实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化.
高效TG1电转感受态 化转感受态的制备与主要影响因素
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
2020-04-12
• 相关概念 • 菌生长特点 • 实验原理 • 方法特点 • 实验步骤 • 影响因素 • 电转杯重复利用方法
一、相关概念
感受态细胞
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法) 的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进 入的一种细胞状态。
电脉冲强度对电转化效率的影响
• 电场强度的影响机制 较为复杂 ，目前还 不是 十分清楚。 Kimoto的研究表明：电脉冲前 ，DNA和细胞是随机分布 的 ；电脉冲早 期，DNA 和细胞向阳极运动 ；电脉冲的 后期 ，DNA插入细胞的外膜或者进一步进 入细胞质问 隙 ；随后在 37℃孵 育期 问 DNA渗透通过 内膜进入细胞浆 。高场强下 ，可瞬间击穿细胞壁和质膜 ，形成能通过外 源物质 的跨膜 孔道；而低场强的作用下 ，需累计电荷达 到一定的强度，才可作用于质膜 ，形成孔道 ，这样易使 已形成孔道的细胞因内含物外流而引起死亡 。所以选择 合适的脉冲强度对外源 DNA的导人非常关键 。
质粒DNA不同量时对E.coli转化效率影响
质粒 DNA的结构 、大小 、含量对电转化效率的 影响也很大。选用 pUC19作为质 粒材料，就其含量对电转化效率的影响进行了探讨 ：在 40ul菌液加 入 了 4种不 同含量 的质 粒 DNA，分 别 为 0.25 ng、0.5 ng、1.0 ng、1.5 ng，结 果 表 明 用 量 为1.0 ng质粒 DNA时，电转化效率最高 ，而且电转化 效 率与 外 源 DNA 的含 量 在 一 定 范 围 内成 正 比 ；但当加入 的外源DNA的量过多或体积过大时，则 会 使转化效率下降。即 DNA溶液 的体 积不应超过感受态细胞体积 的5 %，1 ng 的质粒 DNA 即可使 50ul的感受态细胞达到饱和 。
质粒的转化实验报告
一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。
3. 学会筛选和鉴定转化子。
二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。
通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。
本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。
（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。
（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。
（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。
（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。
（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。
（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。
2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。
（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。
五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。
2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。
3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。
大肠杆菌感受态
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
本实验室一般用TSS 法制备感受态。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
细胞生长状态和密度
细菌感受态的制备和转化姓名：郑祥学号：29一．【实验目的】通过本实验，了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义；掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞，并筛选转化体的方法。
二、【实验原理】本实验以Tap 10菌株为受体细胞，在低温（0－5℃）状态下，用CaCL2 处理受体菌。
钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而处于易于接受外源性DNA的感受态。
在感受态细胞悬液中加入质粒DNA，使质粒DNA进入细胞内。
然后在42℃热休克90秒（或两分钟），使大肠杆菌恢复到原来的状态，然后在不含有抗生素的培养基中培养一段时间，使质粒DNA得以复制，并使抗生素的抗性基因得以表达。
（PUC质粒携带有抗氨苄青霉素和抗四环素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性，常用Amp r 表示）将经过转化后的全部受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养筛选。
只有转化体才能存活，而未接受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
三．【实验器材与试剂】器材：恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌操作超净台，电热恒温水浴，智能离心机，加样器。
Tap 10受体菌,氨苄青霉素。
PUC质粒DNA，实验室分离提纯所得样品。
试剂：液体LB培养基；固体LB培养基；25mg/ml Amp-；含抗生素的LB平板培养基；0.1mol/lCaCL2溶液。
四．【实验步骤】1、Tap 10菌种接种于5ml LB（Amp-）37℃,摇育过夜。
2、将所得的菌液取50ul接种于5mlLB（Amp-）中（1：100接种），37℃，摇育3个小时。
（时间不宜太长，否则造成选择的细菌多，CaCL2的作用就相对小了）3、取1ml菌液于EP管中，冰浴30分钟。
（以保持细胞状态）4、4℃,2500rmp，离心5分钟。
5、弃上清，沉淀加入1ml冰预冷的0.1M CaCL2轻柔地重悬沉淀，冰浴15 分钟，4℃,2500rmp,离心5分钟。
质粒转入感受态细菌的原理
质粒转入感受态细菌的原理
质粒转入感受态细菌的原理是通过一种称为转化的机制进行的。
转化是细菌之间通过吸收外源DNA并将其融合到自身基因组中的过程。
感受态细菌是对外源DNA（如质粒）具有接受能力的细菌。
转化包括以下几个步骤：
1. 准备感受态细菌：通常使用复苏液处理细菌，复苏液中包含一些醣化剂或离子（如Ca2+）等物质，可以使细胞膜变得更容易渗透。
