第四章-基本分子生物学技术
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现代分子生物学课件-第四章
tRNA上所运载的氨基酸必须靠近 位于核糖体大亚基上的多肽合成位 点，而tRNA上的反密码子必须与小 亚基上的mRNA相配对，所以分子中 两个不同的功能基团是最大限度分 离的。
4. 2. 2 tRNA的功能
转录过程是信息从一种核酸分子 （DNA）转移到另一种结构上极为相 似的核酸分子（RNA）的过程，信息 转移靠的是碱基配对。
C
酸
（Thr，T （Asn，N （Ser，
（Ile，I
）
）
S）
）
异亮氨
苏氨酸
赖氨酸
精氨酸
A
酸
（Thr，T （Lys，K （Arg，
（Ile，I
）
）
R）
）
甲硫氨
苏氨酸
赖氨酸
精氨酸
G
酸
（Thr，T （Lys，K （Arg，
（Met，
）
）
R）
M）
缬氨酸
丙氨酸 天冬氨酸 甘氨酸
U
（Val， （Ala，A （Asn，N （Gly，
亮氨酸
脯氨酸
谷氨酰胺 精氨酸
A
（Leu， （Pro，P （Gln，Q （Arg，
L）
）
）
R）
亮氨酸
脯氨酸
谷氨酰胺 精氨酸
G
（Leu， （Pro，P （Gln，Q （Arg，
L）
）
）
R）
异亮氨
苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸
U
酸
（Thr，T （Asn，N （Ser，
（Ile，I
）
）
S）
）
A
异亮氨
苏氨酸 天冬酰胺 丝氨酸
V）
）
）
G）
分子生物学第四章
第一节 RNA转录的概述
2．真核生物的RNA聚合酶
真核生物的基因组比原核生物大， RNA 聚合酶也更为复杂。其相对分子质量 大都在5×105左右，有8~14个亚基，并含有 Zn2+。利用α-鹅膏蕈碱的抑制作用可将真核 生物RNA聚合酶为分三类。
第一节 RNA转录的概述
第一节 RNA转录的概述
真核生物RNA聚合酶I对α-鹅膏蕈碱不敏 感，负责转录45S rRNA前体，经转录后加工 产生5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA，它 们与多种蛋白质组成的核糖体（核蛋白体）是 蛋白质合成的场所。真核生物的rRNA基因是 一类中度重复的基因，拷贝数都在数十至数百 个，人类rRNA基因约为300个拷贝。
第一节 RNA转录的概述
RNA聚合酶II转录所有mRNA前体和大多数 的核内小RNA（snRNA）。转录是遗传信息表达 的重要环节，真核生物DNA在核内转录生成 hnRNA（编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转 录的。由于它的大小很不一致，故称核内不均一 RNA），然后加工成mRNA，并输送给细胞质的 蛋白质合成体系。hnRNA是各种RNA中寿命最短、 最不稳定的，需经常重新合成。在这个意义上说， RNA聚合酶II可认为是真核生物中最活跃的RNA 聚合酶。
第一节 RNA转录的概述
5．转录终止
当 RNA 链 延 伸 到 转 录 终 止 位 点 时 ， RNA 聚 合 酶 不 再 形 成 新 的 磷 酸 二 酯 键 ， RNA–DNA 杂 合 物 分 离 ， 转 录 泡 瓦 解 ， DNA 恢 复 成 双 链 状 态 ， 而 RNA 聚 合 酶 和 RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转 录的终止。
第一节 RNA转录的概述 RNA聚合酶III转录tRNA、5S rRNA、 U6snRNA和不同的胞质小分子量RNA （scRNA）等小分子转录物。RNA聚合酶 III转录的产物都是相对小分子质量的RNA。 tRNA的大小都在100个核苷酸以下，5S rRNA的大小约为120个核苷酸。snRNA有 多种，由90-300个核苷酸组成，参与RNA 的剪接过程。
分子生物学 第四章 核酸的体外扩增
tatccaacggctaggcattt
5′ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3′ tatccaacggctaggcattt
ataagcccgaaaggttcgtt 3′TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5′
变性（950C，30s）
5′ TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 3′
3′ ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 5′
ataagcccgaaaggttcgtt 退火（450C～550C，30s ～ 1min）
2、酶切分析
3、分子杂交 4、核酸序列分析
1 2 345
4：PCR扩增结果
六、PCR实验中常见问题对策
所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是，不该出结果而出了结果 我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。
（一）假阴性：
应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性。最常见的原因：
延伸（720C，1 ～ 几分钟）
5′ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAA 3′
ATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt
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2、酶切分析
3、分子杂交 4、核酸序列分析
1 2 345
4：PCR扩增结果
六、PCR实验中常见问题对策
所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是，不该出结果而出了结果 我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。
（一）假阴性：
应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性。最常见的原因：
