DCFHDA活性氧检测方法
dcfhda荧光探针原理
dcfhda荧光探针原理DCFH-DA荧光探针原理一、DCFH-DA荧光探针简介DCFH-DA是一种常用的细胞活性氧（ROS）指示剂，是一种无色、无味、无毒的化学物质，可以在细胞内通过酯酶水解成为荧光染料DCFH。
DCFH能够被ROS氧化成为强荧光产物DCF，因此可以用来检测ROS的产生情况。
二、DCFH-DA荧光探针原理1. DCFH-DA的特点DCFH-DA具有以下特点：（1）易于渗透细胞膜：由于其结构中含有酯基，可以很容易地穿过细胞膜进入到细胞内部。
（2）不具有荧光：DCFH-DA在细胞内并不会自发发出荧光信号，而需要被ROS氧化后才会发出强烈的荧光信号。
（3）对活性氧敏感：DCFH-DA只有在存在ROS时才能够被氧化，因此可以作为活性氧指示剂来使用。
2. ROS的产生与检测ROS包括超氧阴离子（O2•−）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）等。
这些ROS可以通过多种途径产生，如细胞呼吸、光合作用、化学反应等。
在细胞内，ROS的过量产生会导致氧化应激反应，从而引起多种疾病的发生。
DCFH-DA可以检测ROS的产生情况。
当DCFH-DA进入到细胞内后，通过酯酶水解成为DCFH。
在存在ROS时，DCFH会被氧化成为强荧光产物DCF，从而发出荧光信号。
因此，DCFH-DA可以用来检测ROS的产生情况。
3. DCFH-DA的应用DCFH-DA可以广泛应用于多个领域中：（1）医学领域：DCFH-DA可以用来检测细胞内ROS的水平变化，从而判断氧化应激反应是否发生，并且可以用来研究ROS与多种疾病之间的关系。
（2）环境科学领域：DCFH-DA可以用来检测环境中污染物对细胞内ROS水平的影响。
（3）食品科学领域：DCFH-DA可以用来检测食品中抗氧化剂的含量，从而评估食品的质量。
三、DCFH-DA荧光探针的优缺点1. 优点（1）DCFH-DA无毒、无味、无色，不会对细胞产生影响。
（2）DCFH-DA可以很容易地穿过细胞膜进入到细胞内部。
组织ros含量检测方法
ROS 含量检测方法1. 荧光染料法•DCFH-DA:一种非荧光的醋酸酯，进入细胞后被酯酶水解为 DCFH，而后被活性氧氧化为高度荧光的 DCF。
•H2DCFDA:类似于 DCFH-DA，但具有更高的水溶性和更快的氧化速度。
•DHE:一种非荧光染料，与细胞内的超氧化物反应形成荧光产物 ethidium。
2. 化学发光法•Lucigenin:一种非荧光化合物，在与超氧化物反应后发出化学发光。
•L-012:一种化学发光探针，与活性氧反应发出荧光。
3. 电化学法•ROS 电极:一种选择性电极，可检测特定类型的活性氧，如超氧化物或过氧化氢。
4. 蛋白质氧化法•羰基化:检测蛋白质羰基含量，它是脂质过氧化和蛋白质氧化的标志。
•硝基化:检测蛋白质硝基含量，它是自由基攻击的标志。
5. 脂质氧化法•丙二醛 (MDA) 测定:检测 MDA 含量，它是脂质过氧化产物。
•脂质过氧化物检测:测量双键脂质产物，如 F2-异前列腺素。
6. DNA 氧化法•8-羟基脱氧鸟嘌呤 (8-OHdG) 测定:检测 DNA 氧化产物 8-OHdG 含量。
•单链 DNA 断裂测定:测量单链 DNA 断裂的频率。
7. 抗氧化剂水平测量•谷胱甘肽测定:检测谷胱甘肽含量，它是主要的抗氧化剂。
•维生素 E 测定:检测维生素 E 含量，它是脂溶性抗氧化剂。
选择方法时的考虑因素•ROS 类型:不同的方法对不同类型的 ROS 有选择性。
•样本类型:一些方法需要特定的样本类型，如细胞悬液或组织匀浆。
•检测灵敏度:一些方法比其他方法更灵敏。
•成本和复杂性:不同的方法具有不同的成本和复杂性。
DCFHDA活性氧检测方法
DCFHDA活性氧检测方法DCFH-DA（2',7'-二氯荧光二乙酸）是一种常用于检测细胞内活性氧的荧光探针。
DCFH-DA最初作为一种检测脂质过氧化和活性氧产生的荧光探针而被引入。
在细胞内，DCFH-DA可以被酯酶水解成DCFH（2',7'-二氯荧光二酚），而DCFH与活性氧反应生成Dichlorofluorescein（DCF）产生强烈的绿色荧光。
DCFH-DA检测法被广泛应用于反应氧化应激和自由基生成的过程。
DCFH-DA检测法实际上是一种间接测定活性氧的方法。
原理基于DCFH-DA能够通过酯酶水解成DCFH，而DCFH可以直接或通过活性氧来氧化生成DCF。
因此，DCF的荧光强度与细胞内的活性氧水平成正相关。
DCFH-DA检测法常用于检测细胞或组织中的过氧化氢（H2O2）、羟自由基（•OH）、超氧阴离子（O2•-）等活性氧物种。
DCFH-DA检测法的步骤如下：1.细胞准备：将需要检测活性氧的细胞培养在合适的培养基中，保证细胞的活力和完整性。
2.DCFH-DA处理：将培养的细胞离心，去除培养基，并用含有适当浓度的DCFH-DA的PBS缓冲液重新悬浮细胞。
DCFH-DA可在一定浓度下直接添加到细胞培养基中，也可在细胞中预处理一段时间。
3.洗涤：DCFH-DA可渗透细胞膜进入细胞内，在细胞酯酶的作用下，水解成DCFH。
