从拟南芥的T0123代获得纯合株系转基因必经之路
从拟南芥的T0123代获得纯合株系转基因必经之路
作为模式生物，拟南芥（Arabidopsis thaliana）主要有以下几方面的优势：第一，拟南芥的基因组在常见的植物模型中是最小的，染色体数目也很少，只
有五对同源染色体。
第二，植株体积小，对环境的适应性强，生活周期短，繁殖能力强，播种到收
种需要两个月左右。
第三，自然条件下，拟南芥是严格的闭花自花传粉，基因高度纯合，易稳定遗传，强可诱变性。
第四，拟南芥研究的相关遗传手段和生化分子技术都已经比较成熟。
第五，丰富的种质资源。
运用高通量转化技术得到的T-DNA插入的突变体库，
已经鉴定的独立的T-DNA插入株，几乎覆盖了所有的编码基因。
健康生长的时候还是蛮可爱的
获得转基因拟南芥T0代：
日常使用浸花法（floral dip method）（Clough等，1998）转化拟南芥。
将拟南芥的花序放到含有农杆菌的转化介质中浸泡3～5分钟，在转化介质的帮助下，农杆
菌可以穿过植物细胞壁和质膜，侵染雌配子体即胚囊，并将带有目的基因和元件的
T-DNA片段整合到雌配子的基因组上（Desfeux等，2000; Bent A, 2023）。
T1T2T3获得纯合株系：
1.野生型拟南芥，称为T0代，经过侵染之后，而从T0代上收集到的种子是T1代种子（混合收种）
2.将T1代种子铺种在含有抗生素的MS培养基上，直接筛选出转基因T1代阳性
的幼苗，移栽到穴盘，悉心呵护，收集到T2代种子（单株收种）。
需要注意的是，T1代均为杂合子，但是并不确定是单拷贝或是多拷贝插入。
3.将T2代种子铺种在含有抗生素的MS培养基上，此时阳性苗：阴性苗（未发芽
的种子不计入）如果符合3：1的分离比，则目的基因以单拷贝插入，将其中的阳
性苗移栽，同样悉心呵护，收集T3代种子（单株收种）。
不符合3:1则可能有多
个拷贝插入不同位点（多拷贝插入往往会引起基因沉默现象，扔了算了）。
4.将T3代种子铺种在含有抗生素的MS培养基上，一段时间之后，你发现一些培
养皿里全是阳性苗，恭喜！你拿到了自己的转基因纯合株系。
没错，是我的崽
实用tips：
种子灭菌消毒，越到后面的时候，培养基上种子的密度要控制好，有能力的话最好做到粒粒分明，方便统计。
每次播种不要全部播完，给自己留条后路。
你永远不知道自己会不会碰到配错培养基，抗生素加错，培养基污染，疫情开不了学苗子活活旱死等各种状况（血泪控诉）。
1篇相关文献，感兴趣可以康康：唐微.几个转基因植株后代的遗传分析[J].安徽农业科学,2023(31):9867-9868.。
拟南芥的遗传转化
拟南芥的遗传转化作者：刘晓丽魏楠来源：《河南农业·教育版》2019年第09期摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。
通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。
后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
关键词：拟南芥;遗传转化;实验一、实验材料（一）试验材料转基因所需的菌株：农杆菌EHA105;转基因所需的模式植物：野生型拟南芥;转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。
（二）试验试剂本实验所需试剂主要有：Mu-rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）;YEB、YEP液体培养基;YEP固体培养基;抗生素氯霉素（chlorampheni-col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）;草铵膦（phosphinothricin，PPT）;v/v（1：5）的次氯酸钠溶液;琼脂;蔗糖;表面活性剂silwetL-77等。
