野生型PTEN诱导卵巢癌SKOV3细胞生物特性改变
野生型P53诱导的蛋白磷酸酶1对卵巢癌细胞侵袭的影响
红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用与机制研究
红景天苷对卵巢癌细胞 SKOV3生长的抑制作用与机制研究白生菊，莫荣纤，魏锁成 *西北民族大学生命科学院工程学院甘肃兰州 730000[摘要]：为了探究红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3的生长作用并阐明其作用机制。
本实验选取浓度为4、8、16、30和40 μmol/mL的红景天苷，依次为SAL-1、SAL-2、SAL-3、SAL-4和SAL-5组，设对照组（CG）不加药。
体外培养卵巢癌细胞SKOV3，CCK-8法检测SKOV3细胞增值的抑制率，qRT-PCR法检测SKOV3细胞PTEN mRNA的表达，Western-blot法检测各实验组PTEN蛋白的表达水平。
结果显示，随着红景天苷浓度增加和作用时间延长，SKOV3细胞的抑制率随之增高，红景天苷显著促进SKOV3细胞PTEN mRNA和蛋白的表达。
结果表明，红景天苷剂量依赖性地抑制卵巢癌细胞SKOV3的增值，显著促进SKOV3细胞PTEN mRNA 和蛋白的表达。
红景天苷可能是通过调节PTEN mRNA和蛋白的表达水平发挥其作用。
[关键词]：红景天苷；卵巢癌细胞；PTEN妇科肿瘤是导致女性死亡的重要原因。
子宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌是三大妇科常见癌症。
我国每年可确诊5万左右的卵巢癌患者，死亡数2万左右[1]。
上皮性卵巢癌在卵巢癌中死亡率最高，在美国其占所有病例的90%[2]。
卵巢癌的发生过程隐匿，70%患者确诊时已到晚期，其5年生存率达不到30%[3]，病死率在妇科恶性肿瘤中占第一位。
PTEN是一种同时具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌因子。
20%的透明细胞癌和15%左右的卵巢子宫内膜样腺癌中可发现PTEN基因的缺失[4、5]。
PTEN 与PI3K之间进行负反馈调节，PI3K的激活或PTEN缺失都可导致AKT的激活，促使肿瘤的发生发展，因此PTEN是通过参与PI3K/AKT信号通路发挥抑癌作用[6]。
红景天苷是从红景天等红景天属中提取的一种酚类活性物质。
《ATG7沉默影响卵巢癌SKOV3细胞顺铂化疗敏感性的研究》
《ATG7沉默影响卵巢癌SKOV3细胞顺铂化疗敏感性的研究》一、引言卵巢癌是一种常见的女性生殖系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率均较高。
目前，顺铂是卵巢癌治疗中常用的化疗药物之一。
然而，化疗抵抗性的出现往往导致治疗效果不佳，严重威胁着患者的生命安全。
因此，研究卵巢癌细胞对顺铂化疗敏感性的影响因素及其机制，对于提高卵巢癌的治疗效果具有重要意义。
近年来，自噬在肿瘤发生、发展和化疗抵抗中的作用逐渐受到关注。
其中，ATG7作为自噬过程中的关键基因，在卵巢癌中的表达及其与顺铂化疗敏感性的关系尚不清楚。
本研究旨在探讨ATG7沉默对卵巢癌SKOV3细胞顺铂化疗敏感性的影响及其机制，为卵巢癌的治疗提供新的思路。
二、材料与方法1. 实验材料（1）细胞株：人卵巢癌SKOV3细胞。
（2）试剂与仪器：顺铂、ATG7 siRNA、相关抗体、细胞培养基、PCR仪、电泳仪等。
2. 方法（1）细胞培养与处理：培养SKOV3细胞，并分别进行ATG7 siRNA转染和顺铂处理。
（2）检测指标：通过MTT法检测细胞增殖情况；通过流式细胞术检测细胞凋亡情况；通过Western blot检测相关蛋白表达情况。
（3）数据分析：采用SPSS软件进行数据分析，计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。
三、实验结果1. ATG7沉默对SKOV3细胞增殖的影响结果显示，ATG7沉默后，SKOV3细胞的增殖能力明显降低，说明ATG7在SKOV3细胞的增殖过程中发挥重要作用。
2. ATG7沉默对SKOV3细胞顺铂化疗敏感性的影响与未转染ATG7 siRNA的SKOV3细胞相比，转染ATG7 siRNA的SKOV3细胞在顺铂处理后的细胞凋亡率明显增加，同时，细胞的IC50值（半数抑制浓度）降低，表明ATG7沉默能够提高SKOV3细胞对顺铂的化疗敏感性。
3. ATG7沉默对自噬相关蛋白表达的影响Western blot结果显示，ATG7沉默后，自噬相关蛋白的表达降低，表明ATG7沉默可能通过抑制自噬过程来影响细胞的化疗敏感性。
卵巢癌SKOV3细胞中侧群细胞的生物学特性
卵巢癌SKOV3细胞中侧群细胞的生物学特性钟艳平;孟泳圳;李力;尹富強;黎丹戎;张玮【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】2014(0)12【摘要】目的分选人卵巢癌细胞系SKOV3中的侧群(side population,SP)细胞,并探讨其是否具有肿瘤干细胞的生物学特性。
方法流式细胞仪检测、分选经DNA染料Hoechst 33342染色后SKOV3中的SP细胞,并对侧群细胞(SP)与非侧群细胞(non-SP)作细胞生物学鉴定,包括增殖能力、克隆形成能力、侵袭及迁移能力、自我更新能力及细胞周期。
