有关物质的HPLC方法建立

有关物质的HPLC方法建立

有关物质

有关物质:

特定物质中不是主要组成物，但与成份相关的物质。

有关物质的来源

原料药合成过程中带入;

制剂过程中产生;

或是在贮藏、运输、使用过程中产生。

有关物质的计算方法

杂质对照品法

@加响应因子（即重量校正因子）计算的自身对照法、

@不加响应因子计算的自身对照法

@根据不同杂质采用不同方法等。

有关物质的计算方法

定量检测和限度检测

溶解度考察

考察被测物在水、甲醇、乙腈、冰醋酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等几种常用溶剂中的溶解度，判断被测物极性强弱。

紫外光谱绘制

考察被测物在水、甲醇、乙腈等常用溶剂的紫外吸收情况，一般选取最大吸收波长作为流动相选择时的检测波长。几种被测物最大吸收波长不一致时，选取共同吸收较大的波长。

流动相的选择

中性成分

?被测物为中性成分时，一般选择甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水三种系统。乙腈-水系统由于粘度小，通常可以得到良好的柱效。此外，乙腈的紫外末端吸收比甲醇小，在低波长处检测基线波动小，测定误差小。

?被测物为极性较大的中性成分时，系统中甲醇或乙腈的比例可适当小些。被测物为极性较小的中性成分时，可适当增大甲醇或乙腈的比例。

碱性成分

?向流动相中加入胺类扫尾剂。常用三乙胺、二乙胺、乙二胺、正丁胺等。

?加入反离子，常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠及十二烷基磺酸钠。高碳数离子对试剂使保留时间过长，可更换低碳数的离子对试剂。流动相的pH一般为3-5。

酸性成分

?向流动相中加入少量弱酸，常用甲酸、醋酸。适用于分离3≤pKa≤7的弱酸。

?加入反离子，常用的离子对试剂为四丁基季胺盐及四丁基磷酸盐等。流动相的pH一般为7-7.5。

流动相的要求

被测物之间分离良好，分离度达到1.5以上。

主成分保留时间以10分钟为宜。分析时间通常为主成分保留时间的2-3倍。分析时间过长的可考虑采用剃度洗脱。

检测波长的确定

以选定的流动相为溶剂，考察被测物的紫外吸收情况。有DAD检测器的，考察主成分峰纯度，应达到98%以上。综合以上考察结果，将检测波长作修正。

涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重

量校正因子的问题。（f=A

杂质/A

被测成分

）

@选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。

@选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。

@如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。

@目前国外有关该项研究的进展

供试品溶液浓度的选择

?配制一系列不同浓度的溶液，在不过载的前提下确定浓度的增加不再引起杂质增加的拐点浓度。

?配制已知原料、中间体、杂质等的稀溶液，确定其检测限与定量限。通常以0.1%计，反推得供试品溶液的最低浓度。

?综合以上考察结果，以柱效最优作考量，确定供试品溶液的浓度。

杂质限度的确定

?药品注册的国际技术要求对于含量大于0.1%的杂质应确证结构。

?现在认为尽管定量结构活性关系程序可以用于推测单个杂质或给定杂质谱的毒性，但结果通常不认为对确认目的是决定性的。

方法学验证

?准确度

?对于有定量要求的杂质要通过回收率试验验证方法的准确度。例如某杂质的限度为0.2%，可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。

?线性

?适用与有定量要求的杂质检查。在定量限至一定

的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为

横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性

回归分析。可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值

的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。

?精密度

?适用与有定量要求的杂质检查。

?重复性配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。

?中间精密度配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。

?专属性

?空白对照应无干扰，主成分峰或需定量的杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。

?破坏试验

?氧化破坏取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90℃放置24小时。

?强碱破坏取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90℃放置24小时。

?强酸破坏取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90℃放置24小时。

?高温破坏取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变。

?强光破坏取原料适量，置紫外灯下照射48小时。