双片段连接法克隆融合基因及其突变1
双片段连接法克隆融合基因及其突变体
双片段连接法克隆融合基因（Double-fragment Concatenation Cloning）是一种常用的分子生物学技术，用于合成突变基因或融合蛋白质的方法。
该方法利用PCR 技术和DNA重组技术，通过连接两个片段的末端，将两段DNA序列链接在一起，从而构建目标基因或蛋白质的突变体。
以下是双片段连接法克隆融合基因及其突变体的一般步骤：
1. DNA片段扩增：首先，需要设计引物，用于扩增目标基因或蛋白质的两个片段。
这些片段可以是来自同一基因的不同区域，或来自不同基因的特定序列片段。
2. 片段连接：将扩增得到的两个片段进行连接。
这可以通过两种方法实现：
- 交叉延伸PCR法：为每个片段设计引物时，在每个引物的末端额外添加互补的序列。
通过PCR反应，在两个片段的重叠部分进行扩增，生成具有重叠序列的片段。
然后使用这两个片段作为模板，进行第二轮PCR扩增，在两个重叠的序列之间形成连续的完整片段。
- 重叠延伸PCR法：在设计引物时，在每个引物末端添加重叠序列。
通过PCR 反应，在两段叠加部分进行扩增，生成具有重叠序列的两个片段。
然后将这两个片段混合在一起，进行第二轮PCR扩增，以连接两个片段并形成完整片段。
3. 克隆：将连接得到的片段克隆到目标载体中。
这可以使用常见的克隆方法，如限制性内切酶切割和连接、依赖缺失子克隆等。
4. 突变体构建：如果需要构建突变体，可以通过引入点突变、插入序列或缺失序列等方法，在连接得到的基因上引入所需的突变。
双片段连接法克隆融合基因及其突变体方法相对简便，有效地实现了目标基因或蛋白质的合成和突变。
通过此方法，可以对基因结构和功能进行研究，并用于生物医学、农业、生物能源等领域的基因工程研究和应用。
重叠pcr
如下图所示:以融合A,B两基因为例具体说
明,A,B两基因可以相同也可以不同,先分别 用F1,R1和F2,R2两对引物扩增出A基因和B 基因,然后再用F1和R2将两基因连接起来, 得到A,B的融合基因. 也可以设计多对引物, 融合多个基因
4 重叠pcr应用
4.1
构建突变基因 在重叠延伸PCR 中，两个重叠的DNA 片段是分别 从两个独立的PCR 扩增反应得到的。预设突变构建 在重叠区域，存在于两个扩增片段中。设计4 种引 物，用第一对引物扩增含有突变位点及其上游序列 的DNA 片段，第二对引物被用来扩增含突变位点及 其下游序列的DNA 片段，两个侧翼引物含野生型序 列，两个突变引物含有希望引进的突变位点，如置 换插入或缺失。混合两次PCR 的产物，由于两个突 变引物有重叠区，重叠片段之间退火，延伸成异源 双链，加入外侧引物进行第三次PCR，即可得到目 标突变体。
5 重叠延伸PCR构建长片段的
注意事项
5. 1
设计引物的注意事项 相连引物间的重叠区域以15～20个碱基为宜,重叠 区 域 中 应 尽 量 避 免 富 含 AT(ATTTA,AATAA 、 AATTAA等)的序列. 在片段合成过程中,接头区富 含AT的区域极易发生错配. 同时在引物设计中,除 了需考虑一般PCR引物设计的问题外,在Tm值的 控制方面,建议设计的全部引物最好有相同或相近 的Tm值,以便融合扩增步骤的顺利进行,否则可能 会导致引物无法组合使用,这是引物设计的关键,并 且尽量避免出现二级结构及引物二聚体等。
4.2 构建融合基因
重叠延伸PCR 法还可以用于两个或两个以上异源 基因DNA 片段的拼接 。如同致突变引物一样， SOE 引物亦含有末段互补序列，通过PCR 产生 的两个DNA 片段可通过引物延伸进行剪接和扩增， 从而获得重组体。与定点突变不同的是：一是待 融合的PCR 产物来自两个不同的基因；二是通过 SOE 引物在两种PCR 产物中产生相互重叠的链 进而获得融合基因
细胞生物学考试押题及参考答案(1)
一、选择题1-5 BABBB 6-10 BDABB 11-15 ABCAC 16-18 CCC二、填空题1、根据线粒体和叶绿体起源内共生学说，认为线粒体起源于细菌，叶绿体起源于蓝藻。
2、协助扩散和主动运输的主要相同之处在于都需要载体，速度都很快,主要差别在于协助扩散只能顺浓度梯度进行，不消耗能量；主动运输可以逆浓度梯度进行，消耗能量。
3、核纤层结构的组成成分, 属于中间纤维蛋白家族4，核小体的核心由四种组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）各两分子共8分子组成的八聚体，核心的外面缠绕了1.75圈的DNA双螺旋，其进出端结合有H1组蛋白分子。
5、YAC（酵母人工染色体）的构建成功说明：一个有功能的染色体至少有自主复制DNA序列,着丝粒DNA序列, 端粒DNA序列三个不可缺少的功能元件。
6、真核细胞和原核细胞中都存在的rRNA是5SrRNA。
7、细胞周期调控中的两个主要因子细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶（CDK 激酶）和。
细胞周期蛋白其中前者是催化亚基，后者相当于调节亚基。
三、名词解释1.常染色质(euchromatin):间期核中处于伸展状态，压缩程度相对较低、着色较浅的染色质。
2.双信号系统：以PIP2代谢为基础的信号通路中，胞外刺激使转化为IP3和DAG，引发IP3/Ca2+和DAG/PKC 两条信号转导途径，在细胞内沿两个方向传递，实现细胞对外界的应答，这样的信号系统称之为双信号系统。
3.细胞周期同步化：将一个细胞群体内处于不同时期的细胞处于细胞周期的同一时相的方法。
4.多聚核糖体：具有特殊功能与形态结构的核糖体与mRNA的聚合体。
5.细胞凋亡：为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
