TRAIL联合顺铂诱导卵巢癌耐药细胞株COC1／DDP凋亡机制的研究

TRAIL联合顺铂诱导卵巢癌耐药细胞株COC1／DDP凋亡机制的研究目的：研究TRAIL联合顺铂对卵巢癌耐药细胞COC1/DDP生长的影响，以及联合用药对TRAIL死亡受体（DR4、DR5）、凋亡相关基因Smac、Survivin 表达的影响，揭示TRAIL联合顺铂可能逆转COC1/DDP细胞耐药性的机制。

方法：采用MTT法检测不同浓度TRAIL蛋白与DDP联合用药对COC1/DDP细胞生长的影响，用Annexin V-FITC法检测COC1/DDP细胞凋亡，用RT-PCR方法检测DDP对TRAIL受体（DR4、DR5）、凋亡相关基因Smac、Survivin表达。

结果：TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞生长有抑制作用，DDP与TRAIL蛋白联合作用后细胞生长抑制率显著升高（P＜0.05）。

DDP使COC1/DDP细胞的DR5表达水平显著增强，为正常对照组的3.45倍（P＜0.001）；Smac表达为对照组的2.82倍（P＜0.001）；DR4水平无明显变化；Survivin表达较对照组显著减少（P ＜0.001）。

结论：TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞生长有抑制作用，DDP与TRAIL 联合增强了对COC1/DDP细胞生长抑制；TRAIL逆转COC1/DDP细胞对DDP 的耐药性可能与DDP导致TRAIL受体DR5水平升高、Smac表达增加，通过线粒体途径促进了肿瘤细胞的凋亡有关。

卵巢癌病死率居女性生殖道恶性肿瘤之首，约有70%患者发现时已是晚期，而其中绝大多数在手术后的化疗过程中又极易产生耐药，导致卵巢癌5年生存率仅为30%[1]。

寻找逆转卵巢癌耐药化疗敏感性的药物并研究其机制，是现阶段卵巢癌治疗临床和基础研究的热点。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是新发现的TNF超家族成员，与其受体结合后可特异性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞几乎无毒性，现已受到人们的广泛关注[2-5]。

TRAIL与靶细胞表面的死亡受体DR4/DR5特异结合形成DR4/DR5-FADD-procaspase-8死亡诱导信号复合物（DISC），促使procaspase-8自我裂解形成有活性的凋亡起始蛋白caspase-8，进而活化效应蛋白，最终导致细胞凋亡[6-7]。

本研究检测TRAIL对COC1/DDP细胞TRAIL死亡受体（DR4、DR5）、凋亡相关基因Smac、Survivin表达的影响，旨在探讨TRAIL联合顺铂可能逆转COC1/DDP细胞耐药性的机制，现报道如下。

1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 细胞株COC1/DDP 细胞由福建医科大学肿瘤实验室提供。

1.1.2 主要试剂重组TRAIL蛋白为Pepro Tech公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）系美国Sigma公司产品。

DD为山东齐鲁制药厂产品。

酶联分析仪为美国VICTOR1420型多标记计数仪；逆转录试剂盒、Taq酶、DNAmarker总RNA 提取试剂（Trizol）购自Invitrogin公司。

引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法1.2.1 细胞培养COC1/DDP细胞采用含10%胎牛血清、1%双抗（青链霉素混合液）的RMPI-1640培养液，置于37 ℃、5%CO2及20%O2的培养箱中进行培养。

1.2.2 TRAIL蛋白和顺铂对细胞生长抑制检测（1）检测不同浓度TRAIL对COC1/DDP细胞生长的影响：分别取对数生长期的COC1/DDP细胞以每孔1×104个/mL接种于96孔板24 h贴壁后，更新培养液并加入TRAIL蛋白液使终浓度为5、10、20、50、100、150 μg/L，每个浓度5个复孔，另设对照组（同体积的PBS）、空白组（加培养液，不含细胞及药物）；加药后分别继续在培养箱中作用12、24、36、48、60 h后取板备测。

采用MTT法测定细胞的吸光度A490值，计算细胞生长抑制率。

（2）求得IC50及最佳作用时间。

（3）检测DDP与接近IC50的三个浓度TRAIL蛋白联合作用对COC1/DDP细胞生长的影响：分别取对数生长期COC1/DDP细胞接种于96孔培养板中，培养24 h后加入含有2 μg/mL DDP和接近IC50的三个浓度TRAIL蛋白的培养液，每一处理组设5个复孔，另设对照组、空白调零组，培养24 h后取板备测。

测定每孔细胞的A490值，计算细胞生长抑制率。

1.2.3 采用Annexin V-FITC方法检测COC1/DDP细胞凋亡COC1/DDP细胞接种于6孔板培养24 h贴壁后加DDP及TRAIL蛋白，分对照组（PBS代替TRAIL蛋白、DDP）﹑DDP 2 μg/mL组、DDP 2 μg/mL+TRAIL 40 μg/L组﹑DDP 2 μg/mL+TRAIL 60 μg/L组、DDP 2 μg/mL+TRAIL 80 μg/L组，各组均设5个复孔，药物作用24h后按试剂盒流程加入Annexin V-FITC及碘化丙锭溶液（PI），流式细胞仪上分析。