结果 SKOV3细胞系中SP细胞比例为(1.12±0.104)%,SP 细胞增殖速度快于non-SP细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。
接种相同数量的细胞,SP细胞克隆形成率高于non-SP细胞(P<0.05)。
Transwell实验显示,SP细胞侵袭与迁移的细胞数与non-SP相比均明显增多(P<0.05)。
SP细胞体外能分化为Non-SP细胞,具有自我更新能力。
SP细胞大多处于细胞周期的G0/G1期。
结论卵巢癌细胞系SKOV3中的SP细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性,SP细胞表型可考虑作为富集卵巢癌干细胞样细胞的有效方法。
【总页数】4页(P1282-1285)【关键词】卵巢癌;SP细胞;癌干细胞;生物学特性【作者】钟艳平;孟泳圳;李力;尹富強;黎丹戎;张玮【作者单位】广西医科大学医学科学实验中心;广西医科大学肿瘤医院妇瘤科【正文语种】中文【中图分类】R737.31【相关文献】1.肝癌SMMC-7721细胞中侧群细胞分选及其生物学特性的研究 [J], 黄涛;周奇;宫东伟;高全立;张旭华;吕晓东;周进学2.hB7-1基因转染对人卵巢癌SKOV3细胞生物学特性及MHC Ib与HLA-DR抗原表达的影响 [J], 张辉;左连富;杨月敏;焦昆;刘江惠;单保恩3.沉默mGluR5对卵巢癌SKOV3细胞生物学特性的影响及其机制研究 [J], 楚广民;张建波;孙淼淼4.XIAP基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞生物学特性的影响 [J], 杨婷;杨淑梅5.人上皮性卵巢癌细胞系侧群细胞的肿瘤干细胞样细胞生物学特性及膜蛋白差异表达的鉴定 [J], 尹婕;潘凌亚;温仪萍;黄虹;曾靖;李晓莹;韩甜甜;金滢;李艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
乙酰紫草素诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的实验研究
基金项目：吉林省科技发展计划项目（２０１８０１０１１５５ＪＣ）；吉林省卫生计生科研计划项目（２０１５Ｚ０３３）＊通讯作者文章编号：１００７－４２８７（２０１９）０９－１６３２－０２乙酰紫草素诱导卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞凋亡的实验研究何茂旭１，韩丽丽２，王 佩１，付 莉１＊，裴 越１，刘盈盈１，孙森森１（１．吉林大学第二医院妇产科，吉林长春１３００４１；２．青岛市中心医院妇产科，山东青岛２６６０４２） 卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其病死率居妇科恶性肿瘤首位，患者５年生存率低于３０％［１］。
目前卵巢癌的治疗主要以手术为主、放化疗为辅综合治疗，但对于手术不能完全切除晚期患者，化疗成为卵巢癌综合治疗的重要组成部分。
然而化疗药耐药性已成为卵巢癌治疗的重要问题之一［２］。
乙酰紫草素是一种天然的红色色素，存在于我国传统常见中药—紫草的根中，具有抗炎和抗肿瘤活性［３］。
乙酰紫草素对多种肿瘤细胞如结肠癌、胰腺癌及乳腺癌等具有一定的抑制作用［４－６］。
本实验主要探讨乙酰紫草素是否能诱导卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞凋亡。
１ 材料与方法１．１ 仪器与试剂仪器：Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ型酶标仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司），ＢＤ ＦＡＣＳＶｉａ型流式细胞仪（美国ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉ－ｅｎｃｅｓ公司），Ｔｉ－Ｅ型荧光显微镜（日本Ｎｉｋｏｎ公司）。
试剂：乙酰紫草素（纯度９８％，上海纯优生物），青霉素，链霉素，胰蛋白酶，ＭＴＴ，１６４０培养液（Ｈｙ－ｃｌｏｎｅ，ＵＳ），胎牛血清（天津灏洋生物），Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＦＩＴＣ及ＰＩ双染试剂盒（Ｓｉｇｍａ，ＵＳ）。
细胞：卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞株（中国科学院上海细胞生物研究所）。
１．２ 方法１．２．１ ＭＴＴ法检测ＳＫＯＶ３细胞的抑制率 将对数生长的卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞悬液，以５×１０５个／ｍＬ密度接种在９６孔板，每孔１００μｌ，每组设５个复孔。
标准条件下培养过夜，于４８小时加入含新的乙酰紫草素的培养液，乙酰紫草素每孔终浓度分别为１，５，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０μｍｏｌ／Ｌ，对照组不加乙酰紫草素（只含等量培养基），各组细胞均培养４８小时后加入１０μｌ ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）处理，加入１００μｌ ＤＭＳＯ，避光振荡１０ｍｉｎ，并通过酶标仪在４９０ｎｍ波长下检测每个孔的吸光度值（Ａ），每组浓度重复检测３遍，计算平均值，然后计算乙酰紫草素对ＳＫＯＶ３细胞的抑制率。