6.Hayflick界限：正常的体外培养的细胞寿命不是无限的，只能进行有限次数的增殖。
7踏车行为：在一定条件下,微丝的正极由于肌动蛋白亚基不断添加而延长,负极由于肌动蛋白亚基去组装缩短,这种现象称为踏车行为。
融合生物基因实验报告
一、实验背景随着分子生物学和基因工程技术的不断发展，生物基因融合技术在生物制药、基因治疗、农业改良等领域发挥着越来越重要的作用。
本实验旨在探究生物基因融合技术的可行性，通过将两个不同生物的基因片段进行融合，构建重组基因，并在宿主细胞中表达，以验证融合基因的稳定性和功能。
二、实验目的1. 掌握基因克隆和基因融合的基本技术。
2. 验证融合基因在宿主细胞中的稳定性和表达水平。
3. 分析融合基因表达产物的生物活性。
三、实验材料1. 基因组DNA提取试剂盒2. PCR引物3. DNA连接酶4. 限制性内切酶5. DNA标记物6. 载体质粒7. 宿主细胞（如大肠杆菌、酵母等）8. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机等四、实验方法1. 基因克隆- 提取目的基因和载体质粒的基因组DNA。
- 设计并合成PCR引物，用于扩增目的基因和载体质粒的特定位点。
- 进行PCR扩增，获得目的基因和载体质粒的DNA片段。
- 利用限制性内切酶对目的基因和载体质粒进行切割，获得线性化的DNA片段。
- 将目的基因片段与载体质粒片段进行连接，构建重组质粒。
2. 重组质粒转化- 将构建好的重组质粒转化至宿主细胞中。
- 通过筛选阳性克隆，获得稳定表达融合基因的宿主细胞。
3. 融合基因表达分析- 利用RT-qPCR检测融合基因在宿主细胞中的表达水平。
- 通过Western blotting检测融合蛋白的表达和纯度。
- 利用ELISA或细胞活性实验等方法检测融合蛋白的生物活性。
五、实验结果1. 成功构建了融合基因重组质粒，并转化至宿主细胞中。
2. RT-qPCR结果显示，融合基因在宿主细胞中得到了稳定表达。
3. Western blotting结果显示，融合蛋白在宿主细胞中得到了表达，且纯度较高。
4. 生物活性实验结果显示，融合蛋白具有与预期相符的生物活性。
六、实验讨论1. 本实验成功构建了融合基因重组质粒，并实现了融合基因在宿主细胞中的稳定表达。
多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2022, 12(1), 1-8Published Online January 2022 in Hans. /journal/hjbmhttps:///10.12677/hjbm.2022.121001多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因陈婉煜，刘君怡，李国庆，刘媛媛，陈华波*湖北文理学院，基础医学院，湖北襄阳收稿日期：2021年10月16日；录用日期：2021年12月23日；发布日期：2021年12月30日摘要鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实，采取分步扩增与DNA组装相结合的方式，提出一种长基因克隆解决方案。
以克隆人表皮生长因子受体2基因为例，先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。
通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12，再利用双片段连接法将F12与F3一起连接插入载体以构建完整基因。
从双片段连接物中筛选出上百个菌落，经检测和序列测定，得到一个序列完全准确的克隆。
对于难以直接克隆的长基因，可先扩增其各个片段，再将它们拼接成完整基因。
其中双片段连接法可突破严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制，再辅以重叠延伸PCR融合法，即可实现多个基因片段的正确拼接。
关键词基因克隆，重叠延伸PCR，双片段连接法，人表皮生长因子受体2基因Cloning of Human Epidermal GrowthFactor Receptor 2 Gene by MultiFragment AssemblyWanyu Chen, Junyi Liu, Guoqing Li, Yuanyuan Liu, Huabo Chen*Basic Medical College, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang HubeiReceived: Oct. 16th, 2021; accepted: Dec. 23rd, 2021; published: Dec. 30th, 2021AbstractIt was difficult to clone long genes from cDNA library due to a series of factors, such as mRNA in-stability and the low efficiency of reverse transcription. Combining partial amplification with DNA assembly, an optimal solution was proposed for cloning lone gene that was difficult to amplify *通讯作者。
基因工程题库版--名词解释
各种题型确定题目重要题目候补题目不确定答案的题目试卷与题库重复题目名词解释同裂酶（同切点酶）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。
