重组人生长激素受体胞外段及其突变体S201C
多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2022, 12(1), 1-8Published Online January 2022 in Hans. /journal/hjbmhttps:///10.12677/hjbm.2022.121001多片段拼接法克隆人表皮生长因子受体2基因陈婉煜，刘君怡，李国庆，刘媛媛，陈华波*湖北文理学院，基础医学院，湖北襄阳收稿日期：2021年10月16日；录用日期：2021年12月23日；发布日期：2021年12月30日摘要鉴于从cDNA库中克隆长基因较困难的现实，采取分步扩增与DNA组装相结合的方式，提出一种长基因克隆解决方案。
以克隆人表皮生长因子受体2基因为例，先分别扩增出该基因的三个片段F1、F2和F3。
通过重叠延伸PCR融合前两个片段得到F12，再利用双片段连接法将F12与F3一起连接插入载体以构建完整基因。
从双片段连接物中筛选出上百个菌落，经检测和序列测定，得到一个序列完全准确的克隆。
对于难以直接克隆的长基因，可先扩增其各个片段，再将它们拼接成完整基因。
其中双片段连接法可突破严格的酶切位点要求对单片段顺序连接的限制，再辅以重叠延伸PCR融合法，即可实现多个基因片段的正确拼接。
关键词基因克隆，重叠延伸PCR，双片段连接法，人表皮生长因子受体2基因Cloning of Human Epidermal GrowthFactor Receptor 2 Gene by MultiFragment AssemblyWanyu Chen, Junyi Liu, Guoqing Li, Yuanyuan Liu, Huabo Chen*Basic Medical College, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang HubeiReceived: Oct. 16th, 2021; accepted: Dec. 23rd, 2021; published: Dec. 30th, 2021AbstractIt was difficult to clone long genes from cDNA library due to a series of factors, such as mRNA in-stability and the low efficiency of reverse transcription. Combining partial amplification with DNA assembly, an optimal solution was proposed for cloning lone gene that was difficult to amplify *通讯作者。
egfr突变类型
egfr突变类型【实用版】目录1.EGFR 突变的概述2.EGFR 突变的类型3.EGFR 突变的临床意义4.总结正文【EGFR 突变的概述】表皮生长因子受体（EGFR）是一种跨膜糖蛋白，属于受体酪氨酸激酶家族。
它广泛存在于多种上皮细胞肿瘤中，特别是肺癌。
EGFR 突变与肿瘤的发生、发展及治疗有着密切关系。
【EGFR 突变的类型】EGFR 突变类型主要有以下几种：1.外显子 19 缺失（Exon 19 deletion）：此突变导致 EGFR 蛋白的C-末端结构域缺失，从而影响其功能。
该突变常见于非小细胞肺癌（NSCLC）。
2.外显子 21 点突变（L858R mutation）：此突变导致 EGFR 蛋白的酪氨酸激酶结构域发生改变，使其对某些靶向药物敏感。
该突变同样常见于非小细胞肺癌。
3.外显子 18 点突变（G719X mutation）：该突变会影响 EGFR 蛋白的结构和功能，与肿瘤的发生、发展有关。
此突变主要见于非小细胞肺癌。
4.外显子 20 插入突变（T790M mutation）：此突变使 EGFR 蛋白的酪氨酸激酶结构域发生改变，导致对某些靶向药物产生耐药性。
该突变常见于对 EGFR 靶向药物治疗后的非小细胞肺癌患者。