《Cpd5对人卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制和凋亡诱导作用及其作用机制的研究》
《Cpd5对人卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制和凋亡诱导作用及其作用机制的研究》一、引言卵巢癌是一种常见的女性生殖系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率均较高。
目前，对于卵巢癌的治疗主要依赖于手术和化疗，但治疗效果并不理想，且易出现复发和转移。
因此，研究卵巢癌的发生、发展和治疗机制，寻找新的治疗方法和药物，对于提高卵巢癌患者的生存率和生存质量具有重要意义。
近年来，Cpd5作为一种新型的抗肿瘤药物，其在人卵巢癌SKOV3细胞中的增殖抑制和凋亡诱导作用逐渐受到关注。
本文旨在研究Cpd5对人卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制和凋亡诱导作用及其作用机制，以期为卵巢癌的治疗提供新的思路和方法。
二、材料与方法1. 材料Cpd5药物、人卵巢癌SKOV3细胞株、DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT试剂、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒等。
2. 方法（1）细胞培养：将SKOV3细胞株在DMEM培养基中培养，加入10%胎牛血清和1%双抗，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
（2）药物处理：将Cpd5药物以不同浓度处理SKOV3细胞，分别在24h、48h和72h时进行细胞活性检测。
（3）细胞活性检测：采用MTT法检测细胞活性。
（4）细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。
（5）流式细胞术：检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达情况。
（6）Western blot：检测相关蛋白的表达水平。
三、结果1. Cpd5对SKOV3细胞增殖的抑制作用Cpd5处理SKOV3细胞后，细胞的活性随着药物浓度的增加和时间的延长而逐渐降低，表明Cpd5对SKOV3细胞的增殖具有明显的抑制作用。
2. Cpd5对SKOV3细胞凋亡的诱导作用通过Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测发现，Cpd5处理SKOV3细胞后，细胞凋亡率明显增加，且随着药物浓度的增加和时间的延长，凋亡率逐渐升高。
《莪术油注射液对人卵巢癌细胞株SKOV3的实验研究》
《莪术油注射液对人卵巢癌细胞株SKOV3的实验研究》一、引言卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其治疗手段及预后一直备受关注。
近年来，中药及中药有效成分在抗肿瘤领域的研究日益受到重视。
莪术油作为中药莪术的有效成分之一，具有广谱的抗肿瘤作用。
本研究以人卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象，通过实验探究莪术油注射液对SKOV3细胞的抑制作用及其可能的机制。
二、材料与方法1. 材料本实验所需的人卵巢癌细胞株SKOV3购自ATCC（美国标准生物品收藏中心），莪术油注射液购自正规药店。
实验所需试剂及仪器均符合实验要求。
2. 方法（1）细胞培养：将SKOV3细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的条件下培养。
（2）实验分组：将细胞分为对照组、莪术油低剂量组、莪术油中剂量组和高剂量组。
（3）药物处理：各组细胞分别加入相应浓度的莪术油注射液，继续培养48小时。
（4）检测指标：采用MTT法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blot检测相关蛋白表达情况。
三、实验结果1. 细胞增殖情况实验结果显示，莪术油注射液对SKOV3细胞的增殖具有明显的抑制作用。
随着药物浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高。
与对照组相比，各剂量组细胞增殖均受到显著抑制（P<0.05）。
2. 细胞凋亡情况流式细胞术检测结果显示，莪术油注射液能够诱导SKOV3细胞发生凋亡。
随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高。
与对照组相比，各剂量组细胞凋亡率均显著增加（P<0.05）。
3. 相关蛋白表达情况Western blot检测结果显示，莪术油注射液能够下调SKOV3细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时上调促凋亡蛋白Bax的表达。
这表明莪术油注射液可能通过调节Bcl-2/Bax的比例来诱导细胞凋亡。
