小鼠脑细胞提取流式
分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法
分离小鼠骨髓中的免疫细胞的方法小鼠骨髓免疫细胞分离骨髓是造血的场所，含有各种类型的免疫细胞，包括粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和髓系干细胞。
分离这些细胞对于研究免疫系统、干细胞生物学和疾病机制至关重要。
以下是分离小鼠骨髓中免疫细胞的详细方法：材料：小鼠PBS（pH 7.2-7.4）细胞培养液（例如 RPMI 1640）琼脂糖琼脂（0.5% w/v）40 µm细胞过滤器50 mL离心管移液器台式离心机步骤：1. 屠宰小鼠：使用二氧化碳或异氟烷麻醉小鼠，然后通过颈椎脱臼法将其屠宰。
2. 取出股骨：将小鼠固定在工作台上，用无菌镊子和剪刀小心取出股骨。
3. 暴露骨髓：使用无菌剪刀剪开股骨两端，用 PBS 冲洗髓腔，将骨髓液冲入一个 50 mL 离心管中。
4. 过滤细胞：用 40 µm 细胞过滤器将骨髓液过滤到另一个50 mL 离心管中。
5. 离心细胞：以300 × g 的速度离心 10 分钟，除去沉淀的骨骼碎片和未裂解的细胞。
6. 收集沉淀：小心地吸出上清液，并收集沉淀的细胞。
7. 再悬浮细胞：用细胞培养液将细胞重悬浮，调整细胞密度至1-2 × 10^6 个细胞/mL。
免疫细胞的分离：分离免疫细胞需要专用的抗体和磁珠。
不同的抗体靶向不同的细胞表面标志物，使特定细胞类型与磁珠结合。
磁珠与细胞的结合强度取决于抗体的亲和力和细胞表面标志物的表达水平。
1. 抗体标记：向细胞悬液中加入抗体，孵育 30 分钟，4°C。
2. 磁珠孵育：加入与抗体匹配的磁珠，孵育 15 分钟，4°C。
3. 磁分离：将细胞悬液转移到磁分离柱上，放置在磁架上。
靶细胞将被磁珠吸附在柱上，而未标记的细胞将流出。
4. 洗涤：用 PBS 洗涤磁柱多次，除去未结合的细胞和抗体。
5. 洗脱：使用洗脱缓冲液将靶细胞从磁珠上洗脱，收集洗脱液中的细胞。
细胞分析：分离的免疫细胞可以使用流式细胞术进行分析。
流式细胞术检测小鼠全血中人血小板方法的建立_聂咏梅
Flow CytometricMethodforHumanPlateletsCountinginMouseWholeBlood NIE Yong-mei☆, DeborahF. Dumont, LarryJ.Dumont.☆GuangzhouBloodCenter, Guangzhou510095, China. 【Abstract】 Objective Tosetupaflowcytometricmethodforhumanplatelets(hPLTs)countinginmousewhole blood(MWB).Methods MWBwascollectedviacardiacpuncturefromSCIDmicesacrificedwithCO2 andpreserved withEDTA.Humanplatelets(hPLTs)werepreparedfromapheresisplateletsandmixedwithMWB(V/V=1∶4).Subsequently, mixedspecimenwerefixedby1% coldparaformaldehyde, heldovernightat4℃, washedandresuspendedwith 1% PBS/1% FBS.Fourgroupswereset, includingtwopositivecontrolgroups, oneexperimentalgroupandoneisotype control.Plateletswerecountedbyflowcytometry.ConcentrationofhPLTswhichdesignedasexpectedhPLTswasmeasuredbyADVIA120 hematologysystem(Bayer).Theoriginalmixedspecimenwasdilutedby10, 100, 1 000, 10 000 and100 000 -foldwithMWB.Themixedbloodwasthendouble-stainedwithPE-CD41 andFITC-CD61 inTruCOUNTtubetomeasuredhPLTs, whichwasdesignedasmeasuredhPLTs.Correlationwasanalyzedbetweentheexpected andmeasuredhPLTs.Results Humanplateletsweresuccessfullycountedbyflowcytometry.Nofalsepositiveorfalse negativeresultwasobserved.GoodcorrelationbetweenexpectedandmeasuredhPLTswaspresentedrangingfrom3 000 to 150 000/μL.Conclusion hPLTscanbecountedbytheflowcytometicmethodrangingfrom 3 000 to150 000/μL.
