到有效 分离，可用于测定盐酸头孢吡肟 的含量和有关物质 。 ４ 关键词 ： 胶束 电动毛细管色谱 ；头孢吡肟；头孢吡肟Ｅ 异构体 ；含量测定 ；有关物质
色谱分析法第九章 毛细管电泳法简介-精品文档
5)CGE中使用改性剂
9.5.4毛细管等电聚焦(CIEF) 1)毛细管等电聚焦原理
毛细管等电聚焦属于毛细管电泳中的一种聚焦技术类型，其溶
质通常是蛋白质，分离基于蛋白质等电点(PI)的差异。毛细管内充 满两性电解质和蛋白质溶液，加上一个电场，在毛细管中产生一个
pH梯度。各种蛋白质因为它们的等电点不同，而在毛细管内聚焦为
图9.6 溶质通过毛细管的顺序
图9.7阳离子、中性分子、阴离子 的电泳谱图
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1)电渗流的作用 2)电渗流的产生
图9.8 电渗流的产生
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图9.9 不同驱动力的流型和相应的谱带峰形 3)电渗流的速度和迁移率 (1)电场强度
(2)缓冲液的pH值
子的尺寸和离子所带电荷的大小和符号。
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图9.1 毛细管电泳示意图 9.1.2区带电泳 9.1.3引起区带扩散的因素 9.1.4管的直径对对流扩散的影响
9.1.5介质中的电泳
9.1.6毛细管电泳
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9.2毛细管电泳体系 9.2.1概述 从概念上来讲，毛细管电泳体系比较简单。如图9.2所示，其 主要组成有样品池、入口池、出口池、毛细管、检测器、高压电 源、数字结果处理设备，如一台分析仪或一台计算机。
许多狭小的区带。毛细管内的溶液在动力作用下通过检测器而产生 电泳图。
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2)毛细管内形成pH梯度 3)等电聚焦
图9.13 CIEF分离机理示意图
高效毛细管电泳法原理
毛细管区带电泳（CZE）
CZE又称毛细管自由电泳，是毛细管电泳中最基本、应用最普遍的一种模式。它在毛细管中 仅填充缓冲液，基于溶质组分在电场中的迁移速度不同而分离。前述的基本原理即是CZE 的基本原理。
毛细管胶束电动色谱（MECC）
毛细管胶束电动色谱是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离新技术，也是毛细管电泳中唯 一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。
简称毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE），指以高压电场为驱动力，以毛细管为 分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分 配技术。CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。
基本装置
CE 的基本装置包括一个高压支流电源、一根毛细管、一个检测器及两个供毛细管两端插入 而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。
高效毛细管电泳
高效毛细管电泳相对于经典电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管, 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高；
电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加。
基本理论
在电解质溶液中，带电粒子在电场作用 下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移。迁 移速度为：
试中Vep为离子电泳迁移速度， μep为电泳淌度，E为电场强度, q为离子电荷量，η为介质粘度， r为离子半径。
