miR—218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的实验研究

miR—218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的实验研究目的研究miR-218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的影响及可能机制。

方法实时定量PCR检测A2780及顺铂耐药细胞株A2780/DDP中miR-218的表达，转染miR-218 inhibitors和mimics改变A2780及A2780/DDP细胞中miR-218的表达，MTT法检测转染前后细胞对顺铂的敏感性，并分析Wnt2B蛋白表达的改变。

结果与A2780细胞相比，miR-218在A2780/DDP中的表达明显降低。

A2780细胞转染miR-218 inhibitors后，细胞对顺铂的敏感性降低，Wnt2B 蛋白表达明显增强；而A2780/DDP细胞转染miR-218 mimics后，细胞对顺铂的敏感性增强，Wnt2B蛋白表达明显减少。

结论miR-218可能通过靶向Wnt2B 抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂的耐药性。

标签：miR-218；卵巢癌；顺铂耐药性；Wnt2B卵巢癌死亡率位于女性生殖系统肿瘤之首，在女性肿瘤死亡率中位于第五位，多数死亡原因是肿瘤化疗耐药[1-2]。

肿瘤耐药是个复杂的问题，涉及药物在体内及细胞内的转运、代谢、细胞的损伤与修复等多个方面[3]。

microRNA是一种非编码的小核糖核酸，其在自然界广泛存在，包括人体。

研究表明其参与肿瘤细胞的化疗耐药[4-5]。

有报道显示，miR-218在卵巢癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤中均下调[6]，而在急性淋巴细胞白血病中为高表达[7]，这表明miR-218表达有细胞种属性，在不同的肿瘤细胞中功能和作用可能不同。

还有报道显示，miR-218参与宫颈癌对顺铂的化疗耐药[8-9]。

在卵巢癌中，具体情况如何，目前未见报道。

1 材料与方法1.1 材料卵巢癌细胞A2780及其衍生的顺铂耐药细胞株A2780/DDP，均获赠于华中科技大学同济医院肿瘤生物研究中心。

RPMI 1640培养基、小牛血清、脂质体2000（美国Life Technologies公司）。

顺铂、噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）。

miR-218 mimics和inhibitors及阴性对照（美国Dharmacon公司）。

Wnt2B抗体（美国Abcam公司）。

β-actin（美国Santa Cruz公司）。

Trizol（美国Invitrogen 公司）。

miR-218逆转录引物及实时定量PCR扩增引物、反转录试剂盒、TaqMan MicroRNA试剂盒、U6 snRNA（中国锐博公司）。

1.2 A2780及A2780/DDP细胞中miR-218表达的Real-time PCR检测A2780及A2780/DDP细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温密闭培养箱内传代、培养，细胞处于生长对数期时进行实验。

按照Trizol说明书抽提总RNA，应用反转录试剂盒，按产品说明书将总RNA反转录成cDNA，应用TaqMan MicroRNA试剂盒对合成的cDNA进行实时定量PCR反应，反应条件：95℃变性1 min；95℃15 s，60℃20 s，70℃15 s，40个循环，U6作为内参照，分别进行数据分析。

每一实验重复3次。

1.3 miR-218 mimics与inhibitors的转染将处于生长对数期的A2780及A2780/DDP细胞接种于6孔板中，每孔加入1×106个细胞，培养24 h。

按照脂质体2000说明书进行阴性对照（NC组）、miR-218 inhibitor和mimics组的转染，并设置空白对照。

将miR-218 inhibitors及对照转染于A2780细胞中，miR-218 mimics及对照转染于A2780/DDP细胞中。

转染6 h 后换新培养基，继续培养24 h用于后续实验。

Real-time PCR检测转染效率。

1.4 MTT法检测转染前后的细胞对顺铂的敏感性将转染前后的A2780及A2780/DDP细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板中。

24 h后加入浓度分别为0、10、20、30、40、50 μmol/L的顺铂，每个浓度设3个复孔，培养48 h后加入MTT溶液（5 mg/ml）15 μl，继续培养4 h，弃上清，加入100 μl DMSO后振荡20 min，在酶联免疫检测仪上选择波长570 nm测定各孔光密度值（D），取重复孔光密度值的平均值。

各浓度梯度孔的细胞存活率（%）=（D实验孔/D对照孔）×100%，绘制细胞的存活曲线。

1.5 细胞中Wnt2B蛋白表达的免疫印迹检测收获对数生长期转染前、转染mimics和inhibitors后及对照组的细胞，以100 μl预冷的细胞裂解液裂解30 min，10 000×g 4℃下离心10 min，采用Bicinchoninic acid法测定提取蛋白的浓度。

取50 μg总蛋白加入等量上样缓冲液进行电泳，水浴式电转仪转至PVDF膜上；5%脱脂奶37℃封闭1 h，加入Wnt2B一抗，浓度为1∶500，于4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗，常温孵育1 h，最后NBT/BCIP显色拍照。