洗涤细胞是必要的，以去除外源DCFH-DA和水解后生成的DCFH。
4.活性氧诱导：将细胞暴露在产生活性氧的刺激剂中，如过氧化氢、辐射、药物等。
较为常用的是使用刺激物H2O2，细胞可暴露在适当浓度的H2O2中一段时间。
5.荧光显微镜观察：在刺激剂作用一定时间后，将细胞离心，取得细胞沉淀。
用PBS洗涤，使得测量时背景荧光最小。
6.荧光检测：将洗涤好的细胞沉淀悬浮于含PBS的离心管中，通过流式细胞术或荧光显微镜测量活性氧生成后的荧光信号。
DCFH-DA检测方法的优势在于具有响应迅速、敏感度高、操作简单等特点。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测试验方案一：实验原理活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。
细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。
Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。
二：实验步骤⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/ 升。
⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照，3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。
⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml （加入的体积以能充分盖住细胞为宜）。
⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。
洗涤完后每孔加入1ml 细胞培养液。
⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强弱即OD值。
⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml),对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。
⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后荧光的强弱即OD值。
三：数据处理实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100%阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD 值)/刺激前OD值×100%四：注意事项⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
dcfh-da活性氧检测原理
dcfh-da活性氧检测原理活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是指一类具有高度活跃的氧原子或氧化剂，主要包括超氧阴离子（O2•-）、氢过氧化物（HO2•）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、羟基自由基（•OH）等物质。
在正常生理状态下，适量的活性氧能够参与细胞信号传导、炎症应答、免疫调节等重要生物学过程。
然而，当活性氧的生成和清除失衡时，会导致细胞内的氧化应激，引发细胞内氧化性损伤，从而诱发多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤等。
活性氧的检测技术主要分为直接检测法和间接检测法。
直接检测法主要通过对活性氧的特定物理或化学性质进行测定，如电子顺磁共振（EPR）、荧光探针和化学发光等。
间接检测法则是通过测定活性氧对其他物质的氧化反应来间接评价活性氧的水平，如酶活性测定法和抗氧化剂测定法等。
本文将主要介绍直接检测法中常用的电子顺磁共振法（EPR）和荧光探针法。
一、电子顺磁共振法（EPR）：电子顺磁共振法利用电子磁共振技术来直接检测自由基和活性氧。
其原理是利用带有未成对电子的物质（即自由基）对外加磁场的电子自旋产生磁共振现象。
在EPR仪器中，样品通过微波辐射，引发由磁共振演变而形成的微弱信号。
通过测量这些信号的幅度、形状和宽度等参数，可以判断活性氧的种类和数量。
EPR法的优点在于其高灵敏度和高特异性，可以实现对各种活性氧物质的定量分析。
然而，EPR仪器操作相对复杂，且仪器成本较高，因此在实际应用中受到一定的限制。
二、荧光探针法：荧光探针法是一种通过测定荧光探针与活性氧的反应生成的荧光信号来间接检测活性氧水平的方法。
荧光探针是一类能够与活性氧发生反应的化合物，一般可分为特异性探针和非特异性探针。
特异性探针是指能够选择性地与活性氧发生化学反应，生成具有荧光特性的产物。