5.其他点突变：除了上述常见的 EGFR 突变类型外，还有一些罕见的点突变，如外显子 15、17、19、20、21 等位点的突变。
这些突变对肿瘤的治疗和预后影响各异。
【EGFR 突变的临床意义】EGFR 突变类型对肿瘤的治疗和预后具有重要意义。
例如，外显子 19 缺失和 L858R 点突变的非小细胞肺癌患者对 EGFR 靶向药物（如吉非替尼、厄洛替尼等）敏感，往往能取得较好的治疗效果。
而 T790M 突变则预示着患者可能对某些 EGFR 靶向药物产生耐药性。
因此，检测 EGFR 突变类型对于选择合适的治疗方案和评估患者的预后具有重要价值。
【总结】EGFR 突变类型众多，不同类型的突变对肿瘤的治疗和预后影响各异。
重组人生长激素促进人牙髓干细胞的成骨分化
重组人生长激素促进人牙髓干细胞的成骨分化孙菁;廖健;孙江龄;程萍;冯红超【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2024(28)1【摘要】背景:既往研究表明人牙髓干细胞具有良好的成骨分化潜能,是骨组织工程中潜在的种子细胞,目前重组人生长激素对人牙髓干细胞的增殖及成骨分化的作用尚不明确。
目的:探究重组人生长激素对人牙髓干细胞增殖及成骨分化的影响。
方法:采用组织块培养法分离培养人牙髓干细胞,根据药物浓度梯度筛选后,选取10,100,250,500,1000μg/L重组人生长激素干预为实验组,正常培养基培养为对照组。
在干预后第1,3,5,7天采用CCK-8法检测人牙髓干细胞的增殖情况。
选取含10,100,250,500,1000μg/L重组人生长激素的成骨诱导液干预人牙髓干细胞,在诱导第7天,采用碱性磷酸酶染色及其半定量分析法检测碱性磷酸酶活性,采用荧光定量RT-qPCR检测成骨相关基因Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的mRNA表达,在诱导第14天,采用茜素红染色观察成骨矿化情况。
结果与结论:①CCK-8检测结果显示,从干预第3天开始,100,250,500,1000μg/L重组人生长激素均能促进人牙髓干细胞增殖,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01);②与对照组比较,100,250,500μg/L重组人生长激素组人牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性显著升高(P<0.01);100,250μg/L重组人生长激素组人牙髓干细胞的茜素红染色矿化结节数显著增多(P<0.01);250μg/L重组人生长激素组Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素的mRNA表达量升高(P<0.05,P<0.01),100,250μg/L重组人生长激素组Runt相关转录因子2的mRNA表达量升高(P<0.01);③上述结果表明,250μg/L重组人生长激素更适合促进人牙髓干细胞增殖和成骨分化。
表皮生长因子受体
表皮生长因子受体表皮生长因子受体（EGFR）文章来源：易瑞沙更新时间：2010-05-12 字体：[ 大] [ 小] [ 打印]表皮生长因子受体概述表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是原癌基因C-erbB-1 (HER-1)的表达产物，EGFR 家族包括EGFR、C-erbB-2(HER-2)、C-erbB-3、C-erbB-4四个成员，均定位于细胞膜上。
erbB-1广泛分布于除血管组织外的上皮细胞膜上；erbB-2在正常人体腔上皮、腺上皮及胚胎中均有普遍的微弱表达；erbB-3在除造血系统外的多数部位有表达；erbB-4在除肾小球及周围神经外的所有成年组织均可检测到其表达。
EGFR（epithelial growth factor receptor，表皮生长因子受体）本身具有酷氨酶激酶活性，一旦与表皮生长因子（EGF）组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。
胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌的EGFR表达增高。
EGFR可分为胞外区、跨膜区和胞内区3部分，其特点如下：胞外区由氨基端的621个氨基酸构成，是配体结合区，对EGFR具有高度亲和力，对热量很稳定。
跨膜区由23个氨基酸残基构成螺旋状结构的疏水区，将受体固定于胞膜上。
胞内区的542个氨基酸构成3个亚区：1.近膜亚区（约50个氨基酸）主要作为PKC和erk/MAPK(extracellular signal-regulated kinase/mitogen activated protein kinase)作用的负反馈区域；2.随后的约250个氨基酸构成酪氨酸激酶亚区，包含SH1和src 同源物1的结合位点；3.羧基端尾部的229个氨基酸构成羧基端亚区。
迄今发现，EGFR共有6种配体：表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、转化生长因子A(TGFA)、amphireguin、betacelluin(BTC)、heparin-binding EGF (HBEGF)和epiregulin(EPR)。
egfr20突变类型
egfr20突变类型摘要：1.EGFR20 突变类型概述2.EGFR20 突变的具体类型3.EGFR20 突变的临床意义4.EGFR20 突变的治疗策略正文：【EGFR20 突变类型概述】EGFR20 突变类型是指发生在表皮生长因子受体20 号外显子（Exon 20）的突变。
表皮生长因子受体（EGFR）是一种跨膜糖蛋白，对上皮细胞的生长、分化和存活具有重要作用。
EGFR 基因突变与多种上皮来源的肿瘤发生、发展及治疗耐药性密切相关。
在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，EGFR20 突变类型较为罕见，但具有重要的临床意义。
【EGFR20 突变的具体类型】EGFR20 突变类型主要包括以下几种：1.点突变：指单个碱基的改变，如G719X、S768I、T790M 等。
2.插入突变：指基因序列中插入一个或多个额外的碱基，如E20ins、V20ins 等。
3.缺失突变：指基因序列中丢失一个或多个碱基，如E20del、R20del 等。
4.倒位突变：指基因序列中一段碱基顺序颠倒，如L858R、G719S 等。
5.重复突变：指基因序列中重复出现一段碱基，如N767_768dup、N767_768ins 等。
【EGFR20 突变的临床意义】EGFR20 突变类型对患者的临床表现、疾病进程及治疗反应具有一定影响。
研究发现，EGFR20 突变类型与非小细胞肺癌患者的生存期、疾病进展、脑转移风险等方面密切相关。
部分EGFR20 突变类型对EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗具有较高的敏感性，如G719X、S768I 等，但也有部分突变类型对TKIs 治疗反应较差，如T790M、L858R 等。
【EGFR20 突变的治疗策略】针对EGFR20 突变类型的治疗策略主要包括以下几类：1.EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）：如吉非替尼、厄洛替尼、奥希替尼等，针对EGFR 敏感突变类型进行治疗。
2.化疗：对于EGFR20 突变类型对TKIs 治疗反应较差的患者，可以选择化疗方案，如铂类药物、紫杉醇等。
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成宁学院学报（医学版）２００８年第２２卷第１期［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉａｎｎｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）］ 重组人生长激素受体胞外段及其突变体￥２０１ Ｃ 王柏军 ，郭艳红 （１．成宁学院医学院生理学教研室，湖北成宁４３７１００；２．武汉大学医学院生理学系） 摘要：目的研究重组人生长激素受体胞外段（ｒｈＧＨＲＥｃ。）与人生长激素（ｈＧＨ）结合动力学。方法用定点 诱交ＰＣＲ法获得ｒｈＧＨＲＥｃＤ突变体￥２０１Ｃ碱基序列。将测序正确的质粒ｐＥＴ２０ｂ（＋）一ｈＧＨＲＥｃ ｒｈＧＨＲＥｃＤ （￥２０１Ｃ）转入ＢＬ２１（ＤＥ３）表达，纯化得到蛋白。采用放免分析法测定ｒｈＧＨＲＥｃ ｒｈＧＨＲＥｃＤ（￥２０１Ｃ）蛋白与 ｈＧＨ的结合解离常数（Ｋｄ）；采用ＢＩＡｃｏｒｅ检测ｒｈＧＨＲＥｃＤ（￥２０１Ｃ）与ｈＧＨ的结合动力学。结果放免测得ＫｄＷＴ