二、实验方法（一）超表达载体的构建采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM-T-目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans 5a转化菌液，12，000rpm离心I min，吸除上清;第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150ul溶液P1（已加入RNase A和0.5%的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀;第三，向离心管中加入150ul溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解;第四，向离心管中加入350ul溶液P5，立即快速地上下颠倒12-20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min;第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。
拟南芥转化简易操作
拟南芥转化简易操作（滴染）热带农科院热带生物所的庞永奇向我们介绍了一种拟南芥转化的简易操作。
背景：拟南芥转化大体分为浸花、喷洒及滴染几种，主要是将农杆菌菌液重悬至一定浓度进行侵染，使用中各有优缺。
本人在研究中感觉滴染效果较好，并在实践中做了些简略与细化。
方法改进：摇菌3～5mL过夜，1.5mL管集3mL菌，以1mL渗入缓冲液（1/2MS大量、5%（W/V）蔗糖、0.02～0.05%silwet L-77）重悬，吸取调好的农杆菌菌液滴于每一簇刚露白的花蕾处。
做好标记后直接放回光照培养。
一周内对所转植株进行二次重复侵染转化。
约两三周会有第一批几个荚成熟，直接取了进行筛选，效果好的话一般可以筛到几株至几十株阳性苗。
后续的种子当然也要收着。
结果：一般情况下只需转化2～8株即可筛选获得十几或几十个转基因阳性株系。
单株可以分不同侧枝进行，效果也还不错。
一定要注意苗的生长状况，温度失控、虫害以及打药都可能造成不得影响。
新配的悬浮液浸润效果要好些，浸花时要保证溶液浸入。
http:/newsf/2010-8/2010820173025393.htm拟南芥转化（浸泡）1.准备工作：250mL LB（装锥形瓶中）500mL 5%蔗糖50mL离心管5-6个灭菌转化一般在剪花后一周左右烧杯（500mL）、玻璃棒2.（1）农杆菌活化 5 mL LB +15uL Rif(20mg/mL)+3.75uL Kan(100mg/mL)+200uL菌液。
即：5 mL LB液中（含Rif 60ug/mL;Kan 50ug/L）。
28℃摇床过夜。
（2）将活化的农杆菌液转至250uL LB液中。
LB（250mL）+750uL Rif +187.5uL Kan +5mL预培养的菌液，28℃摇1-2d,至色。
（3）5000rpm;10min. 去上清，加5%蔗糖悬浮沉淀（剩一两管）加至烧杯，混匀，调OD值为0.5—0.8之间（0.7—0.8为最佳）加150uL表面活性剂silwet，混匀浸泡花90s包上保鲜膜，倒放16—24h,保湿正常培养，收种种子的筛选：MS板加入50uL/mL Kan 即可。
提高烟草钾含量的技术途径
提高烟草钾含量的技术途径钾是烟草正常生长发育必需的大量营养元素，同时烟叶含钾量高低是烟叶品质优劣的重要指标。
钾与烟叶的香吃味、燃烧性和安全性有较强的相关性。
随着人类文明程度和健康意识的增强，人类越来越把安全性放在首位。
而烟叶钾含量增加可降低其TPM含量，从而提高烟草制品的安全性。
1 通过促进钾的吸收以提高烟草钾的含量绝大多数作物都是以K+形态来吸收钾素的。
烤烟吸钾过程是一个主动吸收过程，吸收速率与ATP含量直接相关，许多能量代谢的抑制物质或不良环境条件如低温、缺氧会阻碍ATP的合成，从而降低钾的吸收。
作物吸收钾的速率与很多因素有关，诸如植株代谢、通气、温度、水分和其他元素等。
目前研究认为，适当提高酸性土壤pH值，有利于烤烟对钾素的吸收；另外在所有阴离子中，硝酸根和磷酸二氢根能促进烟株对钾素的吸收，因此，施用磷酸二氢钾和硝酸钾对改善烟叶品质效果最明显。
2 通过物理调控措施来提高烟草钾含量在通过覆膜、断根等物理调控措施对烤烟烟叶钾含量影响的研究中发现：地膜覆盖有利于烟株生长中前期叶片中钾的积累，打顶后揭膜能明显提高烟株生长后期叶片的钾含量；打顶时在距茎20cm处从一侧断根有利于烟叶含钾量的提高，而断根太多会造成烟株含钾量的下降；在适当断根的同时补施钾肥，可能有利于叶片钾含量的进一步提高。
通过物理调控来提高烟叶钾含量是一项综合技术措施，必须根据我国目前的实际情况，在对育种、施肥等方面进行研究的同时，从生理的角度对不同基因型烟草需钾的营养特性、以及吸收钾的生理特性、限制K+在土壤中迁移的阻抗因素以及各方面的相互协调等进行广泛而深入的研究，找出我国烟草钾素营养障碍的原因，采用相应的技术措施和调节途径来提高K 含量。