例如，二氟苯基三氟甲烷（DCFH-DA）作为一种常用的特异性探针，它通过氧自由基致氧化反应生成2',7'-二羟基荧光素（DCF），DCF会发出绿色荧光，并与活性氧的浓度呈正相关。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一个广泛存在于植物、动物和微生物细胞中的有害物质，在细胞内氧化还原反应中扮演重要角色。
活性氧包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等，具有强氧化性。
活性氧在正常细胞代谢和维持细胞信号传导途径中发挥重要作用，但在细胞内过量生成会对细胞结构和功能造成损害，引发细胞衰老和死亡，促进炎症反应，以及导致一系列疾病的发生，包括心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。
活性氧检测是研究活性氧与细胞过程和疾病发生关系的重要手段。
常用的活性氧检测方法包括荧光探针染色法、电子自旋共振（electronspin resonance，ESR）法、流式细胞仪法、化学法等。
下面是一种基于荧光探针的活性氧检测实验方案，具体步骤如下：材料：1.细胞培养样本（如细胞系或原代细胞）2.活性氧检测荧光探针（如2',7'-二氯二羟苯基-4'-巯基吡啶，DCFH-DA）3.PBS（磷酸缓冲盐溶液）4.离心管5.无菌1.5mL离心管6.显微镜玻片7.荧光显微镜8.细胞培养基实验步骤：1.把细胞培养在合适的培养基中，保持在37°C的恒温培养箱中，条件合适时使其达到对照组的80%～90%接种度。
2.将细胞分装到离心管中，每支40mL细胞悬液。
3.加入DCFH-DA溶液，终浓度为10mM，使细胞充分吸收荧光探针。
将培养管放入37°C恒温培养箱中孵育30分钟以进行探针进入细胞。
4.将细胞洗涤剂去除，用PBS洗涤细胞3次以除去多余探针。
5.加入1mL的PBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中，以进行离心。
去除上清液，避免细胞牵涉。
6.加入1.5mLPBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中离心，去除上清液。
7.将取得的细胞悬液滴在显微镜玻片上，并加盖玻片。
在荧光显微镜下观察细胞活性氧的荧光信号强度。
DCFHDA活性氧的检测
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
产品简介： 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧
化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 贝博活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针 DCFH-DA 进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解 生成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存 在的条件下，DCFH 被氧化生成荧光物质 DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比， 检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
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咨询邮箱：bestbio@
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
检测： 对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光 光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光 度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。 使用 488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的参数设置检测 DCF。
ROS活性氧检测-DCFHDA法
ROS活性氧检测-DCFHDA法
BB-47053
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧⾃由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞⽣长增殖、发育分化、衰⽼和凋亡以及许多⽣理和病理过程。
贝博活性氧检测试剂盒是⼀种利⽤荧光探针DCFH-DA进⾏活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA本⾝没有荧光，可以⾃由穿过细胞膜，进⼊细胞内后，可以被细胞内的酯酶⽔解⽣成DCFH。
⽽DCFH不能通透细胞膜，从⽽使探针很容易被标记到细胞内。