＝１．８７９ ｘ １０Ｉ１ Ｍ、Ｋｄ锄ｃ＝１．９３７ ｘ １０ Ｍ；ＢＩＡｃｏｒｅ测得结合速度（Ｋ．辄）＝３．２ ｘ １０ （Ｍ－。・ｓ ），解离速度 （Ｋ Ⅱ）＝３．９ ｘ１０ （ｓ ），Ｋｄ＝１．２２０ ｘ１０ Ｍ。结论ｒｈＧＨＲ ＥｃＩ）、ｒｈＧＨＲＥｃＤ（￥２０１Ｃ）与商品化的ｈＧＨ具有极 高的结合能力；ｒｈＧＨＲＥｃＤ、ｒｈＧＨＲＥｃＤ（￥２０１Ｃ）与ｈＧＨ结合，具有同样高的亲和力；ｒｈＧＨＲＥｃＤ（￥２０１Ｃ）可锚定于 ＢＩＡｃｏｒｅ芯片上，实时检测重组的ｈＧＨ Ｓｉｔｅｌ与受体结合的动力学变化。 关键词：人生长激素受体细胞外段；人生长激素；突变体；表达；纯化 中图分类号：Ｒ３３５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０６３５（２００８）０１－００１６－０４
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生长激素（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ，ＧＨ）发挥生理作 用的第一步是与暴露于靶细胞膜表面的生长激素 受体的细胞外段结合 通过一分子ｈＧＨ与两分 子ｈＧＨＲＥＣＤ结合，引起受体分子二聚及构型改 变，引发信号转导，调节多种基因活动实现其多种 功能…。人生长激素受体细胞外段（ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｔｒａ—ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ，ｈＧＨＲＥｃＤ）， 即人生长激素结合蛋白（ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈＧＨＢＰ），是从细胞膜上受体分子 经特异性蛋白酶剪切后释放的细胞外部分，存在 于血浆和组织中。一般认为ｈＧＨＢＰ主要功能是 与血中游离的ＧＨ动态结合，显著延长ＧＨ的半衰
维普资讯 http://www.cqvip.com 咸宁学院学报（医学版）２００８年第２２卷第１期［Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｘｉａｎｎｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）］ ｌ７ 期 Ｊ。重组分子技术得到的ｈＧＨＲ 。其特异性、 亲和力与体内天然的ＧＨＲ膜外段完全相同，因此 可以在体外实验中将其固定，从分子水平模拟受 体与ｈＧＨ结合的初始过程，分析其结合动力学变 化 ，也可用来检测即将商品化的重组ＧＨ及其 拟似剂的结合能力。
１材料与方法 １．１材料与设备 质粒ｐＥＴ２０ｂ（＋）一ｒｈＧＨＲＥＣＤ、大肠杆菌ＤＨ一 ５ 及ＢＬ一２１（ＤＥ３）由本室一８９℃甘油冻存；ｐｆｕ 酶购自Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｑ—ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ购自Ｐｈａ玎Ｉｌａ— ｃｉａ；层析系统购自上海沪西分析仪器厂；ＩＰＴＧ购 自上海生物工程有限公司；ＰＥＧ－６００购自武汉联 合化工；牛血清球蛋白（ｂｏｖｉｎｅ ｇａｍｍａ ｇｌｏｕｂｉｎｅ， ＢＢＧ）购自Ｓｉｇｍａ；人生长激素放免试剂盒购自北 京北方生物所。 １．２方法 １．２．１ ｈＧＨＲ ｃＤ Ｃ末端的定点突变 按照ＰＣＲ定点突变引物设计原则，根据突变 体模板的基因序列设计一对方向相反的引物Ｐｌ 和Ｐ２，引入同一个突变位点。