3 通过钾肥种类、用量和施用技术来提高烟草钾含量研究认为，烟田所施钾肥产生的肥效应是K+与相伴阴离子共同作用的综合结果，其中SO42-对烟草生长和K+吸收影响较大，浓度过高将产生明显的抑制作用，而cl-对K+的吸收和肥效干扰较轻。
拟南芥35S∶NAS2载体构建和转基因株系的筛选
拟南芥35S∶NAS2载体构建和转基因株系的筛选王婷婷;曹树青;吴席;贾亚峰;陈逸凡;樊婷婷【期刊名称】《合肥工业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2024(47)3【摘要】为了研究基因NAS2和BZIP44在拟南芥缺铁胁迫响应中的遗传关系,文章以野生型(wild type,WT)拟南芥为材料构建35S∶NAS2/WT转基因植株,以拟南芥突变体bzip44为材料构建35S∶NAS2/bzip44转基因植株;提取野生型拟南芥的RNA,以其反转成的cDNA作为模板克隆NAS2的CDS区域,将双酶切后的目的片段与同样双酶切的pART27质粒进行连接,得到的连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中,通过菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定和测序得到阳性单克隆,然后将重组质粒转入农杆菌感受态GV3101中,获得阳性单克隆菌落;用浸花法分别侵染野生型拟南芥和纯合的拟南芥bzip44突变体植株,通过筛选和鉴定得到纯合的35S∶NAS2/WT和35S∶NAS2/bzip44转基因植株。
研究结果为基因NAS2和BZIP44在拟南芥缺铁胁迫响应中的遗传关系提供参考。
【总页数】5页(P417-421)【作者】王婷婷;曹树青;吴席;贾亚峰;陈逸凡;樊婷婷【作者单位】合肥工业大学食品与生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.拟南芥MYB4基因GUS载体构建及其转基因植株的筛选2.拟南芥SPM12基因GFP载体构建及转基因植株筛选3.拟南芥MDH2基因GFP载体构建及转基因植株的筛选鉴定4.拟南芥HKT1基因pCAMBIA载体构建及转基因材料筛选5.拟南芥Pro:RFE6-GUS载体的构建及其转基因植株的筛选因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
拟南芥LHY基因超表达与成花转变
高等植物开花是由内部基因和外界环境共同 作用来完成。这个调节过程涉及错综复杂的信号 通路。拟南芥作为研究植物开花调控途径的模式 植物，它对环境条件比较敏感并且适于利用遗传 学技术对其开花机制展开研究，目前对控制其开 花时间尤其开花信号通路研究方面取得了很大进 展。环境因子是多种开花调控网络的组成部分， 遗传和分子生物学研究鉴定出 4 条调控植物开花
收稿日期：2020-04-26 基金项目：天津农学院研究生培养质量提升项目（101018） 作者简介：尹晟（1994—），男，硕士在读，从事果树遗传方面的研究。E-mail：554182342@。 通信作者：龙鸿（1964—），男，教授，博士，主要从事果树遗传、发育生物学研究。E-mail：longhong@。
的主要途径：光周期途径、自主开花途径、春化 途径和赤霉素（GA）途径[1-5]。
植物在长期进化过程中，形成了随着外界昼 夜循环同步变化的内在控制时长的生物学机制生物节律钟（circadian clocks），调控气孔开闭、 生长、光周期等生理过程[6]。光周期途径中的核心 调控蛋白 CONSTANS（CO）与数个信号系统相连， 如生物节律钟和光信号的光受体[5]，光信号则与内
押广东卷第20题 基因工程(原卷版)
押广东卷基因工程1、（2023广东高考）种子大小是作物重要的产量性状。
研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。
通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
（2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。
为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。
