第三章_愈伤组织诱导及分化调控

愈伤组织诱导的普遍性与特殊性？
1. 外植体的选择 需考虑以下因素:
(1) 外植体的基因型 (2) 同一植物不同部位外植体，其细胞的分化能
力有相当大的差别 (3) 植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更
容易去分化
一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度， 取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细 胞分化程度和生理状态
再生植株：器官发生(organogenesis)和体细胞 胚胎发生(somatic embryogenesis)
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的 生产。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着 于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以 同合子胚一样发育成植株。
器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈 伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器 官的过程 。
从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具 有全能性。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受 精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖 细胞的低。
全能性实现的两个必须满足的条件： 把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影
响下解脱出来 要给予植物细胞一定的刺激
二、几个重要的概念
外植体（explant): 植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，
（2）物理因素 光：
很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生， 说明光周期并不是非常重要的因子
有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而 在连续光照下则不能
尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期， 多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗
温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉 花就不一样
B
H
G
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棉花的胚性愈伤组织为淡黄色、米粒状、表面光滑、 疏松结构的组织 , 多由球状，近球状细胞构成、 细胞核大、细胞质比较浓。
二、愈伤组织的继代培养
1、定义：愈伤组织培养一段时间后必须转移到新鲜 培养基上以保持培养物的继续正常生长，更换一 次培养基称一次继代培养。(subculture)。
愈伤组织〔callus〕: 是指将植物上的某个部分 切下，形成外植体，接种到适宜的培养基上培养， 其外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏 松排列的薄壁组织
一、愈伤组织的诱导与培养
植物愈伤组织诱导(callus inducing) 使那些已分化的体细胞包括离体的器官、组织 和细胞在人工培养基上，经多次细胞分裂而失 去原来的分化状态，形成无结构的愈伤组织或 细胞团的过程。
可固定杂种优势
（3）胚状体的分类 体细胞胚：由普通植物体（孢子体）的各种器官
等双倍体的体细胞产生的胚状体 花粉胚:由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生
的胚状体，可发育成单倍体植株 都有两个特点：
两极性，即在其发生的最早阶段就具有根端 （胚根）和茎端（胚芽）
与母体植物或外植体的维管束系统无直接连系
1、器官分化过程
离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般 要经过三个生长阶段
第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织 第二阶段是“生长中心”形成。当把愈伤组织转
移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干 部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为 “生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤 组织中形成器官的部位 第三阶段是器官原基及器官形成 在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即 可形成器官原基。(如茎尖、根尖分生组织培养)
胡萝卜体细胞胚胎发生(引自Zimmerman, 1993)
（4）植物胚状体的产生方式及结构特征
胚状体起源于外植体表面已分化的细胞 薄壁细胞转变成迅速分裂的细胞，形成拟分生组
织的细胞团和小块愈伤组织，进而产生胚状体 从愈伤组织的表面产生胚状体 在悬浮培养时,游离细胞产生细胞团,这些细胞团
长大变成胚性细胞复合体, 进而产生胚状体 单个游离细胞发育成胚状体
第三章 愈伤组织的诱导、继代和培养
本章重难点
名词解析： 愈伤组织、脱分化、再分化、继代培养、 悬浮培养