四、讨论本研究结果表明，莪术油注射液对人卵巢癌细胞株SKOV3具有明显的抑制作用，能够抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。
环磷酰胺及其代谢产物作用于卵巢癌细胞SKOV3后对PTEN基因的影响
环磷酰胺及其代谢产物作用于卵巢癌细胞SKOV3后对PTEN基因的影响熊正方;李冰;曾湘晖;王莉云【摘要】目的探讨环磷酰胺(CP)及其代谢产物丙烯醛(ACR)作用卵巢癌细胞SKOV3后对人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的影响.方法选择不同浓度CP及其代谢产物ACR作用重组PTEN蛋白,采用硝基苯磷酸二钠(PNPP)检测PTEN的磷酸化活性,Western blot技术检测蛋白表达,通过生物素与蛋白结合检测药物与蛋白的结合方式;同时分析PTEN基因通路P53/TP53的表达改变;不同药物浓度作用细胞后通过免疫沉淀(IP)方法得到目的蛋白,通过离效液相色谱(HPLC)检测其蛋白磷酸化活性.结果药物代谢产物作用重组PTEN蛋白后其磷酸化活性随着药物浓度的增高而降低,ACR抗体作用表达随着药物浓度增高表达增多,不同实验组蛋白与生物素表达随药物浓度增高而增多,在细胞中随着药物浓度增高PTEN磷酸化活性降低,TP53蛋白表达随着药物浓度增加而减少.结论 CP代谢产物ACR可通过抑制PTEN蛋白磷酸化活性引起细胞毒性.%Objective To study the effect of cyclophosphamide(CP) and its metabolites acrolein(ACR) on PTEN gene deleted on chromosome 10 after acting on ovarian cancer cellsSKOV3.Methods Different concentrations of CP and ACR were selected to act on recombinant PTEN protein.The phosphorylation activity of PTEN was detected by PNPP.The expression of PTEN protein was detected by Western blot.The binding mode of drug with protein was detected by the biotin combined with protein;meanwhile the expression change ofP53/TP53 in PTEN gene pathway was analyzed.The target protein was obtained by immunoprecipitation(IP) after different drug concentrationsacting on the cells.The phosphorylation activity of the target protein was detected by high performance liquid chromatography(HPLC).Results After the drug metabolites acting on recombinant PTEN protein,the phosphorylation activity was decreased with the increase of drug concentration,while the expression of ACR antibody action was increased with the drug concentration elevation.The expression of protein and biotin in different experimental groups was increased with the increase of drug concentration.The PTEN phosphorylation activity was decreased with the drug concentration increased in cells,and so did the expression of TP53 protein.Conclusion CP metabolite ACR induces the cytotoxicity by inhibiting PTEN protein phosphorylation activity.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2018(047)004【总页数】3页(P453-455)【关键词】第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因;环磷酰胺;丙烯醛;磷酸化;活性【作者】熊正方;李冰;曾湘晖;王莉云【作者单位】青海省人民医院生殖中心,西宁810007;青海省人民医院生殖中心,西宁810007;青海省人民医院生殖中心,西宁810007;青海省人民医院生殖中心,西宁810007【正文语种】中文【中图分类】R711.6卵巢癌是女性生殖器恶性肿瘤之一，具有高度致死性。