2. 吸收外源DNA：将质粒与感受态细菌一起暴露在低温、高电压或添加特定溶液条件下，使质粒能够进入细菌细胞。
3. DNA融合：在感受态细菌内，外源DNA通过DNA酶等酶的作用，与细菌染色体发生重组。
这样，外源DNA的片段可以被整合进细菌基因组中。
通过上述步骤，质粒可以被转入感受态细菌中。
感受态细菌在接受外源DNA后，它可能会表达质粒中的基因，从而产生质粒编码的特定蛋白质。
这种转化的机制被广泛应用于基因工程和遗传学研究中。
直接给出感受：通过质粒转化的过程，感受态细菌可以获得质粒中所携带的额外基因信息，这些额外基因信息可以被细菌利用，产生新的蛋白质，赋予细菌新的
功能或性状。
感受态制备和电转化,多种感受态
一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4℃将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。
4、加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。
5、重复4 .6、再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。
7、用600ul 0.5M蔗糖垂悬。
8、分装菌液，每管100ul。
9、液氮冷冻10s，存于-80℃。
二、大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。
3、冰浴10min。
4、4℃5000rpm离心5min，去上清。
5、加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
6、2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
7、分装每管100ul，存于-80℃。
三、超级感受态（一）溶液1、TB （1L）终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),≥99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。
农杆菌的培养与感受态制备
农杆菌的培养与感受态制备农杆菌感受态的制备与转化实验室根癌农杆菌感受态的制备：1.取保存于-70°LBA4404菌株在YEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或平板活化，挑取单菌落接种于5mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或YEP(含50mg/l利福平)液体培养基中，28°C、200rpm培养24-28h。
2.取2ml菌液接种至50mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或利福平)中，28°C、200rpm培养至OD600≈0.5左右。
3.菌液冰浴30min后，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。
4.弃上清，用10ml0.15mol/lNacl重悬菌体，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。
5.弃上清，用2ml20mmol/lCacl2重悬菌体，加入1ml60%无菌甘油(使其终浓度为20%），每管100μl分装，液氮冻存，-70°C保存。
重组质粒电转入农杆菌中：1.从大肠杆菌中提取重组质粒，将5μl重组质粒加入农杆菌感受态中，至于冰上30min。
2.将混合物加入电击杯中，选择“Agr”模式（电压2.2kv，时间4.9m）电击，加入800μlYEB培养基，28°C、200rpm振荡培养3-5h，8000rpm离心30S（实际操作中不离心，吸取菌液50、100、150ul等多做几个梯度，用无菌水稀释至180ul），弃上清，涂布于YEB平板（含农杆菌和质粒所带抗生素，如Kan和利福平）。
3.28°C恒温箱中倒置培养48h（24h以上）。
4.从农杆菌中提取质粒，双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；扩目的片段并测序验证。
5.转化烟草等实验材料。
YEB培养基：1.0.5%（w/v）蔗糖，0.1%（w/v）细菌用酵母提取物，1%（w/v）细菌用胰蛋白胨，0.05%（w/v）MgSO4·7H2O，调节pH7.0，121°C灭菌15min。
质粒转化流程
质粒转化流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在进行质粒转化之前，需要做好充分的准备工作。
农杆菌感受态细胞的制备与转化
实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化
01
实验目的：学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理。
02
实验要求：掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用。
03
技术应用：高等植物（双子叶植物或单子叶植物）转 基因鉴定基因功能 ，包括过表达（诱导型或组成型），RNAi等。
04
试剂： YEB液体培养基（液体和固体），Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； CaCl2(预冷)；NaCl；50%无菌甘油 。
02
实验材料： 农杆菌GV3101菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300
01
农杆菌简介： 第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。
01
菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
02
实验原理：
双元表达载体系统主要包括两个部分：
2.双元表达载体系统
双元表达载体
双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构
1
2
3
4
5
农杆菌感受态细胞的制备流程
将10l构建好的质粒DNA加入200 l 农杆菌感受态细胞中，混匀；
01
冰浴30min，液氮迅速冷冻3-5min，37℃水浴无抗）YEB培养基，28℃振荡培养4h（选作）；
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如NPTII基因以及Lac Z基因等。 双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
分子生物学实验教材(精)
分子生物学实验教材：参考书：《分子克隆实验指南》（第三版）黄培堂等译科学出版社实验一﹑大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一.[目的要求]通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二.[实验原理]细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