延伸（720C，1 ～ 几分钟）
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分子生物学第四章生物信息的传递下
5’…UUC UUC UUC UUC UUC…3’ 或 5’…UCU UCU UCU UCU UCU…3’ 或 5'…CUU CUU CUU CUU CUU…3‘ 产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.
实验5: 多聚三核苷酸为模板时也可能只合 成2种多肽：
5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’ 或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’ 或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共 培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且 可溶性RNA分子上。现将氨基酸活化后的 产物称为氨基酰-tRNA，并把催化该过程 的酶称为氨基酰合成酶。
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、 UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应 液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的 AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖 体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这 样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。
受体臂（acceptor arm）由配对的杆状结构和 3’端末配对的3-4个碱基所组成（CCA），最 后一个碱基—OH可以被氨酰化。
TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其φ表示拟 尿嘧啶，是tRNA分子不常见的核苷酸。
反密码子臂是根据位于套索中央的三联Fra bibliotek密 码子命名的。
D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil） 命名的。
由于第二种读码方式产生的密码子UAG是 终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生 GUA（Val）或AGU（Ser）。
实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。
实验5: 多聚三核苷酸为模板时也可能只合 成2种多肽：
5’…GUA GUA GUA GUA GUA…3’ 或5’…UAG UAG UAG UAG UAG…3’ 或5’…AGU AGU AGU AGU AGU…3’
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共 培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且 可溶性RNA分子上。现将氨基酸活化后的 产物称为氨基酰-tRNA，并把催化该过程 的酶称为氨基酰合成酶。
3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技 术
以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、 UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应 液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的 AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖 体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这 样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。
受体臂（acceptor arm）由配对的杆状结构和 3’端末配对的3-4个碱基所组成（CCA），最 后一个碱基—OH可以被氨酰化。
TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其φ表示拟 尿嘧啶，是tRNA分子不常见的核苷酸。
反密码子臂是根据位于套索中央的三联Fra bibliotek密 码子命名的。
D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil） 命名的。
由于第二种读码方式产生的密码子UAG是 终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生 GUA（Val）或AGU（Ser）。
实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。
【2024版】分子生物学检验技术教学大纲
可编辑修改精选全文完整版分子生物学检验技术教学大纲第一章原核生物基因组与病毒基因组[目的要求]掌握基因的分子生物学定义;限制性片段长度多态性的概念；质粒的定义与用途；操纵子的结构熟悉病毒基因组与细菌基因组的特点。
原核细胞内核酸含量、种类、功能与组织结构的差异;熟悉转座因子大肠杆菌、HIV与HBV基因组特点[教学时数]3学时[讲授内容]基因的概念基因的生物学定义、基因的分子生物学定义、细胞基因组。
原核生物与真核生物生物种类、原核细胞与真核细胞内核酸含量、种类、功能的差异，操纵子结构。
病毒基因组：重叠基因HBV与HIV等病毒的结构特点细菌基因纽细菌染色体基因组的结构特点;大肠杆菌、质粒。
[复习思考题]名词解释基因、质粒、断裂基因、假基因、限制性片段长度多态性、操纵子问答题1·简述原核细胞基因组特点。