判断标准：横坐标是PI，纵坐标是Annixin V-FITC，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，左上象限即FITC（+）/PI（-）是凋亡的细胞。

1.2.4 RT-PCR方法检测COC1/DDP细胞DR4、DR5、Smac及Survivin表达对数生长的COC1/DDP细胞分对照组（PBS代替）、DDP 0.5μg/mL组、DDP 1μg/mL组及DDP 2μg/mL组，分别培养24 h后，按试剂盒流程提取总mRNA、cDNA合成及PCR反应。

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

引物序列：DR4（上游：5’-ACG AAC GCT CTG GGA CCT GTA AC-3’、下游：5’-ATG TCC TAT GCC TAG TTC TTG TTG-3’）、DR5（上游：5’-TGA GCG GGA AGA GGA CAT GA-3’、下游：5’-GGC TAT TGC CAT TGT GAT TTG A-3’）、Smac（上游：5’-ACC GCC CAC TAC TCT TCC TC-3’下游：5’-GCG ATG CAT TAG GAG CCG TG-3’）及Survivin（上游：5’-ATG CTG ATC GGA AGA CGC AA-3’下游：5’-GCG GAT CTG TTT TCT CTG AT-3’），条带的大小分别为DR4 480 bp、DR5 445 bp、Smac 360 bp及Survivin 390 bp。

1.3 统计学处理采用SPSS 10.0统计软件包，各组资料的比较行方差齐性检验，方差齐者用多组计量资料的方差分析进行比较，两组资料比较用成组设计的t检验进行分析。

P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 不同浓度TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞生长的影响由图1可见，TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞的杀伤抑制作用随药物浓度的增加而增强；在同一药物浓度干预下，杀伤抑制作用随干预时间的延长而渐增；呈剂量-时间双效应关系。

2.2 DDP与不同浓度的TRAIL蛋白联合作用对COC1/DDP细胞生长的影响选用接近IC50的三个浓度作为实验浓度：40、60、80 μg/L，以24 h为干预时间。

单独DDP（2 μg/mL）作用COC1/DDP细胞24 h，抑制率为3.58%，见表1。

提示COC1/DDP细胞对顺铂呈耐药状态，联合用药的抑制率明显高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和，提示TRAIL蛋白与DDP联合用药对COC1/DDP 细胞可能有协同抑制增殖作用。

2.3 流式细胞仪Annexin V-FITC法检测细胞凋亡结果如图2～6所示，随着与DDP联合的TRAIL浓度增加，COC1/DDP细胞凋亡率也逐渐上升，联合用药干预后凋亡率分别为（7.5±1.2）、（16.5±1.6）及（25.6±2.1）%，与单纯TRAIL 蛋白作用比较，凋亡率均明显增加，且各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 RT-PCR检测COC1/DDP细胞DR4、DR5、Smac及Survivin表达以DR4、DR5、Smac及Survivin基因扩增产物电泳带的吸光度，反映各自表达水平。

如图7所示，从右向左条带分别代表对照组、DDP 0.5 μg/mL组、DDP 1 μg/mL组及DDP 2 μg/mL组。

COC1/DDP细胞DR4水平对照组和DDP组表达均较低，且不同浓度DDP组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

DR5表达水平较对照组明显升高，DDP 2 μg/mL组为对照组的3.45倍（P＜0.001）。

Survivin表达均较对照组减少（P＜0.001），且不同浓度DDP组间比较无明显差异（P>0.05）。

Smac表达渐次增加，DDP 2 μg/mL组为对照组的2.82倍（P＜0.001）。

3 讨论肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL是TNF超家族的新成员。

TRAIL 通过与死亡受体（death receptor，DR）的功能受体DR4、DR5结合，能特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无明显毒性，与FasL和TNF-α对多种组织细胞有毒性相比，TRAIL在肿瘤治疗方面具有更好的应用前景[4-7]。

目前普遍接受的TRAIL凋亡诱导途径有两条，即线粒体依赖型途径和线粒体非依赖型途径。

I型为线粒体非依赖型途径，即活化的caspase-8直接激活下游效应蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-7而诱导凋亡。

Ⅱ型为线粒体依赖型途径，活化的caspase-8促使Bid催化断裂形成有活性的截短Bid（tBid）并定位于线粒体膜，引起线粒体跨膜电位降低或破坏，促使线粒体释放细胞色素c、促凋亡蛋白Smac和dATP 结合形成凋亡酶体（apoptosome），进而活化效应蛋白，最终导致细胞凋亡[8-14]。

本实验通过MTT法证实TRAIL蛋白可抑制COC1/DDP细胞生长，与DDP 联合用药的抑制率高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和，提示两者联合对COC1/DDP细胞可能有协同抑制增殖作用。

流式细胞仪Annexin V-FITC法检测细胞凋亡结果说明这种抑制作用部分源于两者的促凋亡作用。

RT-PCR检测结果表明经过DDP处理后COC1/DDP细胞DR5表达增加，且可能通过线粒体途径中促凋亡蛋白Smac表达增加导致细胞凋亡。