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【摘要】【目的】探索野生型PTEN基因对卵巢癌细胞生物学特性的影响。
【方法】将野生型PTEN基因克隆到pAdxsi腺病毒载体并感染SKOV3细胞。
荧光镜下检测腺病毒载体对SKOV3细胞的感染效率;用CCK-8法检测细胞增殖的抑制效率;RT-PCR与WB分别检测PTEN mRNA与蛋白表达水平变化;免疫化学法与间接荧光法检测PTEN在细胞内的定位及细胞内NEDD4-1和RAD51等分子表达。
【结果】稳定转染PTEN后，24 h内PTEN 分布于细胞质与核内，而72 h后则主要集中于细胞核内;显著增加细胞质内NEDD4-1和细核RAD51等分子表达。
【结论】野生型PTEN可影响SKOV3细胞增殖，并诱导细胞表达RAD51与NEDD4-1分子，有利于细胞DNA修复与细胞增殖抑制。
【关键词】转染; NEDD4-1; PTEN基因Abstract：【Objective】To explore the effect of wild-type PTEN gene on biological characteristics of ovarian cancer cells. 【Methods】The wild-type PTEN gene was cloned into pAdxsi adenovirus vector and infected into SKOV3 cells，the infected efficiency of adenovirus on SKOV3 cells was detected by fluorescence microscopy; the inhibition efficiency on cell proliferation was assayed by CCK-8; RT-PCR and WB was used to detect the level of PTEN mRNA and protein expression changes respectively; the location of PTEN NEDD4-1，RAD51 and other molecules in cell were showed by immunochemical and indirect fluorescence. 【Results】The PTEN could be observed in the cytoplasm and nucleus after 24 h of stable transfection，while after 72 h they could be presented mainly in nucleus; the transfection of PTEN could increase the expression of NEDD4-1，nuclear RAD51 molecules significantly in the cytoplasm. 【Conclusion】The wild-type PTEN can effect the proliferation of SKOV3 cells and induce expression of RAD51 and NEDD4-1 molecules，thus would contribute to cellular DNA repair and cell proliferation inhibition.抑癌基因PTEN (phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten)编码的蛋白具有蛋白酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶双重特异性磷酸酶活性及脂质磷酸酶活性，它参与多条细胞内信号通路的转导，调控细胞周期，对细胞的增殖与转化等多种生物学行为有重要作用[1-2]。
现已证实该基因不同位点的突变、失活和表达减少与多种肿瘤的发生、发展密切相关，成为继p53后又一个与多种肿瘤发生发展密切相关的抑癌基因。
近期研究显示妇科肿瘤与PTEN基因异常关系密切，其突变和缺失多发于乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等[2]。
本研究将野生型PTEN基因通过腺病毒载体导入SKOV3卵巢癌细胞系中，探讨其核内外的表达对卵巢癌细胞生物学功能的影响，为卵巢癌的基因治疗进行初步的探索并提供有意义的参考数据。
1 材料和方法1.1 材料与试剂CCK-8为日本同仁化学研究所产品;胎牛血清购于杭州四季青生物公司;脂质体LipofectamsneTM2000为GIBCO公司产品。
质粒pEGFP-N1-PTEN与人卵巢癌细胞株SKOV3由本室保存;pAdxsi腺病毒载体系统、改建的人胚肾细胞293T均为北京诺赛基因公司提供;PTEN和GAPDH引物由北京赛百盛公司合成;兔抗人NEDD4-1(neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated 4 isoform 1)、鼠抗人PTEN抗体为美国Santa Cruz公司产品;HRP标记羊抗鼠IgG、HRP标记羊抗兔IgG抗体均购自北京生物技术有限公司;鼠抗人RAD51(DNA repair protein RAD51)购于上海锐聪科技发展有限公司。