在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化⽣成荧光物质DCF，绿⾊荧光强度与细胞内活性氧⽔平成正⽐，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的⽔平。
在激发波长502 nm，发射波长530 nm附近，使⽤荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测DCF 荧光，从⽽测定细胞内活性氧⽔平。
本试剂盒可以⽤于各种真核培养细胞的检测。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。
一种快速微量检测组织活性氧的方法[发明专利]
[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1737539A[43]公开日2006年2月22日[21]申请号200510060280.6[22]申请日2005.08.04[21]申请号200510060280.6[71]申请人浙江大学地址310031浙江省杭州市延安路353号浙江大学湖滨校区[72]发明人王晓峰 刘慧刚 连灵君 徐立红 [51]Int.CI.G01N 21/64 (2006.01)G01N 1/28 (2006.01)G01N 33/48 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 2 页[54]发明名称一种快速微量检测组织活性氧的方法[57]摘要一种快速微量检测组织活性氧的方法，在96孔板中加入190微升匀浆上清液、10微升1毫摩尔/升的DCFH－DA溶液，置于酶标仪中，37℃保温，30分钟后于激发波长为485纳米、发射波长538纳米检测荧光强度。
该方法反应直接在96孔板中进行，可同时测定多个样品，提高了检测效率，缩短了检测周期。
并采用微量加样法，所需样品及试剂消耗减少。
200510060280.6权 利 要 求 书第1/1页 1、一种快速微量检测组织活性氧的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行(以小鼠肝脏活性氧测定为例)：A、称取约0.05克组织，按1∶20(质量/体积)比例加入冰冷的100毫摩尔/升磷酸缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆。
B、1000g，4℃离心10分钟取上清。
C、在96孔板中加入190微升匀浆上清液、10微升1毫摩尔/升的DCFH-DA溶液(DCFH-DA终浓度为50微摩尔/升)，用移液器吹打，使之充分混匀。
D、置于酶标仪中，37℃保温，30分钟后于激发波长为485纳米、发射波长538纳米检测荧光强度。
E、另取50微升上清匀浆液，稀释30倍，取100微升进行蛋白定量。
F、结果以荧光强度/毫克蛋白表示。
2、根据权利要求1所述的快速微量检测组织活性氧的方法，其特征在于反应直接在96孔板中完成，一次可对45个样品同时测定。
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DCFHDA活性氧检测方法
DCFH-DA是2,7-二氯二氟荧光酮酰丙二酸对苯二酰肼的简称。
它是一
种常用的活性氧检测分子，可用于检测细胞内和细胞外生成的活性氧物种，如超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等。
下面介绍DCFH-DA活性氧检测的
原理、操作步骤和应用。
原理：
DCFH-DA分子是无色的，能够穿过细胞膜进入细胞内。
一旦进入细胞内，DCFH-DA会被内源酯酶迅速水解成无色的2',7'-二氯荧光酮酮基（DCFH），该分子对氧自由基不敏感。
当细胞内有活性氧物种存在时，这
些活性氧物种（如超氧阴离子、过氧化氢等）会氧化DCFH为高度荧光的
2',7'-二氯荧光酮基（DCF）。
DCF的荧光强度与活性氧物种的浓度成正比，因此可以通过测量DCF的荧光强度来间接测量活性氧物种的生成。
操作步骤：
1.将DCFH-DA溶解在适当的有机溶剂（如二甲基亚砜、乙酸乙酯等）
中制备为一定浓度的工作溶液。
2.将细胞或组织样品均匀洒在培养皿或载玻片上。
3.向细胞或组织样品中加入适量的DCFH-DA工作溶液，使其浓度达到
合适范围（通常在1-10μM之间）。
4.将细胞或组织样品置于37°C的孵化箱中培养一定时间，通常为
30分钟。
5.随后，用PBS或其他缓冲液洗涤样品，以去除细胞外的游离DCFH-DA。
6.在荧光显微镜下观察细胞的荧光图像，并使用适当的激发波长和发
射波长测量荧光强度。
应用：
DCFH-DA活性氧检测方法可以广泛应用于生物医学研究中，如研究细
胞氧化损伤、炎症反应、抗氧化剂活性等。
此外，DCFH-DA还可用于评估
药物的抗氧化性能、测量环境中的活性氧物种水平等。
这种方法具有快速、灵敏和简便的优点，广泛应用于细胞和分子生物学研究领域。
总之，DCFH-DA活性氧检测方法通过测量DCF的荧光强度来间接测量
细胞内和细胞外活性氧物种的生成水平。
它是一种简单而有效的方法，可
以广泛用于活性氧相关的研究和分析。