尼氏染色步骤
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小鼠脑冰冻切片后,想做尼氏染色,用焦油紫,具体步骤是什么?焦油紫的溶液该如何配制?
焦油紫染液的配制:
焦油紫/0.1g
蒸馏水/99ml
1%冰醋酸1ml
冰冻切片氯仿中1分钟;
无水酒精中1分钟;
95%酒精、70%酒精各1分钟,蒸馏水洗片刻;
进入焦油紫染液染色30分钟(37度温箱中染色10分钟),蒸馏水洗涤;
95%酒精分色;
常规脱水、透明、封片。
尼氏体呈紫色,细胞核呈淡紫色,胶质细胞呈淡紫色。
研究脊椎动物中枢神经系统的细胞构筑学,最常用的方法是神经细胞染色,也称尼氏染色.虽然碱性染料都
可用于中枢神经系统染色,但常用的有以下几种: 焦油紫,甲苯胺蓝、硫堇.
甲苯胺蓝属于人工合成的醌亚胺类碱性染料,有两个发色团,一个是亚胺基(- N =), 另一个是醌基,同类的有硫堇、亚甲兰,次甲基紫、中性红、焦油紫等;因为是碱性燃料,多作为细胞核染色剂--细胞核中的核酸含有酸性物质对碱性燃料有亲和力,称之为“嗜碱性”。
硫堇染液(工作液)
①干液(硫堇):硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中,溶解后过滤备用;
②醋酸钠缓冲液:醋酸钠·3H2O 9.7g,巴比妥钠14.7g,溶于500mL蒸馏水中;
③0.1 mol/L盐酸;
按①:②:③=40:28:32比例配成混合液,调pH5.7±0.2,即得硫堇工作液。
尼氏体又称虎斑,是神经细胞的一种特殊结构,具有嗜碱性的特点易被碱性染料,如焦油紫,甲苯胺蓝、硫堇
等着染.受染后呈块状(形如虎斑)或粒状.尼氏体分布在神经细胞除轴突之外的细胞质中,核周围颗粒较大 , 近边缘处较小而细长.尼氏体还可因生理状态的改变而变化,如在生理情况下,尼氏体大而数量多,反映出神
经细胞旺盛的功能状态;在神经元受损伤时尼氏体的数量可减少甚至消失 .因此取材时应尽量获取新鲜材
料才能制作出满意的标本.
mickeyzq wrote:
焦油紫染液的配制:
焦油紫/0.1g
蒸馏水/99ml
1%冰醋酸1ml
冰冻切片氯仿中1分钟;
无水酒精中1分钟;
95%酒精、70%酒精各1分钟,蒸馏水洗片刻;
进入焦油紫染液染色30分钟(37度温箱中染色10分钟),蒸馏水洗涤;
95%酒精分色;
常规脱水、透明、封片。
尼氏体呈紫色,细胞核呈淡紫色,胶质细胞呈淡紫色。
你的没有经过复染,对比也可以这么鲜明啊
我用的是1%的甲苯胺蓝,具体步骤是:
常规石蜡切片,二甲苯透明,酒精梯度复水,入1%甲苯胺蓝室温下染3min,自来水冲洗,95%酒精分化,0.5%伊红复染1s,水洗,透明封片,但是结果不好,伊红复染后颜色很深,原来的蓝色被覆盖的很严重,不知道该怎么改进
换焦油紫看看,焦油紫着色比较深.
(二)神经细胞尼氏体染色
正常的神经细胞都含有一定数量的尼氏化,它们主要分布于神经细胞的浆中,形状有大有小,如三角形,有的为椭圆形。这些物质能被大部分的蓝色染料所染色,这些染料如焦油坚牢紫(Cresyl fast violet)亚甲蓝(methylene blue)甲苯胺蓝(toluidine blue)硫董(thionin)等钭其染为蓝色。但是,当神经细胞受伤后,胞质内的尼氏体更可发生变化,严重的可消失。
焦油坚牢紫显示尼氏体
焦油坚牢紫1g
蒸馏水100ml
*作方法:
1、切片脱蜡至水
2、用焦油坚牢紫水溶液浸染20-30分钟
3、水洗
4、用95%酒精分化
5、无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶
结果:神经细胞单位:紫-蓝色
细胞核:紫-蓝色
尼氏体:紫-深蓝色
注意:1、应用酒精分化切片,要迅速,防止过度分化,将切片上的颜色全部脱掉。
神经纤维染色
使用说明:
1. 样品处理
a) 对于石蜡切片:
二甲苯中脱蜡5-10分钟,共三次。注:脱蜡不充分会导致染色不均匀。
无水乙醇5分钟。
90%乙醇2分钟。
70%乙醇2分钟。
蒸馏水2分钟
2. 尼氏(Nissl)染色
对于上述处理好的样品:
尼氏(Nissl)染色液染色染色3-10分钟(可以根据染色结果和要求调整时间,染色时温度提高到37-50℃对于25-50微米等较厚
的切片可以使染色更均匀)。
蒸馏水洗涤2次(每次数秒钟即可)。
95%乙醇约5秒。
此时,如果需要直接观察,可以用70%乙醇洗涤2次。如需脱水、透明后封片按后续步骤进行,70%乙醇洗涤后仍可按照
后续步骤进行脱水、透明和封片处理。
注:如果用于免疫组化等染色后的复染,可以参考上述步骤在其它染色完成后直接进行尼氏(Nissl)染色。
3. 脱水、透明、封片或进行其它染色
a) 脱水、透明、封片:
95%乙醇脱水2分钟。
换用新鲜的95%乙醇再脱水2分钟。
二甲苯透明5分钟。
换用新鲜的二甲苯,再透明5分钟。
用中性树胶或其它封片剂封片。
显微镜下观察,细胞呈现斑驳的蓝紫色染色。
b) 进行其它染色:
如果进行免疫荧光染色,或进行Hoechst等荧光染料的染色,在Nissl染色液染色后:70%乙醇洗涤2次,每次2分钟。
PBS或生理盐水或TBS或TBST等用于免疫染色或荧光染料染色的溶液浸泡5分钟。