第二章真核生物基因组[目的要求]掌握真核生物基因组的特点;单拷贝序列、中度重复序列与高度重复序列的概念。
熟悉：染色质的结构与要紧成分、核小体是染色质的基本结构单位。
熟悉染色体形态、功能研究中所用术语与新技术简介、朊病毒。
[教学时数]3学时[讲授内容] 真核生物学特点通常特点、C值矛盾、真核生物DNA序列的类型(单拷贝序列、中度重复序列、高度重复序列、人多基因家族、DNA指纹技术(限制性片段长度多态性)。
染色体的要紧成分、染色体的分型、染色体疾病[复习思考题]名词解释单顺反子、外显子、内含子、C值矛盾、单拷贝序列、中度重复序列、高度重复序列问答题真核生物基因组的特点。
第三章癌基因与抑瘤基因[目的要求]掌握癌基因与抑癌基因的概念；癌基因激活的机制熟悉sis家族、src家族、myc与myb家族、P53、RB家族及其表达产物；癌基因与抑癌基因的检测熟悉肿瘤发生的步骤；结肠癌的发病步骤[教学时数]3学时[讲授内容]肿瘤细胞的特征肿瘤病毒与癌基因DNA肿瘤病毒与癌基因;反转录病毒与癌基因。
肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因存在的证据;RB基因，p53基因。
分子生物学：DNA复制
(CsCl gradient centrifuge)
N15
DNA
N14
Semi-Conservation Replication
Source:M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
半半保保留留复复制制-小结
DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为 模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代 细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则 完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
RNA引物的形成
DNA链合成及延长
复制的终止
• RNApol (RNA polymerase)
[Rif S ]
完成对先导链引物的合成
实现DNA复制的转录激活起始
起
• dnaG (primase) [Rif R]
始
完成对后随链引物的合成
较先导链的启动落后一个Okazaki片断
• 完成10±NtRNA引物合成后.
遗传物质的基本属性：基因的自我复制 基因的突变 控制性状的表达
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下， 分别以每 条 单链DNA分子为模板，聚合与 自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合 成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代 DNA分子的过程。 主 要 包 括 引 发 、 延 伸 、 终止三个阶段。
复制发动温度敏感突变型（慢停突变） 42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸
37 ℃, 5 ci / mM H3-T , 6min
37 ℃, 52 ci / mM H3-T , 6min
分子生物学-第四章蛋白质的翻译
教案首页课程名称分子生物学任课教师李市场第四章蛋白质翻译计划学时9教学目的和要求：掌握遗传密码的构成及特点。
遗传密码的破译；密码的简并性与变偶假说；密码子的使用频率；起始密码子与终止密码子；遗传密码的突变；重叠密码。
掌握原核生物和真核生物RNA的翻译过程。
核糖体及RNA的结构；氨基酸的激活与氨酰-tRNA的合成；原核生物的蛋白质的生物合成；GTP在蛋白质合成中的作用；真核生物的蛋白质的生物合成；蛋白质折叠与蛋白质生物合成中多肽链的修饰；蛋白质的易位与分泌。
重点：密码的简并性与变偶假说；密码子的使用频率；起始密码子与终止密码子；重叠密码。
核糖体及RNA的结构；氨基酸的激活与氨酰-tRNA的合成；原核生物的蛋白质的生物合成；GTP在蛋白质合成中的作用；真核生物的蛋白质的生物合成；蛋白质折叠与蛋白质生物合成中多肽链的修饰；蛋白质的易位与分泌难点：核糖体及RNA的结构；氨基酸的激活与氨酰-tRNA的合成；原核生物的蛋白质的生物合成；GTP在蛋白质合成中的作用；真核生物的蛋白质的生物合成；蛋白质折叠与蛋白质生物合成中多肽链的修饰；蛋白质的易位与分泌。
思考题：1、以Prok.为例，说明蛋白质翻译终止的机制。
2、简要说明真核生物蛋白质的不同转运机制。
3、说明Prok.和Euk.体内蛋白质的越膜机制。
4、简要说明Prok.与Euk.的翻译起始过程的差别。
第四章蛋白质翻译（Protein Translation）概述：蛋白质翻译是基因表达的第二步，tRNA在翻译过程中起“译员”的作用，参与翻译的RNA 除tRNA外，还有rRNA 和mRNA；tRNA既是密码子的受体,也是氨基酸的受体，tRNA 接受AA要通过氨酰tRNA合成酶及其自身的paracodon的作用才能实现，tRNA通过其自身的anticodon而识别codon，密码子有自身的特性，三联体前两个重要通用性摇摆性，有一定的使用效率；多种翻译因子组成翻译起始复合物，完成翻译的起始、延伸和终止，并且保证其准确性。
分子生物学第四章TranscriptionElongation课件
• G/C rich region that forms hairpins of varying lengths (7-20bp) in RNA
• G/C rich hairpin are followed by a run of U residues in RNA
Function
• G/C rich → transcription delay
4.3 Transcription Elongation 4.3.1 Transcription delay(转录过程的延宕dang）
l 模板DNA中G/C的存在
delay
l promoter clearance
elongation complex
TFII E, H, ATP, Negative-superhelix needed
● Rho factor be needed for termination