小鼠灌注取脑
成年小鼠心脏灌流及取脑组织步骤
实验步骤：
1、小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。
用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。
2、将注射针头插入小鼠左心室，同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。
灌注生理盐水，时间维持在1min（10~20ml）灌注液左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白。
3、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，用4%PFA灌流固定，当PFA 流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度下调，以使固定更加充分。
整个PFA灌流时间约为5min。
（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联）
4、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。
将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。
取脑及脱水：
1、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。
将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。
需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。
2、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。
3、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。
4、将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中，过夜固定。
5、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。
此时可将脑取出进行冷冻切片。
取小鼠脑组织
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。
其实过程与大鼠近似，我的经验是：1.?材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；2.?步骤：处死小鼠，取头颅；剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。
3.?注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。
做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。
先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。
具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。
然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。
用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。
生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。
然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。
取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。
小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验-复旦精品课程
计算细胞活力：计数200个细胞中活细胞的百 分率，一般活力应在95%以上。
（四）流式细胞术检测
PE-CD3 T cells
注意事项：
镜下有两个以上细胞组成的细胞团，按单个细胞计算，若细胞团10% 以上，说明分散不好，需重新制备细胞侧面观
支持堤
计数池
1mm 支持堤
（0.1mm）
细胞计数注意事项
细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池要一次完成，不能产生气泡或充池不足的现象。 若每个中方格之间相差超过20个以上，要重新充池计
数。正常范围内，两次红细胞计数相差不得超过5%。 白细胞计数时，各大方格间的细胞数相差不超过10%
。