在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。
2、（2022广东高考）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。
高三生物专题复习—语言表达(3) 遗传实验中相关推理分析
遗传题表述类方法突破：假说－演绎法 “假说－演绎”策略的解题思路为当没有坐标图和规律作为依据时， 需先结合题干找出待解决的问题，再列举出各种合理假说，接着通 过演绎推理得出预期结果，最后将检验结果是否符合题目要求作为 作答依据。突破此类题目要从根本上掌握相关的基本规律和技巧： 显隐性的判断方法、基因型和表型的推导、基因位置的推断、基因 传递规律的判断等。
等位基因 A(a)控制，有抗除草剂基因用B＋表示、无抗除草剂基因用 B－表示。
杂交
F2的表型及数量(株)
组合 矮秆抗除草剂 矮秆不抗除草剂 高秆抗除草剂 高秆不抗除草剂
甲×乙
513
167
0
0
甲×丙
109
37
313
104
乙×丙
178
12
537
36
杂交
F2的表型及数量(株)
组合 矮秆抗除草剂 矮秆不抗除草剂 高秆抗除草剂 高秆不抗除草剂
实验一：品系M(TsTs)×甲(Atsts)→F1中抗螟∶非抗螟约为1∶1 实验二：品系M(TsTs)×乙(Atsts)→F1中抗螟矮株∶非抗螟正常株高约为 1∶1
实验一：品系M(TsTs)×甲(Atsts)→F1中抗螟∶非抗螟约为1∶1 实验二：品系M(TsTs)×乙(Atsts)→F1中抗螟矮株∶非抗螟正常株高约为 1∶1
答案 如图所示
(2)为克服籼－粳杂种部分不育，研究者通过杂交、连续多代回交和筛选， 培育出育性正常的籼－粳杂交种，过程如图。通过图中虚线框内的连续 多代回交，得到基因型A1A1B1B1的粳稻。若籼稻作为连续回交的亲本， 则不能得到基因型A2A2B2B2的籼稻，原因是F1(A1A2B1B2)产生基因型为 _A__2B__2_的配子不育。
异源过表达蒺藜苜蓿MtATG7_基因促进拟南芥抵抗碳氮饥饿胁迫
朱晓洁, 王贤杰, 杨明康, 等. 异源过表达蒺藜苜蓿MtATG7基因促进拟南芥抵抗碳氮饥饿胁迫[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(5): 810-817.ZHU Xiaojie, WANG Xianjie, YANG Mingkang, et al. Heterologous overexpression of MtATG7 gene from Medicago truncatula promotes resistance to carbon and nitrogen starvation in Arabidopsis thaliana [J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(5): 810-817.异源过表达蒺藜苜蓿MtATG7基因促进拟南芥抵抗碳氮饥饿胁迫朱晓洁1 ，王贤杰1，杨明康1，黄 巍1,2，陈 亮1,2(1 华南农业大学 生命科学学院, 广东 广州 510642； 2 岭南现代农业科学与技术广东省实验室, 广东广州 510642)摘要: 【目的】真核生物通过保守的自噬途径降解错误折叠的蛋白质或受损细胞器，实现对营养物质的循环再利用。
本文旨在解析苜蓿自噬基因在植物应对营养胁迫中发挥的功能，为指导苜蓿的选育和改良提供参考。
【方法】以自噬途径的关键限速基因ATG7(Autophagy-related gene 7)为切入点，分析ATG7氨基酸序列在不同植物中的相似性。
利用蒺藜苜蓿Medicago truncatula 的MtATG7基因过表达载体转化拟南芥植株，获得异源过表达植株35S::MtATG7和互补拟南芥突变体的atg7/35S::MtATG7植株，并对其抗胁迫表型和自噬活性进行分析。
【结果】在碳饥饿条件下，atg7/35S::MtATG7能够挽救atg7突变体叶片早衰的表型；恢复到正常生长条件以后，35S::MtATG7和atg7/35S::MtATG7植株存活率和野生型相比都显著提高。
拟南芥转化