1.6 统计学方法采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，计量资料用x±s表示，采用t检验或方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 miR-218在A2780及A2780/DDP细胞中表达的比较miR-218在A2780/DDP细胞中表达为0.19±0.05，相比A2780明显下降（P ＜0.05）（图1）。

2.2 miR-218 inhibitors及mimics转染效率的比较miR-218 inhibitors及对照转染A2780细胞，结果显示，miR-218 inhibitors 明显抑制了A2780细胞中miR-218的表达；miR-218 mimics及对照转染A2780/DDP细胞，结果显示，miR-218 mimics明显增强了A2780/DDP细胞miR-218的表达（图2）。

2.3 miR-218表达的改变对A2780及A2780/DDP细胞顺铂药物作用的影响MTT法显示，与对照组相比，A2780细胞转染miR-218 inhibitors后，随着DDP药物浓度（0、10、20、30、40、50 μmol/L）的增加，细胞存活率明显增加；阴性对照组细胞活性分别为（95.06±1.42）%、（70.97±1.63）%、（48.54±1.96）%、（20.84±3.06）%、（9.46±1.41）%、（7.52±2.17）%；miR-218 inhibitors组分别为（96.55±1.71）%、（88.14±1.42）%、（81.40±1.79）%、（71.33±2.19）%、（50.47±2.77）%、（22.91±2.38）%。

A2780/DDP细胞转染miR-218 mimics后，细胞存活率明显下降；阴性对照组细胞活性分别为（96.69±1.65）%、（91.92±2.05）%、（86.91±1.58）%、（83.88±2.71）%、（77.48±2.63）%、（60.07±2.04）%；miR-218mimics组分别为（96.72±1.69）%、（87.37±1.63%）、（83.03±2.03）%、（75.32±2.18）%、（60.77±2.95）%、（41.39±2.57）%。

差异具有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.4 miR-218表达的改变对A2780及A2780/DDP细胞中Wnt2B蛋白表达的影响A2780细胞转染miR-218 inhibitors后，Wnt2B蛋白表达明显增强；A2780/DDP细胞转染miR-218 mimics后，Wnt2B蛋白表达明显减少（图4）。

3 讨论有研究表明，过表达的miR-218能抑制多种肿瘤细胞的侵袭转移，如胶质母细胞瘤、胃癌、甲状腺癌、前列腺癌等[10-13]；通过调节AKT-mTOR信号通路抑制宫颈癌HeLa细胞的生长，并提高HeLa细胞对顺铂的敏感性[8]；通过降低BMI1表达而促进结肠癌细胞凋亡[14]；还参与斑马鱼的心脏发育[15-16]；以上说明miR-218对生物机体的正常发育及肿瘤细胞的抑制有重要作用。

其在卵巢癌细胞中的作用目前研究较少，对卵巢癌细胞顺铂药物作用的影响未见报道。

在卵巢癌细胞A2780及A2780/DDP中检测发现，miR-218表达有差异，说明miR-218可能参与卵巢癌细胞的化疗耐药的调节。

改变A2780与A2780/DDP 细胞中miR-218的表达，看是否逆转肿瘤细胞对顺铂药物的敏感性，结果发现，当降低A2780中miR-218的表达，导致A2780对顺铂的敏感性降低；当增强耐药细胞株中的miR-218表达时，顺铂耐药细胞株的敏感性增强。

miR-218逆转了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，进一步证实miR-218调节卵巢癌细胞的化疗耐药。

Wnt家族为分泌性蛋白，具有广泛的生物功能，如细胞生长分化、器官形成等[17]。

根据Wnt蛋白在细胞或动物体内作用的模式可分为经典和非经典Wnt 蛋白两类[18]。

Wnt2B是经典的Wnt分子，于1996年被克隆出来，是Wnt家族19个成员中的第13个人WNT基因，与胚胎发育相关。

近年来研究表明Wnt2B 与肿瘤的发生发展密切相关，除了参与多种肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭功能的调节外，还被证实与细胞的凋亡密切相关[19-22]。

经TargetScan、Pictar与Mirnada 等数据库分析，Wnt2B基因可能是miR-218的靶基因，本实验通过检测miR-218表达与Wnt2B蛋白表达之间的关系，结果显示Wnt2B与miR-218表达呈负相关。

图4显示，Wnt2B在A2780/DDP细胞中表达，相比A2780细胞是增强的；图1显示，miR-218在A2780/DDP细胞中表达，相比A2780细胞是降低的，正好与Wnt2B表达相反。

说明Wnt2B、miR-218在卵巢癌顺铂耐药中存在相关性。

研究表明，Wnt2B在卵巢癌中高表达，表达降低可抑制caspase-9/BCL2/BCL-Xl通路，增加卵巢癌细胞A2780与C13k对顺铂、紫杉醇的敏感性[23]，miR-218可能是通过靶向Wnt2B基因，影响caspase-9/BCL2/BCL-Xl通路，抑制卵巢癌细胞的化疗耐药性。