1.2 pAdxsi-GFP-CMV-PTEN腺病毒载体的构建首先构建pShuttle-GFP-CMV-PTEN重组穿梭质粒：EcoRⅠ/SacⅡ酶切pShuttle-GFP-CMV重组穿梭载体，CIP去磷酸化处理，回收5.1 ku载体片段，同时EcoRⅠ/SacⅡ酶切pEGFP-N1-PTEN回收目的片段;酶连切好的PTEN与pShuttle-CMV-GFP片段(PTEN前后的酶切位点分别是EcoRⅠ与SalⅠ、KpnⅠ和SacⅡ)，得到pShuttle-GFP-CMV-PTEN;转化并扩增，抽提质粒pShuttle-GFP-CMV-PTEN。
再构建重组腺病毒载体质粒：Ⅰ-CeuⅠ+Ⅰ-SceⅠ双酶切处理pAdxsi骨架质粒与pShuttle-GFP-CMV-PTEN 质粒，切好的两目的片段酶连，产物转化并扩增带pAdxsi-GFP-CMV-PTEN病毒质粒的DH5a;提取pAdxsi-GFP-CMV-PTEN质粒。
产物分别进行酶切鉴定与测序。
1.3 重组腺病毒包装、扩增和滴度测定293细胞用含100 mL/L FBS的DMEM培养。
待细胞长满约80%时，PacⅠ酶切线性化pAdxsi-CMV-PTEN，转染293细胞，3 ～5 d后，细胞开始出现细胞病变，待大部分细胞病变并脱落时收获，收集细胞及上清液，反复冻融3次，离心收集上清，用上清继续感染293细胞大量扩增病毒，获取大量病毒液于-80 ℃冻存备用;同时测定病毒滴度。
1.4 细胞培养与腺病毒转染及其表达SKOV3细胞置于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中常规培养，隔天传代。
Adxsi-GFP-CMV-PTEN病毒以100 PFU/cell 量加入培养瓶中，作为腺病毒载体实验组(SKOV3/PTEN)，继续培养;同时设立无腺病毒载体感染对照组(SKOV3/CON)与空病毒pAdxsi-CMV-GFP感染的对照组(SKOV3/GFP)，分别于不同阶段收集细胞，提取各组细胞总RNA，行RT-PCR检测目的基因表达情况。
引物序列如下：PTEN上游5′-ACCGCC AAA TTTAA TTGCAG-3′，下游5′-GGGTCCTGAATT GGAGGAAT-3′，扩增片段长度为469 bp;内参照GAPDH上：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′，下：5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′，扩增片段长度为400 bp。
PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃×40 s，55 ℃×60 s，72 ℃×60 s，28个循环;72 ℃×10 min。
取10 μL PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳并与Marker比较判断PCR产物片段大小。
1.5PTEN转染对SKOV3细胞生长的影响SKOV3细胞进行PTEN转染后24 h胰酶消化，调整细胞为5 ×104/mL，以0.2 mL/孔移入96孔板，8孔/板，按同样方法处理SKOV3/GFP和SKOV3/CON等组细胞。
从第2天开始，每天同一时间取一块板，于实验各孔分别加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃继续孵育1 h，测定吸光度值D(450 nm)，根据CCK-8测定结果分析PTEN对SKOV3生长影响。
1.6Western Blot检测分别收集不同时间SKOV3/PTEN组细胞，裂解细胞并抽提细胞质与细胞核蛋白上清液，跑SDS-PAGE胶，恒压120 V，电泳2 h后用湿转移法，电转印到0.22 μm孔径的PVDF 膜上，在为5%脱脂牛奶TBST的封闭液中，室温1 h，TBST漂洗2次;分别加鼠抗人PTEN、兔抗人NEDD4-1与鼠抗人RAD51一抗，4 ℃振荡过夜。
TBST液漂洗数次，每次15 min，加入HRP标记的二抗，室温振荡1 h后漂洗3次，ECL显色。
1.7 免疫细胞化学与间接荧光检测各组细胞爬片，进行相应的实验后固定细胞，并行TritonX-100透化，分别加入相应的一抗(兔抗人NEDD4-1、鼠抗人PTEN与RAD51) 4 ℃孵育过夜后，再用HRP标记的二抗孵育，DAB显色;或与CY3-羊抗兔IgG、CY5羊抗鼠IgG等二抗孵育后镜检，以检测细胞中PTEN、RAD51与NEDD4-1等相关分子表达与分布情况。
1.8 统计学处理实验数据以3次相同实验结果的均数±标准差(x ±s)表示，用SPSS 10.0进行统计，采用单因素方差分析(one-Way ANOV A)。
2 结果2.1pShuttle-GFP-CMV-PTEN与pAdxsi-GFP-CMV-PTEN的鉴定pShuttle-GFP-CMV-PTEN EcoR Ⅰ/SacⅡ酶切，阳性克隆将得到5.1 ku和1.3 ku两条带(图1A);而阴性克隆只有5.1 ku一条带。
XhoⅠ酶切pAdxsi-GFP-CMV-PTEN，因重组腺病毒载体骨架序列上自带6个XhoⅠ酶切位点，PTEN片段从穿梭质粒上带来1个XhoⅠ酶切位点，因此XhoⅠ酶切阳性克隆后应14、11.8、3.5、2.93、2.47、1.45和0.6 ku等7条带(图1B);而阴性克隆只有14、11.8、4.0、2.47、1.45和0.6 ku等6条带(图1C)。