1农杆菌感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于 5 ml含100 µg/ml利福平(Rifampicin)，50 µg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 µg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 µl接种于50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 µl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。
2.质粒转化农杆菌GV3101将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化(冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：1) 从-80℃冰箱中取出GV3101 感受态细胞(100 μl)，置于冰上解冻；2) 加入5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴5 min；3) 液氮冷冻8 min；4) 37℃水浴热激5 min；5) 加入900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏；6) 复苏结束后于4000 r/min 室温离心5 min；7) 吸去800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；8) 28℃倒置培养2 d 直至长出阳性菌落；9) 挑取单克隆菌落，经LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落(液) PCR验证，以确认是否成功转化。
经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。
（3拟南芥的转化在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。
分子生物学中钾离子通道研究进展(精)
分子生物学中钾离子通道研究进展摘要：钾离子通道是植物钾离子吸收的重要途径之一。
近年来，已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离到多种钾离子通道基因，包括内向整流型钾离子通道基因(如OsAKT1，DKT1，Ktrrl，KIll，KZM1，ZMK2等)和外向整流型钾离子通道基因(如CORK，PTORK ，STORK 等)。
文章分别从结构、功能以及相关基因等三方面综述了关于植物钾离子通道的分子生物学研究进展，并对应用生物工程技术改良植物的钾营养性状进行了讨论。
关键词：钾离子通道；结构；基因离子通道(ion channe1)是跨膜蛋白，每个蛋白分子能以高达l08个／秒的速度进行离子的被动跨膜运输，离子在跨膜电化学势梯度的作用下进行的运输，不需要加入任何的自由能。
一般来讲，离子通道具有两个显著特征：一是离子通道是门控的，即离子通道的活性由通道开或关两种构象所调节，并通过开关应答相应的信号。
根据门控机制，离子通道可分为电压门控、配体门控、压力激活离子通道。
二是通道对离子的选择性，离子通道对被转运离子的大小与电荷都有高度的选择性。
根据通道可通过的不同离子，可将离子通道分为钾离子(potassium ion，K )通道、钠离子(natrium ion，Na )通道、钙离子(calcium ion，Ca2 )通道等。
其中，K 通道是种类最多、家族最为多样化的离子通道，根据其对电势依赖性及离子流方向的不同，可把K 通道分为两类：①内向整流型K 通道(inward rectifier K channel；Kin)，② 外向整流型K 通道(outward rectifier Khannel；K out)。
K 是植物细胞中含量最为丰富的阳离子，也是植物生长发育所必需的唯一的一价阳离子，它在植物生长发育过程中起着重要的作用，具有重要的生理功能。
植物中可能存在K 通道，这一点早在20世纪6o年代植物营养学界就有人提出，而一直到80年代才被Schroeder等人[23证实，他们利用膜片钳(patch chmp)技术，首先在蚕豆(V／c／afaba)的保卫细胞中检测出了K 通道钾离子通道的结构单个钾离子通道是同源四聚体，4个亚基(subunit)对称的围成一个传导离子的中央孔道(pore)，恰好让单个K 通过。