如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏， 故应先做红细胞计数
稀释液要过滤，试管、计数板均清洁干燥，以免杂质、 微粒等被误认为细胞。
（四）计算细胞活力
50μl细胞悬液+ 50μl的0.2%苔盼兰溶液并混 匀；
上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包 括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细 胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的 Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密 度梯度离心时,•各种血液成分将按密度梯度重新分布聚 集。
成年小鼠心脏单个细胞悬液的制备及流式细胞检测
成年小鼠心脏单个细胞悬液的制备及流式细胞检测目的：制備成年小鼠心脏单细胞悬液，测定心肌缺血再灌注损伤（reperfusioninjury，RI）小鼠心肌中白细胞的分布情况。
方法：选取10～12周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠15只，按照随机方法将其分为假手术组5只（模型制备成功5只）和RI 24 h组10只（模型制备成功7只）。
RI 24 h组小鼠心脏缺血30 min后，于再灌注24 h后摘取小鼠心脏，配置心脏消化液，冲洗剪碎进行消化，经过滤离心收集心脏细胞，行流式细胞检测，以CD45标记白细胞，并进一步行CD11c 标记树突状细胞及Ly6C标记单核细胞。
比较两组CD45阳性细胞比例及CD11c、Ly6C标记的细胞占CD45阳性细胞比例；比较两组各细胞在总心肌细胞中的比例。
结果：每只小鼠心脏制备所得的单个细胞悬液行细胞计数为（1～2）×106个。
RI 24 h组CD45阳性细胞占心肌细胞比例高于假手术组（P＜0.05）；RI 24 h 组CD11c+Ly6C+树突状细胞占CD45阳性细胞的比例高于假手术组（P＜0.05）。
RI 24 h组CD11c标记的树突状细胞及Ly6C标记的单核细胞等各亚群细胞在总心肌细胞中的比例均高于假手术组（P＜0.05）。
结论：成年小鼠心脏细胞的单细胞悬液可以通过切碎和消化制备，可用单细胞悬液流式细胞仪检测RI心肌白细胞、树突状细胞和单核细胞的显著变化。
本研究为小鼠心脏白细胞的详细分析提供了一种可行的方法。
小鼠动物模型实验是进行科学研究的重要方法，与大鼠等动物模型相比，在炎症免疫方面的实验中小鼠来源的炎症细胞分类、细胞标记、实验相关抗体等更加详尽、充沛。
炎症细胞的研究不仅需要定性及形态学的研究，定量及功能研究可以提供更为准确、全面的信息。
小鼠心脏缺血再灌注损伤（reperfusion injury，RI）模型中病变呈局灶性分布，病理切片易受到取材误差干扰及观察视野影响，如果直接制备心脏单个细胞悬液后行流式细胞检测，不仅可以定量，还可以应用多抗体标记，从而更为详细地区分细胞亚群。
小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化
小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化神经干细胞被认为是一类具有自我更新和多潜能分化亚群的细胞，能够产生成熟神经元和神经胶质细胞。
而小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化一直是神经科学研究的一个重要课题。
小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化的方法主要有两种：体外培养和体内标记。
其中，体外培养法是常用的方法之一，其主要步骤包括：从小鼠脑组织中分离出神经干细胞，将其在低黏附培养条件下培养，用培养基逐渐去除非神经干细胞，提纯出纯正的神经干细胞。
具体来说，小鼠脑组织的分离和消化可以通过切片法或酶消化法完成。
其中酶消化法可用的酶有多种，如胰酶、玉米胚芽酶等。
一般来说，使用Papain是最常见的方法，其消化时间和浓度的选择需要根据组织的类型和实验的要求而定。
随后将细胞分离并筛选，即可获得含有神经干细胞的原代培养物。
接下来，体外培养条件的优化是保证培养成功率的重要因素。
小鼠成年性神经干细胞体外培养中所用的培养基主要包括DMEM-F12培养基和N2培养基或B27培养基的组合。
在培养基添入bFGF (20 ng/ml)和EGF (20 ng/ml)的情况下，小鼠成年性神经干细胞可以存活并自我更新。
同时，将细胞培养在低黏附板上也是培养成功的关键，此时细胞间的物理纽带松弛，可以最大化地模拟细胞在体内的状态。
培养过程中，需要使用划痕法或免疫染色法来鉴定纯度。
对于划痕法，将涂片中的单元格划成斜线，如果发现小鼠成年性神经干细胞在划痕的两侧增殖，则表示培养纯度高。
而免疫染色法则通过检测神经生长因子受体（NGFR）或神经元标记Nestin蛋白，来判断细胞的类型和纯度。