Function RNApol + NusA-protein
RNApol pausing 60’’ more or less
K, Rho
termination
or read-through
Rho-factor (ρ)
l Hexamer 55kd neutral l Contest RNA 3’-end with βfactor
被激活的基因的表达方式，其RNA能顺利延伸
RNApol II stop at 3’-end of gene 并表现为DRBS (5,6-2氯-1-β-D呋喃核糖苯并咪唑) (5,6-dichloro-1-β-D ribofuranosyl benzimidazole)
l 非进行型复合体（Non-processive complex）
• G/C rich hairpin are followed by a run of U residues in RNA
Function
• G/C rich → transcription delay
4.3 Transcription Elongation 4.3.1 Transcription delay(转录过程的延宕dang）
l 模板DNA中G/C的存在
delay
l promoter clearance
elongation complex
TFII E, H, ATP, Negative-superhelix needed
● Rho factor be needed for termination
Function RNApol + NusA-protein
RNApol pausing 60’’ more or less
K, Rho
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or read-through
Rho-factor (ρ)
l Hexamer 55kd neutral l Contest RNA 3’-end with βfactor
被激活的基因的表达方式，其RNA能顺利延伸
RNApol II stop at 3’-end of gene 并表现为DRBS (5,6-2氯-1-β-D呋喃核糖苯并咪唑) (5,6-dichloro-1-β-D ribofuranosyl benzimidazole)
l 非进行型复合体（Non-processive complex）
分子生物学基础PPT第四章
第二节 启动子与转录的起始
3．真核生物启动子对转录的影响 TATA区和其他两个UPE区的作用有所不同（图4-5）。 前者的主要作用是使转录精确地起始，如果除去TATA区或 进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区 突变后明显，但发现所获得的RNA产物起始点不固定。研 究SV40晚期基因启动子发现上游激活区的存在与否，对该 启动子的生物活性有着根本性的影响。若将该基因5′上 游–21－–47核苷酸序列切除，基因完全不表达（图4-6）。
分子生物学基础
遗传信息的转录—从 第四章 遗传信息的转录 从DNA到RNA 到
第一节 RNA转录的概述
一、RNA转录的特点 RNA转录的特点 在DNA指导下RNA的合成称为转录。RNA链的转 录起始于DNA模板的一个特定起点，并在特定的终 点终止，此转录区域称为转录单位。一个转录单 位可以是一个基因或多个基因。基因的转录是一 种有选择性的过程，随着细胞的不同生长发育阶 段和细胞内外条件的改变将转录不同的基因。转 录起始主要由DNA分子上的启动子（promoter）控 制，而控制终止的部位称为终止子（teminator）。 典型的转录单位结构如图4-1。
第四节
转录后加工
图4-12 真核生物mRNA5′–端帽结构
第四节
2．3′–端加尾
转录后加工
真核生物成熟的mRNA 3′–端通常都有100~200个腺苷 酸残基，构成多聚腺苷酸（polyA）的尾巴。通过研究发 现，DNA序列中没有多聚T的序列，由此说明了3′尾巴 polyA是在转录后加上的。研究发现，它还是多聚腺苷酸 化的信号，该序列AAUAAA，因为切除该保守序列，3′–端 则不能进行切除，也不能形成polyA尾巴。3′–端polyA尾 的形成见图4-13。
分子生物学第四章--基因工程常用工具酶
A．以酶切特点来分 同位酶：识别相同序列，切点不同。
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。
粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补— — DNA是分子重组的基础
15
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别 序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端， 称为同识异切。
第四章 基因工程常用工具酶
1
Manipulating Genes
- Transferring Genes
Restriction Ligation Extract DNA
Transformation
Selection
Culturing
2
重组DNA实验中常见的主要工具酶
3
我们的基本目的是：把外源基因与载体 连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以 下两类工具酶：
23
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的
DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。
24
限制性内切酶的剪切方式
25
Yu Zheng, et al. Using shotgun sequence data to find active restriction enzyme genes. Nucleic Acids Res., 2009, 37: e1. Whole genome shotgun sequence analysis has become the standard method for beginning to determine a genome sequence. The preparation of the shotgun sequence clones is, in fact, a biological experiment. It determines which segments of the genome can be cloned into Escherichia coli and which cannot. By analyzing the complete set of sequences from such an experiment, it is possible to identify genes lethal to E. coli.