愈伤组织诱导的形成过程 胚性愈伤与非胚性愈伤比较 继代培养的意义 悬浮培养的意义 植株再生的两个途径及其比较 合子胚与体细胞胚的比较
一、植物细胞的全能性
所谓细胞的全能性，•就是植物的每个细胞都 具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株 的能力。
可以是器 官、组织、细胞和原生质体等 根据外植体的不同，组织培养可分为植株培养、
胚胎培养、器官培养(如植物的根、茎、叶、花药、 子房、胚珠、胚等)、组织培养（含愈伤组织）、 原生体培养等
组织 分生组织
成熟组织
种子 胚乳子叶
胚 胚轴
原生质体
花梗 胚珠 果实
子房 花器 花托
花粉 花药 苞片
幼苗
根茎 芽
(3) 形成期:
外植体的细胞经过诱导，分裂形成了具有 无序结构的愈伤组织时期
①．细胞分裂部位和方向发生改变 细胞大小不再发生变化，愈伤组织表层的
分裂逐渐减慢和停止，内部组织细胞开始 分裂 。
②．分生组织瘤状结构和维管组织的形成。
形成由分生组织组成的瘤状结构，它变成不 再进一步分化的生长中心，而在其周缘产生 扩展的薄壁细胞
（2）研究胚状体的意义 数量多：一个培养物上诱导胚状体的数量比诱导
芽的数量要多得多 速度快：胚状体是从单细胞直接分化成小植株，
其它再生植株的方式一般要经过愈伤组织阶段 结构完整：胚状体一旦形成即可长成为小植株，
成苗率高 是研究胚发育的良好材料体系 用于人工种子研究与生产，可节约大量种子，且
第二节 愈伤组织分化与植株再生
细胞分化（differentiation），是指导致细胞形 成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变 的过程
一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态 和机能，这是在时间上的分化
同一种细胞后代，由于所处的环境（如部位）不 同而可以有相异的形态和机能，这是在空间上的 分化
2、体细胞胚胎发生与植株再生
（1） 胚状体的概念与分类
(1)概念：胚状体是植物组织培养中起源于非合子细胞，经 过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构。
这一定义有以下几方面的界定：
① 胚状体是组织培养的产物，只限于组织培养范围使用， 区别于无融合生殖的胚 ② 胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚 ③ 胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于组织培养中 分化的芽体
三、悬浮培养 悬浮培养(suspension culture):把一些小块生长 旺盛的愈伤组织放入液体培养基中，进行振荡培养， 从而使愈伤组织块变成良好分散性的细胞和小的细 胞聚集体。
1. 悬浮培养的用途
(1) 提供一个相对一致的细胞群体（供生化研究、 胚胎发生研究、胚的同步化研究等);
(2) 细胞增殖速度快，适于进行大规模培养,分 离原生质体的良好细胞来源;
为什么要继代培养？ 补充养分 避免毒害 增殖、分化的需要
2、意义
(1) 将愈伤组织转移到液体营养基上进行悬浮培养,以 建立悬浮培养细胞系。可用于单细胞大量繁殖、原生 质体分离及其再生植株的研究。
(2) 可以利用无性系细胞变异，筛选出具有有利经济 性状的细胞系，是现代作物育种的重要方法之一
(3) 发生变异的细胞系是研究组织细胞的染色体变化 以及作为植物遗传学和植物生理学研究的有用材料
瘤状结构散布在愈伤组织块中。这时形成了 维管组织，但不形成维管系统
③．细胞的体积不再减小。
④．出现了各种类型的细胞。
4、愈伤组织的形态、细胞学特征
(1) 愈伤组织的发生部位及特征
根据外植体来源不同，愈伤组织可以发生自形 成层，皮层，髓，次生韧皮部及木质部薄壁组 织和表皮等。
Primary structure of stems
(4)选择遗传稳定性好的外植体（顶端分生组织 和形成层的初生形成层细胞、胚细胞）
总之，外植体的选择一般以幼嫩的组织或器 官，顶端分生组织为宜.
2. 愈伤组织诱导
(1) 起动期 又称诱导期，外植体已分化的活细 胞在外源激素的作用下，通过脱分化起动而进 入分裂状态,开始形成愈伤组织。
诱导期是细胞准备进行分裂的时期，外植体处 在静止状态
(3) 研究次生代谢、酶诱导、基因表达、抗生素 的降解的良好实验体系;
(4) 多数悬浮细胞缺乏叶绿体、色素，对酶和次 生物质的分离及纯化十分有利
2、成批培养(batch culture) 是指在除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气 交换以外的密闭容器中，进行分散细胞的培养。
目的：获得最大产量的培养细胞 细胞增长S型曲线 ： 延迟期(lag phase) 、 指数生长期(exponential growth phase) 、 静止期(stationary phase)
一、器官发生与植株再生
在适合的激素浓度和配比及温光条件下，愈伤组 织细胞会发生生理代谢上的改变，促使细胞分裂 部位和方向改变，首先出现分生细胞，经细胞分 裂逐渐形成分生细胞团和分生组织，进一步再分 化形成维管结节直至分化成芽和根等器官。
概括为以下四种方式：
单极分化：愈伤组织中的分生中心在刺激物质的 影响下向着一极分化，形成有根无芽或者有芽 无根的现象。
E F
研究案例： 棉花体细胞胚胎发生相关基因的克隆
实验材料：C201 研究方法：SSH
(suppression subtractive hybridization) 241页
抑制差减杂交(SSH)原理
抑制差减杂交(SSH) 程序
抑制消减杂交过程 中的连接效率检测
抑制消减杂交产物
以胚性愈伤组织为Tester， 非胚性愈伤组织为Driver
2、影响器官发生的因素
（1）化学因素 早期烟草组织的研究，器官发生的表达可被外源
化学物质控制 高浓度的生长素和低浓度的分裂素可以促使细