除了体外培养法，体内标记法也是一种可行的小鼠成年性神经干细胞分离的方法。
体内标记法主要是将神经干细胞标记为一种特定的融合蛋白，以便在体内将其分离出来。
目前常用的体内标记法是将神经干细胞瞬间转染为GFP或复合物蛋白的方法，这些蛋白可以较准确地表达在神经干细胞的表面，并带有一个标记蛋白。
小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤
小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤1.确定实验目的：在进行任何实验之前，首先需要明确实验的目的和研究问题，以确定所需的实验材料和方法。
2.准备实验材料：准备所需的实验材料，包括培养基、细胞培养试剂和培养器具等。
3.小鼠胚胎的取材：通过异交法得到小鼠胚胎，通常在胚胎发育第15-17天时取材。
使用无菌饲料给小鼠提供丰富的营养，使其胚胎发育良好。
4.分离大脑皮层组织：将小鼠胚胎处死后，将其大脑取出并置于无菌的PBS缓冲液中。
然后用剪刀将大脑的外围组织移除，只保留皮层组织。
5. 组织的化学消化：将取出的大脑皮层组织放入含有无菌PBS缓冲液的培养皿中，用Pipettor将组织切碎成较小的块状，并加入含有0.05%胰蛋白酶和0.1%DNA酶的消化液，室温下消化15-20分钟。
6.组织的离心：将消化液中的细胞悬液经过离心处理，用PBS缓冲液洗涤1-2次，去除消化液中的酶和杂质。
7.细胞计数和分装：用显微镜和细胞计数板对细胞悬液进行计数，通过稀释和分装的方法，得到所需的细胞浓度。
8.细胞接种：将细胞悬液均匀地滴加到含有预先涂覆了聚-L-赖氨酸的培养皿中，使细胞均匀附着在培养皿的表面上。
9.培养基的添加：在细胞接种后，将预先配制好的培养基加入培养皿中，以提供细胞所需的营养和生长因子。
10.培养条件的控制：将培养皿放置于恒温培养箱中，温度为37°C，湿度为95%，CO2浓度控制在5%左右。
每隔一段时间，检查培养皿中细胞的生长情况，确保细胞的健康生长。
11.细胞形态观察：使用倒置显微镜观察细胞的形态变化，观察细胞的神经突起、细胞形态和相互作用等。
12.细胞维持和传代：根据实验需要，定期更换培养基以提供细胞所需的营养和生长因子。
当细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代，使细胞继续生长。
小鼠大脑皮层神经元原代培养是一项复杂的实验技术，在操作过程中需要注意无菌操作、细胞的取材和处理、培养条件的控制等方面的细节。
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小鼠脑细胞提取流式
引言：
流式细胞术是一种常用的实验技术，可以对细胞进行高通量的分析和筛选。
在神经科学研究中，对小鼠脑细胞进行提取和分析是非常重要的一步。
本文将从提取小鼠脑细胞的方法、相关实验步骤以及结果分析等方面进行介绍，以帮助读者更好地理解和应用流式细胞术。
一、方法
1. 小鼠脑组织的收集：
a. 使用无菌手术器械将小鼠的头部固定并取出脑组织。
b. 将脑组织置于含有冷离心缓冲液的离心管中，并尽快将其置于冰上冷却。
2. 细胞溶解：
a. 将脑组织取出后，在无菌条件下将其切碎，加入含有酶解液的离心管中。
b. 将离心管置于37摄氏度的恒温水浴中，进行细胞酶解。
3. 细胞过滤：
a. 使用细胞过滤网将酶解后的细胞悬液过滤。
b. 将过滤后的细胞悬液置于离心管中，进行离心。
4. 细胞洗涤：
a. 将离心后得到的细胞沉淀加入含有冷离心缓冲液的离心管中。
b. 进行洗涤，去除残留的酶解液和细胞碎片。
5. 细胞计数：
a. 使用细胞计数板或自动细胞计数仪对提取的小鼠脑细胞进行计数。
b. 记录细胞数目，以备后续实验使用。
二、实验步骤
1. 样本准备：
a. 准备正常小鼠脑组织样本。
b. 按照上述方法提取小鼠脑细胞。
2. 细胞标记：
a. 准备适当的抗体，用于标记感兴趣的细胞亚群。
b. 将提取的小鼠脑细胞与抗体进行孵育，使其发生特异性结合。
3. 流式细胞仪检测：
a. 将标记后的细胞悬液注入流式细胞仪。
b. 设置合适的仪器参数，进行细胞检测和数据采集。
4. 数据分析：
a. 使用流式细胞仪分析软件对采集到的数据进行分析。
b. 根据细胞标记的结果，对不同细胞亚群进行定量和定性分析。
三、结果分析
通过流式细胞仪的检测和数据分析，我们可以得到关于小鼠脑细胞的丰富信息。
例如，我们可以分析不同细胞亚群在脑组织中的比例，以及它们在不同条件下的变化。
此外，通过进一步的数据分析，我们还可以探究细胞间的相互作用和信号传导机制。
结论：
提取小鼠脑细胞并进行流式细胞分析是神经科学研究中的重要一步。
本文介绍了提取小鼠脑细胞的方法和相关实验步骤，并强调了流式细胞术在研究中的重要性。
通过流式细胞仪的检测和数据分析，我们可以获得有关小鼠脑细胞的丰富信息，这将有助于我们深入了解神经系统的功能和疾病机制。
参考文献：
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