Vep=μep ·E=
q
·E 6πηr
基本理论
CE所用的石英毛细管柱，在pH>3时，石英毛细 管壁上的硅醇基(— SiOH）在水溶液中发生电 离，产生的SiOˉ负离子使毛细管壁内表面带负 电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成 了双电层。
胶束毛细管电动色谱法快速测定人血清白蛋白和人免疫球蛋白
熔融 石 英 毛 细 管 ４ ． ｍ（ 效 长 度 ３ ｍ） × Ｏ ２ｃ 有 ０ｃ
７ ｍ（． ） 浙江萧山产 ｐ ｓ ０ ５ｌ ＩＤ 。 ｘ Ｈ 一１Ａ酸度计 。
１ ２ 试 剂与 材料 ．
ＩＧ 和 Ｈ Ａ 购 自 Ｆｕ ａ 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ｇ Ｓ ｌｋ 。
（Ｄ ）（ 学纯 ， 海 沪 一 试剂 公 司） ０ ４ ＳＳ 化 上 ； ．５
人血 清白蛋 白 人免疫球蛋 白
文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ：６ １ ７ ５ ２ １ ）２一 ｏ ５一 ３ １７ —８５ （ ０ １ ｏ ｏ ８ Ｏ
Ｆａ ｔＳ ｐ ｒ ｔ ｎ ａ ｄ Ｄｅ ｅ ｍｉ ａ ｉｎ ｏ ｇ ａ ｄ ＨＳ ｉ ｓ ｅ ａ ａ ｉ ｎ ｔ ｒ ｎ ｔｏ ｆＩ Ｇ ｎ Ａ ｏ ｎ
偏差分别小 于 ２０ ％和 ４６ ％ ， ．４ ．２ 回收率在 ９ ．％ 一 ０．％之 间。建立 的方法在优化条 件下 ， ２２ １８７ 可在 ５ｍｎ ｉ 内完成人
血 清白蛋 白和人免疫球蛋 白的分析测定 。 关键 词 ： 胶束毛 细管电动色谱法
中图分 类号 ：６ ７８ Ｒ ３ ． ０ ５ ．；３ １１
ａ ａｂ ｍｉ ｎ ｕ ｎ ｏ ｍａ ｍｍｕ ｏ ｌ ｂ ｌ ｒ ｅ ｓｔ ａ ． ４ ｍ ｌ ｕ ｎ ａ ｄ ｈ ｍａ ｎ ｒ ｌｉ ｎ ｇｏ ｕ ｉ ａ ｅ ｌ ｓ ｎ ２ ０ ％ ａ ｄ４． ２ ．ｒ ｓ ｅ ｔ ｅｙ ｎ ｈ ｎ ６ ％ ｅ ｐ ｃ ｉ ｌ ．Ｔ ｅ ｒ． ｖ ｈ ｅ
在 毛 细管 电泳 分离 中 ， 机 改 性剂 能 够 改 善 流 有 动相 极 性 、 配 系数 以及 电渗 流 ， 以 向缓 冲溶 液 中 分 所
报
第２ ６卷
值、 添加剂 或涂层 柱等方 法 解决 蛋 白质壁 吸 附问 题－ 。但极端 ｐ ５ ］ Ｈ值会 降低 分离选 择性 ， 加剂 添 的效果则常常难以预料 ， 而涂层柱存在寿命及工作 ｐ Ｈ值范围窄等 问题 。陈义等采用径 向电场调制毛 细管 电泳 法分 离 蛋 白质 ， 方 法操 作 较 复杂 。张 此 宣等利用微乳液毛细管 电动色谱研究 了蛋 白质， 但 是微乳液毛细管 电动色谱分离 时问长 。因此， Ｊ 有 必要研究快速准确分析蛋 白的新方法。 － 以 Ｈ Ａ和 ＩＧ两种 蛋 白为研 究 对 象 ， 立 本文 Ｓ ｇ 建
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基本原理
毛细管电色谱(Capillary electrochromatography, 简称 CEC)是在毛细管中填充或在管壁涂布、键合液相色谱的固定相,然后在毛细管的两端施加高压直流电，在电场作用下产生电渗流(Electroosmotic flow ，简称EOF）,流动相在电渗流的驱动下通过色谱柱。
对中性化合物，其分离过程和HPLC类似，即通过溶质在固定相和流动相之间的分配差异而获得分离；当被分析的物质在流动相中带电荷时，除了和中性化合物一样的分配机理外，自身电泳淌度的差异对物质的分离也起相当的作用。
毛细管电色谱（capillary electro chromatography，CEC）以内含色谱固定相的毛细管为分离柱，兼具毛细管电泳及高效液相色谱的双重分离机理，既可分离带电物质也可分离中性物质。
毛细管电色谱法是用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法。
