分子生物学基础知识

前言中心法则：

第一章PCR

一、概念：

PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

二、原理：

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、引物

PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA 序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右，Tm值在60℃比较好。

②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。

常用引物设计软件有：Primer Premier5.0 、Vector NTI Suit、DNAstar等

Tm值：

Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。

Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

四、示意过程：

例如：Taq Plus DNA Polymerase(P201)

附：DNA与RNA的区别？

1、组成单位不同：DNA的组成单位是脱氧核苷酸，RNA的组成单位是核糖核苷酸，

2、组成碱基不同：DNA的组成碱基是ATGC，RNA的组成碱基是AUGC

3、组成五碳糖不同：DNA的组成五碳糖是脱氧核糖，RNA的组成五碳糖是核糖，

4、空间结构不同：DNA是双螺旋结构，RNA一般是单链。

5、功能不同：DNA是遗传物质，RNA一般在细胞中不作为遗传物质。

第二章逆转录

一、概念：

逆转录(reverse transcription)是以RNA为模板合成DNA的过程。以DNA为模板合成RNA的过程叫做转录，此过程与该流动方向（DNA到RNA）相反，故称为逆转录。

二、原理：

人们通过体外模拟该过程，以样本中提取的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，构建cDNA文库，并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。

三、mRNA：

Messenger RNA (mRNA）——又叫做信使RNA，是一类在蛋白质合成时充当模板的RNA。信使RNA是脱氧核糖核酸（DNA）转录合成的带有遗传信息的一类单链RNA。它在核糖体上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的氨基酸排列顺序。mRNA存在于原核生物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如线粒体和叶绿体）中。

在真核生物中，最初转录生成的RNA称为核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），然而在细胞浆中起作用，作为蛋白质的氨基酸序列合成模板的是mRNA（messenger RNA）。hnRNA是mRNA的未成熟前体。两者之间的差别主要有两点：一是hnRNA核苷酸链中的一些片段将不出现于相应的mRNA中，这些片段称为内含子（intron），而那些保留于mRNA中的片段称为外显子（exon）。也就是说，hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新连接在一起；二是mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸（polyA）尾巴。

mRNA的核苷酸序列与DNA序列相应，决定着合成蛋白质的氨基酸序列。三个核苷酸组成一个密码子，每个密码子由三个前后相联的核苷酸组成，一个密码子只为一种氨基酸编码。共有64个密码子。

四、示意过程

附：

逆转录实验的注意事项：

1、RNA容易降解。RNase A酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。

2、用TRIZOL或RNA提取试剂盒提取的总RNA，包括信使RNA(mRNA)，转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)。其中核糖体RNA(rRNA)占总RNA的80-85%，信使RNA(mRNA)只占1-2%。

第三章荧光定量PCR

一、概念：

是指在PCR反应体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe等)，通过对PCR过程中产生的荧光信号积累实时监测整个PCR过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定DNA片段的初始浓度。

二、信号产生原理

三、重要概念

1、荧光基线：指PCR循环起始时，虽然荧光信号积累，但仍在仪器可以检测的灵敏度下，接近一条直线。

2、荧光阈值：等于3-18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，处于PCR扩增的指数期，一般仪器会自动给出一个荧光阈值，也可人为调节。

3、Ct值：指荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的循环数。

4、内参基因：又叫管家基因，是细胞中持续、恒量转录表达的基因，每个细胞中管家基因的转录水平相差很小，且始终和待测靶序列经过相同的处理过程，因而可以校正各个操作环节如组织样本的多少、RNA提取过程的得率及完整度、逆转录效率、RNA定量过程产生的误差，将靶基因归一化到相同细胞数比较。常用的内参基因有GAPDH、β-Actin、α-Tubulin等。

四、分类

目前常用的定量方法有两种：绝对定量和相对定量。两者的区别在于制作标准曲线的标准品的靶基因拷贝数是否已知。

1、绝对定量：DNA标准品的拷贝数是已知的，可以根据标准曲线和待测样本的Ct值，计算出待测样本靶序列的拷贝数。

2、相对定量：DNA标准品的拷贝数是未知的，只已知稀释倍数，可以根据各待测样本和相应内参基因的Ct值，计算出待测样本靶序列的拷贝数之间相差的倍数。

第四章克隆和点突变

一、传统克隆概念：

一般意义上，在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。

二、实验流程：

1）线性化载体的制备

2）插入片段PCR扩增

3）进行重组反应

4）反应产物转化、涂板

可概括为∶切、连、转、选。

"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。

附：基本概念

1、质粒载体：

质粒是独立于细菌染色体外自我复制的遗传因子，在基因工程中作为最常用，最简单的载体，一般包括三部分：遗传标记基因（抗生素抗性基因），复制区，多酶位点区域。天然的质粒都是环状双链DNA，大小从几个到数百个kb。

2、限制性核酸内切酶：

限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。

限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一

侧（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。

三、点突变

是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。通俗的说，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。

第五章细胞生物学

一、细胞凋亡：

细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，已成为生物学、医学研究的一个热点。因此，细胞凋亡的检测是实验研究过程中的重要手段。

用于早期凋亡：Annexin V Apoptosis Detection Kit

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36 kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行绿色荧光(FITC或EGFP)标记，以标记了的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

用于晚期凋亡：TUNEL Apoptosis Detection Kit

细胞凋亡晚期的一个显著特点是细胞染色体的DNA被内源核酸内切酶有规律的降解成长度约为180-200 bp的整倍数的片段。TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)法应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞的断裂DNA的3′-OH末端催化掺入荧光分子标记的dUTP，使得凋亡细胞可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。

二、细胞增殖周期：

细胞分裂具有周期性，即连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。一个细胞周期细分为以下几个阶段：G0期：分裂停止期，具有分裂能力的细胞在反复分裂数次之后，处于停止分裂状态的时期；

G1期：DNA合成准备期，开始合成细胞生长需要的各种蛋白质，糖类，脂类、RNA等生化物质，细胞DNA总量不变，主要为S期做准备；

S期：DNA合成期，此阶段DNA数目加倍；

G2期：分裂准备期，DNA合成已经终止，但是蛋白质、RNA等仍在合成，主要为M期做准备；

M期：分裂期，细胞开始分裂，一分为二，分裂结束后，再次进入G0期，循环分裂过程。

三、细胞转染：

转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。