结核感染T细胞斑点试验技术进展及现状分析

结核感染T细胞斑点试验技术进展及现状分析结核病是公共卫生中的一种常见传染性疾病，其在传染性疾病致死中所占的比重一直比较高，也是公共卫生需要长期关注的疾病。

结核病在临床上主要表现为咯血、咳痰、肺部空洞等症状，具有不易控制、易复发、具有发病率高、耐药率高等特点，严重影响患者的生活质量，也对人口生命健康危害极大，故早期进行准确鉴别诊断，指导临床治疗，对改善患者预后具有重要意义[1-2]。

痰培养结核分枝杆菌是临床诊断结核病的“金标准”，但存在检测时间较长、结核细菌生长缓慢、对于技术人员要求较高等不足，不利于早期诊断，难以满足临床需要。

结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)属γ干扰素释放试验类型，是诊断肺结核的重要途径，其采取特异性结核分枝杆菌抗原，当前在临床上得到广泛使用[3]。

现就该项目技术进展及现状报道如下：1结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）原理和特点1.1 γ干扰素释放试验（IGRA）简介目前用于临床γ干扰素释放试验（IGRA）主要有两种，一种是QFT-GIT试验，该试验采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结核特异性抗原刺激致敏T细胞释放γ干扰素浓度。

另外一种就是结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB），该试验的方法是采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测外周血结核特异性抗原刺激分泌IFN-γ的Ｔ淋巴细胞数量[4]。

IGRA已有20多个国家发布了应用指南[5],2014年中华医学会结核病学分会和《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会组织相关专家发布了《γ干扰素释放试验在中国应用的建议》，对IGRA在活动性结核病及潜伏性结核（LTBI）诊断的应用建议。

2017年卫健委发布卫生标准WS288-2017《肺结核诊断》中将γ干扰素释放试验（IGRA）阳性作为结核病诊断实验室检查项目。

卫健委于2020年4月2日发布的《中国结核病预防控制工作技术规范》中明确结核潜伏感染检测方法、人群及预防性治疗方案。

2020年7月7日中国防痨协会发布《新生入学体检结核病检查规范》及《学校肺结核患者密切接触者筛查及处置规范》两项关于结核检测的团体检测标准，γ干扰素释放试验（IGRA）均纳入诊断检测项目。

1.2结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）检测原理及技术流程1.2.1检测原理从全血中分离出单个核细胞与结核杆菌特异性抗原一起孵育，当外周血中存在针对结核杆菌的效应T细胞时，结核杆菌特异性抗原将刺激这些效应T细胞分泌IFN-γ。

分泌的IFN-γ被预包在反应膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其他不必要的物质通过洗涤被去除。

加入碱性磷酸酶标记的检测抗体与被捕获的IFN-γ结合，显色液在反应部位被酶分解并最终形成斑点。

每一个斑点代表一个分泌IFN-γ的效应T细胞。

通过对斑点进行计数可以判断体内是否存在对结核杆菌反应的效应T细胞，从而对结核病进行辅助诊断。

1.2.2结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）局限①某免疫功能受损的患者，可能导致假阴性。

②当感染堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、海分枝杆菌(M.marinum)、苏尔加分枝杆菌(M.szulgai)时，检测结果有可能出现“阳性”。

如怀疑上述细菌感染时需要结合临床信息进一步诊断。

1.3在临床结核病诊断中的展望目前研究显示，T-SPOT.TB尚不能完全鉴别诊断潜伏性结核感染与活动性结核感染，而且试剂盒成本较高。

有文献报道[6]，丙氨酸脱氢酶（ALaDH）抗原刺激Ｔ细胞产生的白介素-２的ELISPOT试验可用于区分活动性结核和潜伏性结核感染，且诊断结核病的灵敏度、特异度均高于T-SPOT.TB试验。

另随着国产试剂推广应用，试剂的成本也有望进一步降低，有利于结核病诊断推广应用。

2结核病实验室检查方法及其特点现阶段实验室诊断结核病的方法主要有涂片找抗酸染色、结核分枝杆菌培养、影像学、结核菌素皮试（PPD/TST）及分子生物学等，这些方法都有各自的优缺点。