同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们来源各异，识别的靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,特称为同尾酶。
测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。
与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。
限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。
限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。
5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶酶解后，其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。
6. 星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。
当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。
（“非最适的”反应条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。
)克服星号活性的方法：维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等。
综述：无缝克隆与基因融合(中文版)
无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。
准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。
本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。
基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。
传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。
然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。
这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。
这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。
无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。
这是获得杂交基因的理想情况。
以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。
启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。
转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。
启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。
然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。
基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。
分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。
在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。
在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。
只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
第18讲 基因工程(讲义)原卷版
第18讲 基因工程考点01 基因工程★ 考向1 基因工程的理论基础1、基因工程的理论基础2、基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR 技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，启动子在基因的首段，它是RNA 聚合酶的结合位点，能控制着转录的外源基因在受体细胞内表达理论 基础 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能的基本单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
重组DNA ： 载体+目的基因 复制转录 RNA 翻译 蛋白质基因拼接 ①DNA 的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
②DNA 分子都遵循碱基互补配对原则。
③双链DNA 分子的空间结构都是双螺旋结构。
开始；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定。
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
易错警示：辨析农杆菌转化法中的两次拼接与两次导入（1）两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
（2）两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
3、DNA的粗提取与鉴定（1）原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
pcr融合基因的方法
PCR融合基因的方法引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它具有高度敏感性和特异性，并被用于许多实验室中的基因克隆和定量分析。
PCR融合基因技术是一种通过PCR反应将两个或多个不同的DNA片段融合成一个新的基因序列的方法。
本文将介绍PCR融合基因的方法及其在研究和应用中的意义。
PCR融合基因的方法PCR融合基因的方法主要分为两个步骤：设计引物和进行PCR反应。
设计引物在PCR融合基因的方法中，引物的设计非常关键。
引物应选择在目标序列的两个端部，以确保能够扩增目标序列的全部部分。
此外，引物的序列应该避免出现互相配对的碱基，以防止引物之间的互补物相互结合而不是与目标序列结合。
引物的长度一般在18到30个碱基对之间。
在设计引物时，可以借助计算机软件进行序列分析和模拟实验，以确保引物的质量和特异性。
进行PCR反应PCR反应是将引物与模板DNA一起加入PCR反应体系，通过循环进行一系列的温度变化，最终在产物中扩增目标序列。
PCR反应一般包括以下几个步骤：1.Denaturation（变性）：在高温下，模板DNA的双链结构被分离成两条单链。
2.Annealing（退火）：温度降低，引物与目标序列的互补碱基对结合。
3.Extension（延伸）：在适合DNA聚合酶活性的温度下，DNA聚合酶开始合成新的DNA链。
4.循环：重复上述步骤，以连续扩增目标序列。
PCR融合基因的应用PCR融合基因的方法在基因工程和分子生物学研究中具有广泛的应用。
基因克隆PCR融合基因技术可以用于构建重组蛋白、工程酶或其他基因组的目的。
通过PCR 融合基因的方法，研究人员可以将不同的基因片段拼接在一起，形成一个新的功能基因。
重组表达蛋白PCR融合基因技术还可以用于重组表达蛋白的研究。
研究人员可以使用PCR融合基因的方法将目标基因和表达载体连接在一起，然后将其转化到宿主细胞中，使宿主细胞表达目标蛋白。
物种鉴定PCR融合基因技术也被应用于物种鉴定中。
【精编版】2020届人教版高考生物一轮复习专题10《现代生物科技专题 (选考)》测试卷(含答案)
2020届人教版高考生物一轮复习专题10《现代生物科技专题 (选考)》测试卷本试卷分第Ⅰ卷和第Ⅱ卷两部分，共100分，考试时间150分钟。
第Ⅰ卷一、单选题(共16小题,每小题3.0分,共48分)1.已知限制性核酸内切酶XmaⅠ和SmaⅠ的识别序列分别为C ↓ CCGGG和CCC↓ GGG。
有关这两种酶及应用的叙述，错误的是 ()A．这两种酶作用的底物都是双链DNAB． DNA中出现这两种酶识别序列的概率不同C．XmaⅠ切割DNA形成的黏性末端是—GGCCD．使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等2.下列有关胚胎工程及其应用的叙述中，错误的是()A．体外受精和胚胎发育的研究为胚胎工程提供了理论基础B．胚胎移植技术可在畜牧业生产中加速育种进程C．桑椹胚、囊胚是进行胚胎分割的最佳时期D．促进动物超数排卵的激素主要是垂体产生的促性腺激素3.下列有关动物细胞培养的叙述，正确的是()A．动物细胞培养过程中，可用胃蛋白酶处理使细胞分散开B．通过动物细胞培养获得大量细胞，可证明动物细胞具有全能性C．动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础D．动物细胞培养选用的培养材料大多是动物的受精卵4.干扰素是治疗癌症的重要药物，它必须从血液中提取，每升人血中只能提取0.5 μg，所以价格昂贵。
美国加利福尼亚的某生物制品公司用如下方法生产干扰素。
如图所示：从上述方式中可以看出该公司生产干扰素运用的方法是()A．个体间的杂交B．基因工程C．细胞融合D．器官移植5.分析下面图解，判断以下哪一项不是精子、卵细胞发生的区别()A．初级精母细胞、初级卵母细胞的形成时间B． MⅠ和MⅡ的时间连续性C．成熟生殖细胞是否经过变形D．成熟生殖细胞中染色体的数目6.质粒是基因工程中最常用的运载体，下列与质粒有关的叙述正确的是() A．目的基因与质粒在DNA连接酶作用下结合的过程属于DNA分子杂交B．质粒上至少要有一个抗生素抗性基因，以有利于检测重组质粒是否导入C．没有与目的基因重组的质粒也可以进入受体细胞D．质粒上的目的基因必须整合到受体细胞的DNA上才能不被分解7.下图表示高等动物的个体发育过程，下列说法正确的是()A．图中①过程表示胚胎发育，②过程表示胚后发育B．受精卵卵裂处于囊胚形成的过程中，每个细胞的体积不断增大C．兔子、雄鹰和眼镜蛇在个体发育过程中会出现羊膜D．原肠胚是进行胚胎移植的最好时期8.下列过程中，需要采用植物组织培养技术的是()①利用花药离体培养得到单倍体植株②利用秋水仙素处理单倍体试管苗，获得正常纯合植株③利用基因工程培育抗棉铃虫的植株④利用细胞工程培育“白菜—甘蓝”杂种植株⑤马铃薯的脱毒A．①②③B．③④⑤C．①②④⑤D．①③④⑤9.某实验室做了如图所示的实验研究，下列与实验相关的叙述正确的是()A．过程①导入的诱导基因使成纤维母细胞发生基因突变B．丙细胞既能持续分裂，又能分泌单一的抗体C．过程②属于动物细胞培养过程中的原代培养D．过程③④所用的培养基中都含有聚乙二醇10.用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。