即：分别将ｈＧＨＲ． ＥｃＤＣ末端的第２０１位编码丝氨酸的ＴＣＣ用编码半 胱氨酸的密码ＴＧＣ置换。引物分别是Ｐ ．￥２０１Ｃ： ５：Ｇ，Ｉ１、ＣＣＡＧＴＧＴＡＣＴＧＣ，Ｉ１、ＧＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡ一３ Ｐ２一 ￥２０ １ Ｃ： ５ ＂－ＡＴＣＣＡＣ唧ＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＣＴＧ— ＧＡＡＣＴＧ一３ 在ｐｆｕ ＤＮＡ聚合酶的作用下进行 ＰＣＲ，２５次循环后，取ＰＣＲ产物５ ｌ做１％琼脂 糖凝胶电泳鉴定。 １．２．２突变体的鉴定 ＰＣＲ产物经Ｄｐｎ Ｉ酶消化模板后，用无水乙 醇和乙酸钠抽提纯化送上海基康公司测序。 １．２．３ ｒｈＧＨＲＥｃＤ与ｒｈＧＨＲＥｃＤ（￥２０１Ｃ）的表达 将测序正确的ｐＥＴ２０ｂ（＋）一ｒｈＧＨＲＥｃＤ、 ｐＥＴ２０ｂ（＋）一ｒｈＧＨＲＥｃＤ（￥２０１Ｃ）质粒转入ＢＬ２１ （ＤＥ３），１．５ Ｌ的２ＹＴ培养基培养３～４小时（ ２００ｒｐｍ，３７℃），待ＯＤ６００达０．８时加ＩｌｒｒＧ至终浓 度ｌｍＭ，诱导３～４ｈ后离心收集菌体，加入ＰＭＳＦ （终浓度１ｍＭ），保存于一８９℃备用。分别采集诱 导前后样本做还原性ＳＤＳ—Ｐａｇｅ。 １．２．４ ｒｈＧＨＲＥｃＤ、ｒｈＧＨＲＥｃＤ（￥２０１Ｃ）蛋白的纯化 菌体饵冻后进行超声破碎，结晶紫染色鉴定 细菌破碎程度。４℃离心收集沉淀后立即加入 ２００ ｍｌ洗液Ｉ（２５ｍＭ ＮａＢＯ３、０．５Ｍ ＮａＣ１ ｐＨ ９．１） 溶解洗涤，离心后再用１００ｍｌ洗液ＩＩ（含１ ＭＵｒｅａ．１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ．１００ ｌＯ０１．ｄ的ＰＢＳ，ｐＨ７．６） 重悬沉淀。 上两步可得到较纯的包涵体，再在４００ｍｌ的 ４０ｍＭ ｓ．ｃｌ，４．５Ｍ Ｕｒｅａ，ｐＨ １０．３的碱性溶液 中变性３０—３６ ｈ后透析３６ｈ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｃｌ，ｐＨ ８．１０），１２ｈ换液１次。复性后的粗提液与填料 Ｑ．ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．充分结合，装载后用１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ｃｌ（ｐＨ ８．１０）平衡ｌｈ，用０—１Ｍ ＮａＣ１进行梯 度洗脱，流速为２ ｍｌ／ｍｉｎ，自动收集洗脱峰。ＳＤＳ— Ｐａｇｅ鉴定各收集管蛋白。 １．２．５ ｒｈＧＨＲＥＣＤ、ｒｈＧＨＲＥＣＤ（￥２０１Ｃ）蛋白与 ｈＧＨ活性的鉴定 放射免疫分析法测定不同浓度的ｒｈＧＨＲ— ＥＣＤ、ｒｈＧＨＲＥＣＤ（￥２０１Ｃ）蛋白与 Ｉ－ｈＧＨ反应的 平衡解离常数（Ｋｄ）。Ｂｉａｃｏｒｅ系统检测ｒｈＧＨＲ— ＥＣＤ（￥２０１Ｃ）与ｈＧＨ生物分子间相互作用。进一 步得到两者结合的动力学指标。 １．３统计学处理 各浓度管数据（ｃｐｍ）均以面４－ｓ处理。运用 软件Ｐｒｌｓｍ３．０分析。以浓度的对数值为横坐标 ［１ｇＣ（ｎｇ／ｍ１）］，各浓度管放射计数取均数与最大 结合计数比值为纵坐标（Ｂ／Ｂ０，１００％），绘制固 定量 Ｉ－ｒｈＧＨ和不同浓度的ｒｈＧＨＲＥＣＤ、ｒｈＧＨＲ— ＥＣＤ（￥２０１Ｃ）的结合曲线。
２０２７￣ 伯７５ｂｐ
图１ ＰＣＲ产物电泳图 １ｍａｒｋｅｒ；２阴性对照；３阳性对照；４预期产物
２结果 ２．１ ＰＣＲ结果 采用对热稳定、高保真的ｐｆｕ ＤＮＡ聚合酶，以 ｐＥＴ２０ｂ（＋）一ｈＧＨＲＥＣＤ为模板，Ｐｌ、Ｐ２引入定点 的突变，在合适的反应体系和条件下，在５１４８ｂｐ 和４２６９ｂｐ间出现特异性条带，同空白阳性对照位 置一致（图１）。产物抽提后测序并比对，发现 ｐＥＴ２０ｂ（＋）一ｈＧＨＲＥｃＤ碱基序列上仅第２０１位编 码丝氨酸的ＴＣＣ已经被半胱氨酸的密码字ＴＧＣ
静 ｐｐ ， ｂ ｂｂｂ ，ｒ ８９０ ４６＾ ＾ １０＿Ｉ． ，。 ５４＾Ｊ ２ 维普资讯 http://www.cqvip.com