1）涂片查抗酸杆菌：该方法特点易于操作，价格低廉，特异性高，但是敏感度度较低，秦庆等[7]报道，其敏感度为11.46%，但特异性可达98%以上。

2）结核杆培养：作为目前诊断结核病的金标准，但是培养周期长，培养阳性率偏低等局限。

3）影像学检查：存在检出率不高及影像特异，容易导致误诊和漏诊的劣势。

4)结核菌素皮试(PPD/TST):特异性较低，有报道[8]在小儿结核感染诊断中该方法灵敏度为为66.7%，其特异性仅为40%。

5）分子生物学的方法：该方法的灵敏度和特异性均较高，文献[9]报告使用PCR技术检测TB-DNA的敏感性和特异性分别可达92.11%和82.61%。

但是分子生物检测技术对实验室环境和技术人员要求较高，样本容易污染，导致假阳性结果等。

3结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）的临床应用3.1 T-SPOT.TB在结核潜伏感染诊断中的应用人体最初感染结核分枝杆菌后，大部分感染者机体有免疫反应，但是无临床症状，表现为潜伏结核感染，研究[10]显示有5%～15%的潜伏感染者在2至5年内发展为活动性结核病。

在免疫力低下或长期使用糖皮质激素等免疫抑制的人群中潜伏感染发展为活动性结核病的风险更高。

毕艳等[11]研究显示，T-SPOT.TB在结核潜伏感染者的阳性率（36.4%）和确诊率（94.9%）要高于TST阳性率（28.4%）和确诊率（69.6%），因此T-SPOT.TB检测在结核潜伏感染诊疗中具有重要的临床应用价值。

3.2T-SPOT.TB在肺结核和肺外结核感染诊断中的应用中华人民共和国卫生行业标准WS 288-2017《肺结核诊断》中将IGRA阳性作为肺结核诊断实验室免疫学检查项目。

FENG等[12]研究显示：活动性肺结核T-SPOT.TB的敏感性（95.6%）和特异性（69.2%）明显高于TST。

有报道T-SPOT.TB不仅对肺结核的诊断有较高的临床诊断价值，还可以判读肺结核的抗结核治疗的疗效。

蘭景双等[13]研究结核患者治疗30、60、90和120天的T-SPOT.TB的阳性率分别为83.5%、67.7%、35.4%和10.2%，说明T-SPOT.TB可作为结核治疗疗效的跟踪。

肺外结核是指发生在肺部以外的其他器官的结核病，常见有结核性淋巴结炎、骨关节结核、结核性心包炎、神经系统结核以及泌尿系统结核等。

肺外结核通常没有特定的临床表现，给临床早期诊断带来了困难。

王香梅等[14]研究显示，T-SPOT.TB诊断肺外结核的灵敏度为87.5％，特异度为90.6％，阳性预测价值为84.8％，阴性预测值为92.3％，均明显高于TST，且T-SPOT.TB的ROC曲线下面积（0.886）高于TST（0.612），显示T-SPOT.TB对肺外结核的诊断有很高的价值。

4小结结核病多是由结核分枝杆菌感染所致的慢性传染性感染疾病，在临床上的表现比较复杂，特别是部分患者因病情隐匿或表现不典型，易被漏诊、误诊[15]。

同时由于各种因素的影响，结核病在部分地区的发病率一直比较高，且危害较高，而及早确诊疾病对改善患者预后具有重要价值。

目前，虽可综合患者微生物学、临床表现、病理学及影像学检查等方式诊断结核病，但是都存在一定的不足[16-18]，结核感染Ｔ细胞斑点试验不受机体免疫状态影响，其选用的结核特异性抗原（ESAT-6/CFP-10/Rv3615c）不受环境分枝杆菌和卡介苗的影响，故优于传统的抗结核分枝杆菌抗体和结核菌素试验。

结核感染Ｔ细胞斑点试验在肺结核、肺外结核、结核潜伏感染的诊断和筛查中都有很高的临床应用价值。

尽管T-SPOT.TB还不能完全鉴别诊断结核潜伏感染与活动性结核感染，且试剂盒成本较高，但随着相关技术的不断发展，仍可寄望其在结核病的诊断方面发挥更大作用。

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