因此，毛细管电色谱法可以说是HPLC和HPCE 的有机结合，它不仅克服了HPLC 中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展，而且柱内无压降，使峰扩展只与溶质扩散系数有关，从而获得了接近于HPCE 水平的高柱效，同时还具备了HPLC 的选择性。
HPLC是用压力驱动流动相。
流速是随填充微粒的大小和柱长而变化的。
流速在管中呈抛物线轮廓，因而造成了色谱峰谱带的展宽，降低了柱效。
而CEC是采用电场推动流动相。
其线速度是与柱的直径和填微粒的大小无关的，因而在毛细管中几乎没有流速梯度。
谱带展宽效应相应的就十分小。
这点是CEC与HPLC的本质差别，也是CEC效率高于HPLC 的根本。
依靠电渗流（EOF）和电渗流结合压力流推动流动相，使中性和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间吸附、分配平衡常数的不同和电泳速率不同而达到分离分析。
仪器设备: 毛细管电色谱的早期研究是在改装的CE商品仪器上进行的，随着研究的深入和对研究前景的良好预期，现在已有商品仪器既可进行电泳模式也可方便地进行电色谱研究。
目前，主要是Beckman公司的
P/ACE 系列和HP公司的HP3D系列。
检测器根据分析样品性质的不同，可选UV 检测器( 包括DAD ) 、电化学检测器、LIF及CE－MS等。
类型：在毛细管电色谱（CEC）中，色谱柱是电色谱的心脏，按照固定相的装填方式不同可以分为[7]：填充毛细管电色谱(PCCEC)，开管毛细管电色谱(OTCEC)，整体式毛细管电色谱(MCEC)。
PCCEC是将固定相装填在毛细管中，OTCEC是将固定相涂渍或键合在毛细管内壁上，MCEC是通过在毛细管内原位聚合或固化的方法，制成的具有多孔结构的整体式固定相。
根据分离过程中驱动力的不同可以将毛细管电色谱分
为电驱动和压力驱动电色谱。
前者是靠电渗流作为驱动力，这种情况下样品区带可以保持塞状流型，分离效率比较高。
在最初的研究中人们都使用电驱动电色谱。
压力驱动是指除了使用电渗流作为驱动力外，同时可以使用压力作为驱动力，这样可以加快分析速度，便于梯度洗脱，减小气泡生成的可能性。
其缺点是流体力学所引起的抛物线流型使柱效有所损失，一般的操作过程中所使用的压力都比较低。
操作：毛细管电色谱柱的制备
应用和前景
从目前文献报道的情况看，当采用梯度洗脱技术、与质谱联用技术、热光吸收检验器以及无孔ODS快速分析等方法时，毛细管电色谱可成功地实现氨基酸分析。
毛细管电色谱还被应用于肽、蛋白质、核苷酸和DNA 添加物等的分析中。
此外，毛细管电色谱还在离子分析、染料分析、食品分析、环境污染化合物的分离分析；石油化工产品组分的分离分析；手性对映体拆分；样品富集和预浓缩等。
中得到了应用，柱效和分离度均达到令人满意的效果。
目前CEC或pCEC的报道中，很多是以药物为模型化合物来研究评价色谱柱的性能；同时也有很多研究尝试将CEC或pCEC用于生物体液，如尿液等临床药品分析检测中，这为临床或相关药检
机构实现药品的快速高效检测提高了更新更好的选择。
毛细管电色谱(CEC)结合了高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)的共同优点，其分离机理中即包含溶质分配系数的不同又包含电泳淌度的不同，因而选择性好，CEC中流动相是由电渗流驱动的，由于电渗流呈平面流型，因而分离柱效高，又由于电渗流不存在反压，因而可以采用小粒子填料进一步提高柱效。
CEC的理论及应用研究已成为分离分析科学领域研究的热点。
尽管CEC的研究与应用飞速发展，但人们对其认识并不深刻，研究尚处在理论探索阶段。
存在着诸如气泡产生、柱子易断、检测灵敏度低、填料种类有限等问题。
特别是在分离大分子生物样品，如DNA、蛋白质时，尚存在方法匮乏、重现性差等问题。
而这恰是CE、HPLC的优势。
因此，预计在很长一段时间内，三种方法将呈互相补充及相互验证的关系。
CEC能否成为一种实用的分离分析技术主要取决于CEC试验技术的发展。
目前，随着装柱技术、联用技术、梯度洗脱技术等的发展和完善，毛细管电色谱研究已进入实际分析应用研究阶段。
毛细管电色谱技术作为新型的分离分析技术，将有着很大的发展前景。