细菌处于0︒C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42︒C 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。
三.[教学内容]1.感受态细胞的制备基础知识及方法简介2.CaCl2法制备DH5α或JM109感受态细胞，计算转化效率3.pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞四.[实验材料和用品]E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA，eppendorf管。
超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等五.[实验步骤]一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
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实验一 细菌感受态的制备和质粒的转化
实验目的
通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作，以及如何
提高转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个
很关键的实验手段。
实验原理
转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生
改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。
感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用CaCl2处理细菌，
改变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性
培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形
成菌落。
本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5，通过氨苄青霉素抗性筛选转
化子。
图1-1 质粒pUC118/pUC119图谱
实验材料和试剂
（一）实验材料
大肠杆菌DH-5
质粒pUC118（ampicillin，AmpR
（二）培养基和试剂
1. LB液体培养基(%)
胰蛋白胨（Tryptone） 0.5
酵母浸出粉（Yeast extract） 1.0
NaCl 0.5
pH 7.2～7.4（用2mol/L NaOH调节）
（分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2管。0.07Mpa
高压灭菌30分钟）。
2. LB固体培养基
LB液体培养基加入1.6%的琼脂粉即可。
（分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa
高压灭菌30分钟）。
3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin,，Amp），配制成100mg/ml备用。
4. 0.1mol/L CaCl2溶液
(配制方法：称取1.1克无水CaCl2，溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，
装于250ml三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4℃保存。）
（三）器材
接种针 10ml移液管
50ml塑料离心管 5ml移液管
90mm培养皿 1ml移液管
1.5ml Eppendorf管 200l吸头
三角爬 15×150试管
冰块 试管铝帽
牛皮纸 纱布盖
线绳 硫酸纸
（四）仪器
净化工作台 摇床机
恒温水浴锅 离心机
培养箱
实验步骤
以下均需无菌操作
（一）感受态细胞的制备
1. 大肠杆菌DH-5 冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养
基平板上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）。
2. 从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3ml LB液体培养基的试管
中，37℃振荡培养过夜（约16小时）。
3. 取0.3ml菌液接种于20ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡
培养2～3小时，待OD600值达到0.3～0.4时，取下三角瓶，立即置冰浴10～
15 分钟。
4. 将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4℃ 3000r/min离心10分钟，
弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。
5. 加入20ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散
均匀，置冰浴中30分钟。
6. 4℃ 3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。
7. 再加入2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作
要轻）。在4℃冰箱中放置12～24小时，即可应用于DNA转化。
（二）细菌的转化
1. 取大肠杆菌DH-5新鲜感受态细胞100l于1.5ml Eppendorf管中，加入
50～100ng质粒pUC118 DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。
2. 42℃热休克120秒，不要摇动Eppendorf管。
3. 加入LB液体培养基900l，37℃保温60分钟。
4. 取100l转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp）100 g/ml的LB固体平板
上，37℃倒置培养16～24小时。
5．观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。
【提示】
实验操作中注意的问题
1. DNA与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时
低，转化效率极差。
2. Eppendorf管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染。
3. 42℃热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。
4. 涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变
化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
【思考题】
1．制备感受态细胞的关键是什么？
2．如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。
3．如何提高转化效率？