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印迹技术的应用
研究DNA分子中某一种基因的位置
确定两种核酸分子间的序列相似性
检测某些专一序列在待检样品中存在与否
是基因芯片技术的基础
第 二 节
PCR技术的原理与应用
Polymerase Chain Reaction
PCR 技术（Polymerase
chain reaction）
• PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反
影响DNA复性的因素
1.核酸分子的浓度：适宜的探针浓度。 2.核酸分子的长度：核酸探针长度控制在 50～300bp 3.温度：适宜的复性温度是较Tm值低25℃。 4.离子强度：离子强度过低，不利于复性。 5.核酸分子的复杂性。
（三）探针技术
探针 (probe)
一小段用同位素、生物素或荧光 染料等标记其末端或全链的已知序列 的多聚核苷酸。与固定在NC膜上的核 苷酸结合，判断是否有同源的核酸分 子存在。
常用分子生物学技术的原理 及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle a nd Application
目录
• 第一节 分子杂交与印迹技术 • 第二节 PCR技术的原理与应用 •生物大分子相互作用研究技术 • 第七节 遗传修饰动物模型的建立及应用（了解） • 第八节 疾病相关基因的克隆与鉴定（了解）
1、核酸探针的种类
• 根据探针标记方法不同：分为放射性探针和非 放射性探针两大类； • 根据探针的核酸性质不同：又可分为 DNA 探针， RNA探针，cDNA探针及寡核苷酸探针等； • DNA探针还有单链和双链之分。
（1）DNA探针
指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。 多为某一基因的全部或部分序列，或cDNA探针）： ①不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制D NA酶活性。 ②标记方法较成熟，有多种方法可供选择。
应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引 物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体 外复制DNA的过程。是基于天然DNA复制的原理而设计 的一种在体外由引物介导的DNA酶促合成反应，又称
基因扩增技术。
一、基本工作原理
Template DNA
5 5
5
Primer 1 5 Primer 2
• （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
• 也叫做Western杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异的蛋白 质， • 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array)
（二)、DNA的复性
变性
复性
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
（二）、DNA的复性
DNA复性的定义
在适当条件下，变性DNA的两条互补链可
恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
退火(annealing)
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火。
（二）、DNA的复性
第
一
节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Tech
nology
一、核酸分子杂交概念
变性 复性
DNA-DNA 杂交双链分子
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下，按 碱基互补原则形成双链，称为核酸分子杂交。
一、分子杂交与印迹技术的原理
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
•1.引物长度一般在15-30碱基之间。
引物长度常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其 延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
•2.引物GC含量在45%-55%间，Tm值最好近72℃.GC含量过高或过
低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 •3.上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解
（2）cDNA探针
cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。 通过逆转录产生cDNA，克隆于适当的载体而使cD NA大量扩增。 不含有内含子序列。 尤其适用于基因表达的检测。
（3）RNA探针
RNA探针一般都是单链； 与靶序列的杂交反应效率极高，比DNA-DNA杂 交高几个数量级。
测等。 • 重组质粒和噬菌体的分析。 • 在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析中具有重要的价 值。
• （二）RNA印迹技术 (Northern blotting)
• 也叫做Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种 将RNA从琼脂糖凝胶中转移到硝酸纤维素膜上的方法
• 用于RNA的定性定量分析。
在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一 溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链 分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之 间形成杂化双链(heteroduplex) 。
杂交的双方分别称探针和待测核酸。 杂交可分为： DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之间的杂交。 杂交具有高度特异性和灵敏性。
(n 为循环次数)
34× 109
PCR技术的基本原理
• ---- 体外模拟DNA的体内复制
• ---- 严格遵循碱基互补配对原则
DNA体内复制与PCR的对比
模板 体内复制 DNA DNA
聚合酶
引物
解旋解链 解旋酶
DNA Pol Ⅲ 引物酶 Taq 人工合成DNA
解链酶
PCR 热变性
PCR体系基本组成成分
（2）、标记方法
• 体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子 上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子 上。 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶 促法将标记的核苷酸掺入到探针上。
二、几种常见杂交技术
用于杂交的3种固相支持体
①硝酸纤维素膜：优点是杂交信号本底低，缺点 是DNA分子结合不牢固。 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝 酸纤维素膜强；缺点是杂交信号本底高。 ③化学活化膜：优点是DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点是结合能 力较上述两种膜低。
二、印迹技术的类别及应用ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
（3） 杂交
预杂交：用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结 合位点。 杂交：由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，
所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与 膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子 即可。
（4）检测
检测的方法依标记探针的方法而异 放射性同位素标记的探针：需要用放射自显影来检测 其在膜上的位置； 生物素等非同位素方法标记的探针：需要用相应的免 疫组织化学的方法进行检测。
（3）RNA探针
可用于检测DNA和mRNA； 用 RNA 探针进行 RNA 结构分析比用 DNA 探针效果 好； 要准确测定正向和反向转录水平就不能用双链 DNA探针，只能用RNA探针或单链DNA探针。 存在易于降解和标记方法复杂等缺点。
（4）寡核酸探针
采用化学方法合成的寡核苷酸片段。 常用的寡核苷酸探针18～50bp。 优点：
6. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠 成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结 构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物 自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的 互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有
链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5-10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2 （A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最
好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的 第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增 的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大 的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下， 也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引 发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之 间，所以3′端最好选择T。
DNA芯片技术 (DNA chip)
印迹技术的基本过程
（1）制备样品
从待检测组织样品提取DNA或RNA DNA或RNA经酶切消化 酶切片段的电泳分离 凝胶变性处理后转膜
（2）制备探针
基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA
互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因， 也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身， 也可以是由之转录而来的RNA或合成的寡核苷 酸。
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
• 引物（primer）
• 是一小段单链DNA或RNA，是DNA复制的起始点，在核酸 合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点